] (2)本发明提供的半定量竞争PCR检测基因拷贝数的方法，不需要构建同源或异 源的竞争子；也不需要专门的实时定量PCR仪来检测实验结果，因此，该方法更加快速、简 便、低成本；
[0039] (3)本发明提供的半定量竞争PCR检测基因拷贝数的方法对待测DNA样品的质量 和含量要求更宽松，可以采用快捷的碱裂解法提取DNA，而不用进行DNA纯化；
[0040] (4)本发明提供的半定量竞争PCR检测基因拷贝数的方法尤其适用于检测基因敲 除鼠的基因型。
【附图说明】
[0041] 图1为本发明实施例提供的半定量竞争PCR检测基因拷贝数的原理图；
[0042]图2为本发明实施例1提供的样品的琼脂糖凝胶电泳图；
[0043] 图3为本发明实施例1提供的潮霉素基因PCR产物的强度与内参Bcl-3片段PCR 产物强度的比值分析图。
【具体实施方式】
[0044] 以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为 本发明的保护范围。
[0045] 本发明实施例所使用的小鼠、试剂均为市售商品。
[0046] 实施例1
[0047] 利用本发明所述的方法对Bcl-3基因敲除鼠进行检测，通过检测Bcl-3基因敲除 鼠的潮霉素基因的相对拷贝数来鉴定该基因敲除鼠的基因型。
[0048] 注：该基因敲除鼠为Bcl-3基因野生型鼠通过同源重组的方法，使潮霉素基因 (hygromycin筛选基因，209bp)置换部分Bcl-3基因（10kb)，从而使该鼠不能表达Bcl-3 蛋白；其中，野生型的基因型为Bcl-3 (+/+)，即不含潮霉素基；纯合子的基因型为Bcl-3 (-/_)，即含两个拷贝数的潮霉素基因；杂合子的基因型为Bcl-3 (+/-)，即含一个拷贝数的 潮霉素基因。
[0049] 为充分说明本发明的有益效果，本发明实施例提供了如图1所示的半定量竞争 PCR检测基因拷贝数的原理图，结合该图，本发明实施例提供了如下实验步骤：
[0050] 1、取3只Bcl-3基因敲除鼠，1只杂合子Bcl-3 (+/-)，2只纯合子Bcl-3 (_/_)。 采用碱裂解法从小鼠尾巴中提取基因组DNA。
[0051] 2、本实施例选择的内参是已知的在该基因敲除鼠中未被敲除的双拷贝的Bcl-3 的一段170bp的片段(注：内参基因可以是任何在该基因敲除鼠中未被敲除的DNA片段)。
[0052] 3、针对所要检测特异性的潮霉素基因以及内参Bcl-3基因，分别设计引物。
[0053] 潮霉素基因引物：
[0054]上游引物为5'-CGGAAGTGCTTGACAITGG-3'，即SEQ ID N0:1，
[0055]下游引物为5' -GTAITGACCGATTCCTTGCG-3'；即SEQ ID N0:2，
[0056] 潮霉素基因引物扩增产物的长度为209bp。
[0057] 内参Bcl-3基因引物：
[0058]上游引物为5' -AACCTCAGGCTCCGTGGACC-3'，即SEQ ID N0:3，
[0059]下游引物为5' -CGG TGITCACGGCCACGTGC-3'，即SEQ ID N0:4，
[0060] 内参Bcl-3基因引物扩增产物的长度为170bp。
[0061] 上述引物的设计原则：保证上下游引物的TM差距不超过:TC。要求产物的长度在 100~500bp之间，相邻产物长度的差至少为50bp。所有的引物均经过Blast和01 igo mask 软件的分析，从而减少非特异扩增和引物二聚体。
[0062]4、对每一个基因敲除鼠基因组DNA样品的检测重复3次，PCR反应体系为：
【主权项】
1. 一种半定量竞争PCR检测基因拷贝数的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 提供待测样品 所述待测样品中含有待测基因和内对照基因，所述内对照基因在所述待测样品所属种 的基因组中具有相同的拷贝数； (2) 提供多重竞争性PCR引物 所述多重竞争性PCR引物由分别针对待测基因和内对照基因的设计的至少一对待测 基因引物和至少一对内对照基因引物组成， 所述多重竞争性PCR引物所产生的不同扩增产物片段间的长度差异能被琼脂糖凝胶 电泳分辨； (3) 多重竞争性PCR反应 配置多重竞争性PCR反应体系，进行多重竞争性PCR反应； (4) 结果分析 对多重竞争性PCR反应所产生的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，观察或计算待测 基因条带强度与内对照基因条带强度的比值，得到待测基因的相对拷贝数。
2. 如权利要求1所述的半定量竞争PCR检测基因拷贝数的方法，其特征在于，所述步骤 (2)中，所述多重竞争性PCR引物的长度范围为18~23bp，所述多重竞争性PCR引物之间 的TM值相差不超过3 °C。
3. 如权利要求1所述的半定量竞争PCR检测基因拷贝数的方法，其特征在于，所述步骤 (2)中，所述多重竞争性PCR引物由1~3对待测基因引物和1对内对照基因引物组成。
4. 如权利要求1所述的半定量竞争PCR检测基因拷贝数的方法，其特征在于，所述步骤 (2) 中，所述多重PCR引物对应的扩增产物的长度范围为100~500bp，不同扩增产物片段 的长度差异为50~150bp。
5. 如权利要求1所述的半定量竞争PCR检测基因拷贝数的方法，其特征在于，所述步骤 (3) 中，所述多重竞争性PCR反应体系中，所述待测基因引物和内对照基因引物之间的摩尔 比为1 :1~3 :1。
6. 如权利要求1所述的半定量竞争PCR检测基因拷贝数的方法，其特征在于，所述步骤 (1) 中，所述待测样品为Bcl-3基因敲除鼠的基因组DNA样品。
7. 如权利要求6所述的半定量竞争PCR检测基因拷贝数的方法，其特征在于，所述 Bcl-3基因敲除鼠的基因组DNA样品的制备方法是采用碱裂解法提取基因组DNA。
8. 如权利要求1所述的半定量竞争PCR检测基因拷贝数的方法，其特征在于，所述步骤 (2) 中，所述待测基因为Bcl-3基因敲除鼠的潮霉素基因，所述Bcl-3基因敲除鼠潮霉素基 因的上游引物序列和下游引物序列分别如SEQIDNO: 1和SEQIDNO:2所示。
9. 如权利要求1所述的半定量竞争PCR检测基因拷贝数的方法，其特征在于，所述步骤 (2)中，所述内对照基因Bcl-3基因敲除鼠的Bcl-3基因，所述Bcl-3基因敲除鼠Bcl-3基 因的上游引物序列和下游引物序列分别如SEQIDN0:3和SEQIDN0:4所示。
10. -种如权利要求1所述的半定量竞争PCR检测基因拷贝数的方法在半定量竞争 PCR检测基因拷贝数试剂盒中的应用。
【专利摘要】本发明提供的半定量竞争PCR检测基因拷贝数的方法包括：（1）提供待测样品；（2）提供多重竞争性PCR引物；（3）多重竞争性PCR反应；（4）观察或计算待测基因的琼脂糖凝胶电泳条带强度与内对照基因条带强度的比值，得到待测基因的相对拷贝数。该方法不需要构建同源或异源的竞争子，也不需要专门的实时定量PCR仪来检测实验结果，因此，该方法快速、简便、成本低；此外，该方法对待测DNA样品的质量和含量要求更宽松，可以采用快捷的碱裂解法提取DNA，而不用进行DNA纯化；本发明还提供了该半定量竞争PCR检测基因拷贝数的方法的应用，该方法尤其适用于检测基因敲除鼠的基因型。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104694619
【申请号】CN201310659642
【发明人】万晓春, 阮庆国, 范婷婷, 王绍文
【申请人】深圳先进技术研究院
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2013年12月6日