一种检测蛹虫草菌丝体中腺苷和虫草素的含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测蛹虫草菌丝体中腺苷和虫草素的含量的方法，特别涉及一种 利用高效液相色谱同时测定超声处理过的蛹虫草湿菌丝体中腺苷和虫草素的含量的方法。
【背景技术】
[0002] 蛹虫草（Cordyceps militaries)又名北虫草，在我国分布广泛，蛹虫草作为药食 两用真菌已被选入食品新资源目录。近年来，人们已经从蛹虫草子实体及菌丝中分离得到 多种生物活性物质，主要有腺苷、虫草素、虫草多糖、D-甘露醇、S0D酶、留醇类等成分，具有 抗炎、抗氧化，抗肿瘤、抗癌、提高免疫力等多种生理功能。研究显示蛹虫草中的腺苷、虫草 素等有效成分的含量与野生冬虫夏草相当，具有广阔的应用前景。
[0003]目前，蛹虫草人工培育技术已较为成熟，根据培养方式的不同可分为固体栽培和 液体发酵两种，与固体栽培相比，液体发酵具有周期短、工艺简单、不易污染、菌丝体产量大 等优点。作为蛹虫草质量评价的重要指标，腺苷和虫草素成为蛹虫草菌丝体发酵培养的重 要指示性物质，因此，快速、有效的检测方法对于指导蛹虫草液体发酵工艺研究具有重要的 意义。
[0004]目前，腺苷和虫草素含量是利用高效液相色谱、毛细管电泳等方法来检测的，而蛹 虫草湿菌丝中腺苷和虫草素含量的测定普遍是采用检测干菌丝中两种成分含量来实现的， 在湿菌丝干燥过程存在耗时长、耗能多、成分易于变化等缺点。如牛双等人对蛹虫草菌丝 体中腺苷测定（NIU Shuang，GA0 Xiang, AN Jin_shuang，GU0 Jing-jing，TENG Li_rong，LU Jia-hui. Optimization of the Water Extraction Technique of Cordyceps militaris Mycelium Adenosine via Response Surface Methodology[J]. Li Shizhen Medicine and Medical Research. 2009, 20 (2) : 323-324.)中采用真空冷冻干燥作为样品前处理，只测定 了腺苷一种组分，不能同时检测腺苷、虫草素，且此方法耗时耗能。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种检测蛹虫草菌丝体中腺苷和虫草素的含量的方法。
[0006] 本发明所提供的检测蛹虫草菌丝体中腺苷和/或虫草素的含量的方法，具体可包 括如下步骤：
[0007] (1)将蛹虫草菌丝体反复冻融后进行水浴超声，以超声后滤液作为待测样品；
[0008] (2)将步骤（1)获得的待测样品，以及腺苷和/或虫草素标准品的溶液，在相同条 件下分别进行高效液相色谱检测，根据检测结果计算得到所述待测样品中的腺苷和/或虫 草素的含量。
[0009] 在所述方法的步骤（1)中，所述反复冻融的次数可为1-3次(如2-3次）；1次所述 冻融为：液氮中冷冻20-30min，转至50-60°C解冻10_15min。进一步，对于虫草素，所述反 复冻融的次数以2-3次更佳。
[0010] 在所述方法的步骤（1)中，所述水浴超声的条件为35-45KHZ(如40KHZ)持续超声， 温度可为30-50°C (如40-50°C)，时间可为2-4h。进一步，对于腺苷，所述温度以40-50°C 更佳。
[0011] 在所述方法的步骤（2)中，所述高效液相色谱的条件如下：色谱柱可为C18色谱 柱；流动相为甲醇和水按照体积比为（10-20) : (80-90)(如15:85)的比例混合而成的溶液； 洗脱方式为单一流动相洗脱，洗脱时间为15min。
[0012] 在本发明中，所述色谱柱为 Klomasail C18 (150mmX4. 6mm5 u m particle size) 色谱柱。更加具体的，为瑞典AKZO NOBEL公司产品，其产品目录号为EH04713。
[0013] 进一步，步骤（2)中，所述高效液相色谱的流速可为lmL/min，进样量可为20iiL， 柱温可为25 °C。
[0014] 在所述方法的步骤（1)中，所述蛹虫草菌丝体具体是按照如下方法获得：将蛹虫 草发酵液1600-1800g (如1700g)离心15-20min，弃上清，获得所述蛹虫草菌丝体。
[0015] 所述蛹虫草发酵液是将所述蛹虫草菌丝体的种子液(菌体浓度为lg/l〇〇mL，菌丝 质量/菌液体积)接种于发酵培养基，培养后获得的。所述发酵培养基的溶剂为水，溶质及其 浓度如下：蔗糖70g/L、大豆蛋白胨30g/L、酵母浸提物30g/L、豆饼粉15g/L、K2HP04，3H202g/ L、MgS04?7H201g/L ;pH为7。所述培养为25°C 200r/min振荡培养7天。所述接种的比例 为：所述蛹虫草菌丝体的种子液为所述发酵培养基的体积的5%。
[0016] 所述蛹虫草菌丝体的种子液是按照如下方法获得的：将蛹虫草的菌种接种于种子 培养基，培养后获得的。所述种子培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下：葡萄糖l〇g/L、酵 母粉10g/L、K2HP04 ? 3H200.5g/L、KH2P040.5g/L、MgS04? 7H200.5g/L;pH 为 7。所述培养为 25°C 200r/min振荡培养3天。
[0017] 在所述方法的步骤（1)中，在将所述蛹虫草菌丝体进行所述反复冻融后，所述水浴 超声前，还包括向所述蛹虫草菌丝体中加水的步骤，加水量为每8-10mL所述蛹虫草发酵液 中获得的所述蛹虫草菌丝体中加水40mL。
[0018] 在所述方法的步骤（2)中，所述超声后滤液按照如下方法获得：将超声后液体离 心(如1700g离心20min)后取上清用0. 45 ii m过滤膜过滤，所得滤液即为所述超声后滤液。[0019] 在所述方法的步骤（2)中，所述腺苷和/或虫草素标准品的溶液为腺苷和/或虫 草素标准品的水溶液。
[0020] 进一步，所述腺苷和/或虫草素标准品具体可为如下任一种：
[0021] (1)腺苷标准品；(所述方法为检测蛹虫草菌丝体中腺苷的含量的方法时）
[0022] (2)虫草素标准品；(所述方法为检测蛹虫草菌丝体中虫草素的含量的方法时）
[0023] (3)腺苷标准品和虫草素标准品的混合物；(所述方法为同时检测蛹虫草菌丝体中 腺苷和虫草素的含量的方法时）
[0024] 更加具体的，在本发明中，所述腺苷标准品为Sigma公司产品，其产品目录号为 A925 ;所述虫草素标准品为Sigma公司产品，其产品目录号为C33941。
[0025] 在所述方法的步骤（2)中，所述"将步骤（1)获得的待测样品，以及腺苷和/或虫 草素标准品的溶液，在相同条件下分别进行高效液相色谱检测，根据检测结果计算得到所 述待测样品中的腺苷和/或虫草素的含量"，具体可为：
[0026] A1)将系列浓度的所述腺苷和/或虫草素标准品的溶液按照如上所述条件进行高 效液相色谱检测，以所述腺苷标准品的浓度为横坐标，以所述腺苷标准品的峰面积为纵坐 标，绘制腺苷标准曲线；将步骤（1)获得的待测样品按照如上所述条件进行高效液相色谱 检测，将与所述腺苷标准品相同保留时间的色谱峰的峰面积带入所述腺苷标准曲线，得到 所述待测样品中的腺苷的含量；和/或
[0027] A2)将系列浓度的所述腺苷和/或虫草素标准品的溶液按照如上所述条件进行高 效液相色谱检测，以所述虫草素标准品的浓度为横坐标，以所述虫草素标准品的峰面积为 纵坐标，绘制虫草素标准曲线；将步骤（1)获得的待测样品按照如上所述条件进行高效液 相色谱检测，将与所述虫草素标准品相同保留时间的色谱峰的峰面积带入所述虫草素标准 曲线，得到所述待测样品中的虫草素的含量。
[0028] 在如上A1)和A2)中，绘制所述腺苷标准曲线和所述虫草素标准曲线时，横纵坐标 可以互换。
[0029] 在如上A1)和A2)中，所述系列浓度的所述腺苷和/或虫草素标准品的溶液具体 为：溶剂为水，溶质为等质量的所述腺苷标准品和所述虫草素标准品，所述腺苷标准品和所 述虫草素标准品的系列浓度均为9 y g/mL、18 y g/mL、27 y g/mL、36 y g/mL、45 y g/mL。
[0030] 在本发明中，所述蛹虫草具体为蛹虫草菌株CM-jd。
[0031] 本发明所提供的检测蛹虫草菌丝体中腺苷和虫草素的含量的方法，与现有方法相 比不需要对液体发酵培养的湿菌丝进行干燥处理，可同时测定菌丝体中腺苷和虫草素含 量，测得腺苷的线性范围为2-50 y g/mL，虫草素的线性范围为3-50 y g/mL，腺苷和虫草素 的检出限分别为1. 1 U g/mL、2. g/mL，两种成分的回收率分别为94%-100%、99%_103%。该 方法具有省时、节能、分析速度快等优点。
【附图说明】
[0032] 图1为腺苷标准品和虫草素标准品混合物的HPLC色谱图。其中，峰1为腺苷标准 品(保留时间为5. 314min)，峰2为