一种用于蛹虫草液体深层发酵的培养基及其使用方法
【专利摘要】一种用于蛹虫草液体深层发酵的培养基，由以下原料组成：蔗糖10-30g、玉米浆1-5g、醪液蛋白渣4-100g、蛋白胨0-4g、牛肉膏0-4g、MgSO4?7H2O 0.5-2.0g、KH2PO4 0.2-1.0g、维生素B1 1-5mg、水1000mL。本发明培养基中添加维生素C发酵的废弃醪液蛋白渣，该醪液蛋白渣中含有巨大芽孢杆菌和生酮基古龙酸菌的菌体蛋白，与蚕蛹蛋白近似，因此可以全部或部分替代培养基中牛肉膏和蛋白胨，既可使蛹虫草菌丝体发酵产率获得提高，又同时把维生素C发酵工业的废弃醪液蛋白渣予以资源化利用，有效降低了生产成本。本发明还提供一种用于蛹虫草液体深层发酵的培养基的使用方法。
【专利说明】一种用于蛹虫草液体深层发酵的培养基及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及食用菌培养领域，尤其涉及一种用于蛹虫草液体深层发酵的培养基及其使用方法。
【背景技术】
[0002]北冬虫夏草学名叫蛹虫草(Cbr办ce/75.它与青海冬虫夏草同属于真菌门子囊菌亚门虫草属，因此，被业内专家称为冬虫夏草的同属“兄弟”。蛹虫草生活史的有性阶段包括菌丝体生长和子实体生长。鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫幼虫或蛹感染到拟青霉的孢子，当环境条件适宜时，孢子便萌发形成菌丝体，菌丝体吸取虫(蛹)体内的营养作为其生长发育的物质和能源。当菌丝把虫(蛹)体内的各种组织和器官分解完毕后，菌丝体发育由营养生长转为生殖生长，菌丝体逐渐扭结分化形成菌核并穿出体外成为橘黄色或橘红色的顶部略膨大的、呈棒状的子座(子实体)，子座多从虫体的头部、胸部、近尾部等处伸出。
[0003]野生的北冬虫夏草与传统的冬虫夏草相似，在自然界中极为稀少。多数研宄认为，北冬虫夏草在药效成分上与天然冬虫夏草相近，其药用和食用价值可与天然的冬虫夏草媲美。工厂化生产的北冬虫夏草素含量高于天然冬虫夏草，其蛋白质、氨基酸、维生素和微量元素的含量均达到甚至超过了天然冬虫夏草的水平。在已报道的350余种虫草菌中，蛹虫草是少有的能形成大量虫草素的虫草菌。因为与冬虫夏草亲缘关系最近、有效成分相当甚至更高，且可以人工栽培，北冬虫夏草成为天然冬虫夏草的理想代用品。
[0004]蛹虫草的培养主要有两种方式，即固体培养和液体发酵。长期以来人们一直致力于液体深层发酵培养虫草菌丝体作为冬虫夏草的替代品。传统的虫草液体深层发酵的培养基主要有以下几种:①马铃薯200g (煮汁)，蔗糖20g，磷酸二氢钾lg，硫酸镁0.5g，蛋白胨5g，水100ml !②葡萄糖30g，水解乳蛋白5g，牛奶100ml，牛肉汤500ml，酵母膏lg，磷酸二氢钾lg，硫酸镁0.2g，复合维生素BI片，水100ml 葡萄糖20g，蛋白胨4g，牛肉膏4g，磷酸二氢钾lg，硫酸镁0.5g，维生素BI 2mg，水100ml。
[0005]野生蛹虫草是在含有大量昆虫蛋白的蚕蛹体内生长的，但因为成本高、操作难等原因，在人工培养条件下难以采用蚕蛹或其组分做培养基，从而导致蛹虫草栽培产量及有效成分均大幅下降等问题。因此，亟需开发一种用于蛹虫草液体深层发酵的新型培养基，以满足实际的需求。
[0006]另一方面，维生素C的工业生产采用生物发酵工艺，排放出大量废弃发酵醪液蛋白渣。该废弃蛋白渣呈灰褐色、略粘稠状，COD值7-10万mg/L，是维生素C第二步发酵的发酵液在后续提取步骤中经过超滤膜截留后剩余的10万道尔顿以上的大分子物质，主要成分为巨大芽孢杆菌和生酮基古龙酸菌的菌体、菌体碎片、剩余培养基如玉米浆、尿素等，其中干物质含量为10-15%，而粗蛋白含量占干物质的60-65%，故又称醪液蛋白渣。在维生素C生物发酵后期存在菌体破裂、菌体内容物溢出并溶于发酵液中的现象。
[0007]本发明提供一种用于蛹虫草液体深层发酵的培养基及其使用方法，在蛹虫草液体深层发酵培养基中添加维生素C发酵废弃蛋白渣，该醪液蛋白渣中含有巨大芽孢杆菌和生酮基古龙酸菌的菌体蛋白，与蚕蛹蛋白近似，因此可以全部或部分替代培养基中牛肉膏和蛋白胨，既可使蛹虫草菌丝体发酵产率获得提高，又同时把维生素C发酵工业的废弃醪液蛋白渣予以资源化利用，有效降低了生产成本。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种用于蛹虫草液体深层发酵的培养基及其使用方法，该培养基可有效提高蛹虫草菌丝体的发酵产率，且有效降低生产成本。
[0009]为实现本发明的上述目的，本发明提供一种用于蛹虫草液体深层发酵的培养基，由以下原料组成:鹿糖10-30g、玉米楽l_5g、醪液蛋白澄4-100g、蛋白胨0-4g、牛肉膏0-4g、MgSO4.7Η20 0.5-2.0g, KH2PO4 0.2-1.0g、维生素 BI l_5mg、水 1000mL。
[0010]本发明还提供一种用于蛹虫草液体深层发酵的培养基的使用方法，具体步骤如下。
[0011]步骤1、培养基及其灭菌和接种:通过蒸气发生器对空罐、通气管道、空气过滤器及出料口进行灭菌，压力0.1-0.15MPa，温度121_124°C，持续灭菌40min。
[0012]发酵罐发酵培养和摇瓶种子培养所用液体培养基:蔗糖10_30g、玉米浆l_5g、醪液蛋白渣 4-100g、蛋白胨 0-4g、牛肉膏 0-4g、MgSO4*7H20 0.5-2.0g、KH2PO4 0.2-1.0g、维生素 BI l_5mg、水 100mLo
[0013]培养基配制后装入发酵罐内，装入量为发酵罐容量的60-70%，然后在压力0.12-0.15MPa，温度121-126°C条件下灭菌40min，启动冷水循环系统进行降温，待温度降到25°C时接种液体蛹虫草菌种(该液体菌种由蛹虫草(Cbr办ce/75.mi Ii tar is)发酵而来)。
[0014]步骤2、培养条件控制。
[0015]发酵罐压:在液体发酵培养时，如果发酵罐内外压力相同，外界杂菌会进入发酵罐内造成菌液感染；而发酵罐的压力太大，则影响溶氧和菌丝生长发育。本发明培养过程中发酵罐压控制在0.01-0.02MPa。
[0016]泡沫的控制:在液体发酵培养中期，菌体进入旺盛生长期，呼吸代谢旺盛，会出现泡沫，为防止CO2中毒和杂菌感染，就要进行消泡，其方法是可在灭菌前向培养液内加少量消泡剂，用量为0.05-0.1%。也可采用葵花油或食用油，以降低表面张力，减少泡沫形成。
[0017]通气量控制:在其它因素确定的情况下，通气量与溶氧系数成正比，不同的生长时期对溶氧要求不同。本发明液体发酵培养过程中，发酵罐内的通风量控制在1:0.2-1:0.4
3 / 3 /.m /m /min0
[0018]搅拌速度:在液体发酵培养时，不断搅拌可使液体培养基中各种营养成分混合均匀而不致沉淀，同时促进气体与液体接触和交换；搅拌速度太高或太低都不利于菌丝生长发育。本发明培养时搅拌速度控制在110-120rpm/min。
[0019]pH值控制:发酵过程采用两阶段控制pH策略，即开始时控制pH值恒定在6.2，接种蛹虫草液体菌种后50h再将pH值恒定控制为5.6。
[0020]发酵温度和周期:发酵温度控制在18-24°C，每级发酵培养周期在96-120h范围内，当每级发酵培养周期高于120h时，菌丝生长缓慢或停止生长，培养液变澄清。
[0021]步骤3、菌丝检测:为确保发酵质量，掌握菌丝发酵培养情况，必须进行中间测定。打开出料口，将菌液接入无菌容器内后轻轻旋转样品，静置5分钟，如果菌丝体悬浮力好，则表明生活力强；若极易沉淀，说明菌丝老化、活力降低。然后将菌液制片，在显微镜下检查菌丝纯度，检测后若无杂菌时，可继续培养；当分生孢子几乎全脱落母体孢子梗，孢子梗数量增加不明显时，说明菌丝培养结束，可进行菌丝收集。
[0022]步骤4、菌丝收集:液体发酵培养结束后，打开出料口，取出培养液，用离心法收集菌丝，然后将收集的菌丝放在通风干燥处阴干。
[0023]与现有技术相比本发明的有益效果。
[0024]本发明提供一种用于蛹虫草液体深层发酵的培养基及其使用方法，在培养基中添加维生素C发酵的废弃醪液蛋白渣，该醪液蛋白渣中含有巨大芽孢杆菌和生酮基古龙酸菌的菌体蛋白，与蚕蛹蛋白近似，因此可以全部或部分替代培养基中牛肉膏和蛋白胨，既可使蛹虫草菌丝体发酵产率获得提高，又同时把维生素C发酵工业的废弃醪液蛋白渣予以资源化利用，有效降低了生产成本。
【具体实施方式】
[0025]下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。
[0026]实施例1。
[0027]本发明提供一种用于蛹虫草液体深层发酵的培养基，由以下原料组成:蔗糖20g、玉米浆2g、醪液蛋白渣8g、蛋白胨2g、牛肉膏1.5g、MgSO4-7H20 0.8g、KH2PO4 0.5g、维生素BI 2mg、水 100mLo
[0028]本发明提供一种用于蛹虫草液体深层发酵的培养基的使用方法，具体工艺参数如下。
[0029]发酵罐内培养基装量为65%，然后在温度124°C条件下灭菌40min，待培养基温度降到25°C时接种液体蛹虫草菌种。
[0030]液体发酵培养过程中，发酵罐内温度控制在22 °C，发酵罐内的通风量控制在1: 0.3m3/m3/min,搅拌速度控制在110rpm/min，发酵前期pH值控制在6.2，接种蛹虫草液体菌种后50h再将pH值恒定控制为5.6，发酵96h时进行菌丝收集。
[0031]采用本发明培养基发酵的菌丝体得率达0.40%，比传统培养基所获菌丝体得率(0.31%)提高了 29%，本发明培养基菌丝体的虫草素含量为0.165%，比传统培养基所获菌丝体的虫草素含量(0.^5%)提高了 24.2%。注:菌丝得率(％) =菌丝体干重(kg) +放罐后发酵液体积X 100%。
[0032]实施例2。
[0033]本发明提供一种用于蛹虫草液体深层发酵的培养基，由以下原料组成:蔗糖20g、玉米浆2g、醪液蛋白渣20g、牛肉膏0.5g、MgS04*7H20 0.8g、KH2PO4 0.5g、维生素BI 2mg、水100mL0
[0034]本发明提供一种用于蛹虫草液体深层发酵的培养基的使用方法，具体工艺参数如下。
[0035]发酵罐内培养基装量为60%，然后在温度122°C条件下灭菌40min，待培养基温度降到25°C时接种液体蛹虫草菌种。
[0036]液体发酵培养过程中，发酵罐内温度控制在22 °C，发酵罐内的通风量控制在1: 0.3m3/m3/min,搅拌速度控制在110rpm/min，发酵前期pH值控制在6.2，接种蛹虫草液体菌种后50h再将pH值恒定控制为5.6，发酵96h时进行菌丝收集。
[0037]采用本发明培养基发酵的菌丝体得率达0.37%，比传统培养基所获菌丝体得率(0.31%)提高了 19.3%，本发明培养基菌丝体的虫草素含量为0.147%，比传统培养基所获菌丝体的虫草素含量(0.125%)提高了 17.6%。
【权利要求】
1.一种用于蛹虫草液体深层发酵的培养基，由以下原料组成:蔗糖10-30g、玉米浆 l_5g、醪液蛋白渣 4-100g、蛋白胨 0-4g、牛肉膏 0-4g、MgSO4.7Η20 0.5-2.0g、KH2PO40.2-1.0g、维生素 BI l-5mg、水 1000。
2.如权利要求1所述的用于蛹虫草液体深层发酵的培养基，其特征在于，由以下原料组成:蔗糖20g、玉米浆2g、醪液蛋白渣8g、蛋白胨2g、牛肉膏1.5g、MgS04*7H20 0.8g,KH2PO40.5g、维生素 BI 2mg、水 800mL。
3.如权利要求2所述的用于蛹虫草液体深层发酵的培养基，其特征在于，由以下原料组成:蔗糖20g、玉米浆2g、醪液蛋白渣20g、牛肉膏0.5g、MgS04.7H20 0.8g,KH2PO4 0.5g、维生素 BI 2mg、水 100mLo
4.如权利要求1所述的用于蛹虫草液体深层发酵的培养基的使用方法，其特征在于，具体步骤为: 步骤1、培养基及其灭菌和接种:通过蒸气发生器对空罐、通气管道、空气过滤器及出料口进行灭菌，压力0.1-0.15MPa，温度121_124°C，持续灭菌40min ； 发酵罐发酵培养和摇瓶种子培养所用液体培养基为:蔗糖10_30g、玉米浆l_5g、醪液蛋白渣 4-100g、蛋白胨 0-4g、牛肉膏 0-4g、MgSO4*7H20 0.5-2.0g、KH2PO4 0.2-1.0g、维生素BI l_5mg、水10OOmT,； 所述培养基配制后装入发酵罐内，装入量为发酵罐容量的60-70%，然后在压力.0.12-0.15MPa，温度121-126°C条件下灭菌40min，启动冷水循环系统进行降温，待温度降到25°C时接种液体蛹虫草菌种； 步骤2、培养条件控制: 发酵罐压:培养过程中发酵罐压控制在0.01-0.02MPa ; 泡沫的控制:在灭菌前向培养液内加消泡剂、葵花油、食用油中的一种，以减少泡沫形成，所述消泡剂用量为0.05-0.1% ； 通气量控制:发酵罐内的通风量控制在1:0.2-1:0.4 m3/m3/min ； 搅拌速度:培养时搅拌速度控制在110-120rpm/min ； pH值控制:发酵过程采用两阶段控制pH策略，即开始时控制pH值恒定在6.2，接种蛹虫草液体菌种后50h再将pH值恒定控制为5.6 ； 发酵温度和周期:发酵温度控制在18-24?，每级发酵培养周期在96-120h ; 步骤3、菌丝检测； 步骤4、菌丝收集。
【文档编号】C12R1/645GK104498367SQ201410700016
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】徐慧, 佟庆辉, 杨伟超, 孔双, 王楠, 周浩 申请人:沈阳源康生物技术发展有限公司