专利名称：人bmp－4启动子以及用其探测骨相关物质的方法
背景技术：
(1)发明领域本发明涉及含人骨形成蛋白(此后称为BMP-4)启动子的5’上游区DNA。而且本发明涉及探测正向或负向调节人BMP-4表达的低分子量化合物的方法，该方法使用导入含人BMP-4启动子的5’上游区DNA和整合入适当报道基因的重组表达载体的大量动物或酵母菌细胞，并使用报道基因活性作为指示物化合物。
(2)相关技术的描述目前，已有关于属于TGF(转化生长因子)-β超家族的骨形成因子BMP的骨形成活性作了报告(Science 150，893-897，1965；Science242，1528-1534，1988)。已知的BMP种类有BMP-1至BMP-14。其中已知BMP-2至BMP-14的BMP具有骨形成活性。认为BMP-2至BMP-14的BMP对各种骨机能障碍和骨疾病的治疗和预防性治疗是有效的，然而其天然存在量很少。因此为了提供这些治疗使用的大量BMP-2至BMP-14，需要生产重组蛋白。与低分子量化合物相比，所述重组蛋白的生产通常非常昂贵。另一方面，由于其蛋白质特性，重组蛋白作为药物在物理性质和给药方面存在许多限制。考虑到这些情况，如果有与所述BMP蛋白具有同等活性的小分子量有机化合物，它将成为非常有前景的药物。用本发明所提供的探测方法获得的物质具有诱导人骨形成蛋白BMP-4表达的活性，而且也具有与很有用的人BMP-4同样的活性。相反，有报告(New Engl.J.Med.，第335卷，第555-561页，1996)提出人BMP-4引起骨和软骨增生。在这种情况下，抑制人BMP-4的表达可防止骨质增生。本发明能够检测人BMP-4表达的抑制，并提供探测防止这种骨质增生的物质的方法。
对于这样的一种探测方法，至今仅有的报告是一个使用鼠BMP-2启动子实例(WO 97/15308)；没有使用人BMP-4启动子的实例。已克隆鼠BMP-4启动子区(Biochem.Biophys.Acta，第1218卷，第221-224页，1994)，但没有阐明详细的人BMP-4启动子序列数据。本发明首次公开人BMP-4启动子序列。人和鼠BMP-4(J.Biol.Chem.，第270卷，第28364-28373页，1995)5’上游区DNA完整序列的同源性为52.5％。本发明所提供的探测方法中的材料均来源于人，以便用所述探测获得的物质能够在临床实际应用。希望通过将重组表达载体中的两种启动子(启动子1和启动子2)分别或同时转染入宿主细胞获得能够更准确地调节人BMP-4表达的物质。
图2是含人BMP-4基因5’上游区启动子1的重组表达载体(pMSS116)。该启动子1区(序列表SEQ ID NO.1中所示的第1-3361号碱基，在
图1中显示从5’末端至Xho I)插入到pGL3-基本型(basic)的Nhe I和Xho I限制性酶位点。
图3是含人BMP-4基因5’上游区的启动子2的重组表达载体(pMSS118)。启动子2区(2.3kb)(序列表SEQ ID NO.1中所示的第3361-5645号碱基，在图1中显示外显子2的Xho I至BglII)插入到pGL3-基本型的Xho I和Bgl II限制性酶位点。
图4是含有人BMP-4基因5’上游区启动子1和启动子2的重组表达载体(pMSS119)。启动子1和所述启动子2区(序列表SEQ IDNO.1中所示的第1-5645号碱基，在图1中显示从5’末端至外显子2的Bgl II)插入到pGL3-基本型的Nhe I和Bgl II限制性酶位点。
图5是测量人BMP-4启动子活性(瞬时表达)的结果。
本发明涉及通过进行以下步骤制备序列表SEQ ID NO.1所示DNA的方法(1)用EcoRI限制性酶消化人胎盘基因组DNA，(2)通过琼脂糖凝胶电泳分离，(3)将用EcoR I消化的分离DNA片段克隆到用相同的酶处理的λ噬菌体载体λDASH II中，(4)将所述载体包装入噬菌体中，(5)用噬菌体感染大肠杆菌建立基因组DNA文库，(6)通过PCR筛选，和(7)亚克隆至质粒载体中。
这里所用的质粒载体是不受限制的，且可使用商品化质粒。pUC18载体可是优选实例。
本发明涉及一种重组表达载体，其特征为序列表SEQ ID NO.1中所示全长或部分DNA整合入报道基因中。详细地讲，重组表达载体构建是将序列表SEQ ID NO.1所示的人BMP-4基因5’上游适当区置于报道基因之前。报道基因如荧光素酶或β-半乳糖苷酶基因指示原始产物的表达状态。对于重组表达载体的原始载体不受特别限制，允许用商业化的质粒载体。本发明用pGL3-基本型作为最佳实例。使用pGL3-基本型获得的pMSS116(8.2kb)、pMSS118(7.1kb)和pMSS119(10.5kb)是含人BMP-4启动子和荧光素酶报道基因的重组表达载体。本发明将其指定为重组表达载体。必要的是用脂质体将所述重组表达载体导入哺乳动物细胞、优选人成骨细胞样细胞如SaOS-2细胞。用抗性标记选择稳定转染重组表达载体的动物细胞。
本发明涉及探测骨相关物质的方法，该方法的特征为使用序列表SEQ ID NO.1所示全长或部分DNA整合至报道基因为特点的重组表达载体。本发明涉及探测其中骨相关物质是骨形成诱导物质的骨相关物质的方法，或探测其中骨相关物质为骨形成抑制物质的骨相关物质的方法。诱导或抑制人BMP-4表达的低分子量化合物可通过以下方法获得分离调节所述基因表达的启动子，将其与适当报道基因连接以及将所述基因结构物导入适当哺乳动物细胞以制成探测系统。在该探测系统中调节人BMP-4表达的物质作用于所述启动子以增加或降低所述报道基因的表达水平。因此简单且容易地测量所述报道活性使对所述目标物质的探测成为可能。
用所述载体转染的动物细胞可用于通过高产率筛选(Nature，第384卷(增补)，第14-16页，1996)筛选化合物文库以及从天然物质中探测活性物质的方法。通过用一种物质处理所述细胞适当时间，然后测量报道活性，从而探查增加或降低活性的物质。这样获得的物质可通过调节信号转导系统直接作用于转录因子或间接作用于所述人BMP-4启动子而调节所述表达。因此这些化合物作为骨软骨病、癌性骨转移或骨质增生的治疗药物是有效的。
本发明获得的物质具有骨或软骨形成活性，且在整形外科领域(骨折，骨关节炎如关节骨关节炎和髋关节骨关节炎，关节骨炎，软骨损伤如半月板损伤，创伤和肿瘤切除引起的骨以及软骨缺损的再生，骨再建如脊骨接合和椎管扩大，以及先天性软骨和骨疾病如骨发育障碍和软骨发育不全)或牙科领域(骨再建如腭裂、下颌骨再建和牙槽残嵴构建)和骨质疏松的治疗和预防性治疗的有效药物。而且本发明的物质可用于美容外科中的骨移植。这些治疗性治疗对在兽医外科领域中的治疗是有效的。另一方面，本发明可提供抑制骨或软骨形成的物质。在这种情况下，该物质可用作骨或软骨增生的预防和治疗的药物。
序列表独立文本<210>1<223>包括外显子1至外显子3区的人BMP-45’上游基因序列。<210>2<223>克隆5’上游人BMP-4基因序列的对应于外显子1区的正向PCR引物。<210>3<210>克隆5’上游人BMP-4基因序列的对应于外显子1区的反向PCR引物。
序列表<110>Hoechst Marion Roussel Ltd<120>人BMP-4启动子以及用其探测骨相关物质的方法。<130>英文JH98K004 PCT SEQUENCES<140><141><150>10-120173<151>1998-04-30<160>3<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>6774<212>DNA<213>人<220><221>misc-特征<222>(1)..(6774)<223>包括外显子1至外显子3区的人BMP-4 5’上游基因序列。<400>1gaattccttc cgtagcttca ccagacacct aattggccaa gaaggtttga agacctgatg 60tggttcttaa ttggggatgg ggaattaagg gctactgtat ctataggatt atcttttcac 120ttgcatagac ctatttggtg tgttcagggc atagtgatac tataattgcc atatttaaca 180gtttataaag ttcaagccca gcatattctt tgcctgttta atgatgtctt ggtatcagcc 240ttttaatggt acttatcagc atagaaaatg gaaacaaaat aacttttaaa acagtagctc 300tcaagcttta gtgtgctcag aatgaccaga gaaccttgtg aaatatacag atttctgggt 360ccagatctgg ggcaggacca ggaagtctgc atttcatctg cacccccacc ctactctgag 420gcttatagtc ctgagaacat gctttgaaaa aggctgtccc aagggctcgc agacaggcta 480ttgaccagct actctttctt gatgttctcc aggaaaaccc aacaaaggaa tgcctttcat 540tgagtagtag cagcatagga gcaatagttg ctcctgaatt atgggtgggt ttccctcttc 600atcaatgtgc tttaagggta cagtttcatt tggtctatct 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权利要求
1.一种DNA，其核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.1所示的第1-6774号碱基序列，它编码人骨形成蛋白-4启动子区或其片段。
2.一种制备序列表SEQ ID NO.1所示DNA的方法，该方法包括以下步骤(1)用EcoRI限制性酶消化人胎盘基因组DNA，(2)用琼脂糖凝胶电泳进行分离，(3)将用EcoRI消化的分离的DNA片段克隆到用同样的酶处理的λ噬菌体载体λDASH II中，(4)将所述载体包装入所述噬菌体中，(5)用所述噬菌体感染大肠杆菌建立基因组DNA文库，(6)用PCR进行筛选，以及(7)亚克隆至质粒载体中。
3.一种重组表达载体，其特征为将序列表的SEQ ID NO.1所示DNA的全长或部分整合至报道基因中。
4.探测骨相关物质的方法，其特征为使用按照权利要求3的重组表达载体。
5.按照权利要求4的探测骨相关物质的方法，其中所述骨相关物质是骨形成诱导物质。
6.按照权利要求4的探测骨相关物质的方法，其中骨相关物质是骨形成抑制物质。
全文摘要
本发明提供根据报道活性、采用含人BMP－4启动子的5’上游区基因和导入与适当报道基因连接的重组表达载体的动物细胞,探测正向或负向调节人BMP－4表达的低分子量化合物的方法。用本方法获得的低分子量化合物及其衍生物通过表达人BMP－4,对骨和软骨具有形态发生活性和抑制活性,且可用作软骨和骨疾病的预防或治疗药物。
文档编号C12N5/00GK1307587SQ99807956
公开日2001年8月8日 申请日期1999年4月22日 优先权日1998年4月30日
发明者S·卡维, T·苏吉乌拉 申请人:赫斯特·马里恩·鲁索公司