从蛹虫草固体培养基残基中提取虫草素和虫草多糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及虫草素和虫草多糖提取工艺，具体地说，涉及一种从蛹虫草固体培养基残基中提取虫草素和虫草多糖的方法。
【背景技术】
[0002]蛹虫草(Cordyceps militaris)又名北冬虫夏草、北虫草等，是我国名贵的药用真菌，蛹虫草子实体是蛹虫草主要的食用、药用部分。
[0003]目前固体培养方式已被广泛用于蛹虫草的培养，蛹虫草固体培养基中富含菌丝，但因没有成熟的工艺对其中的有效成分进行提取分离，目前在培养结束后固体培养基都被作为废物弃掉，不仅造成资源的浪费，对环境也造成一定的影响。
[0004]随着生活节奏的加快和生活水平的提高，人们越来越注重自身保健，虫草多糖具有抗肿瘤、降糖、抗肝纤维化及提高免疫功能，虫草素具有抗菌，消炎、抗氧化、调节人体内分泌和增强人体免疫功能等显著作用，虫草素、虫草多糖等蛹虫草成分提取物在医药市场的前景良好。同时随着人工培养蛹虫草产业规模的不断扩大，，对于如何将培养过程中的副产物变废为宝，提高投入产出比越来越受到关注。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种从蛹虫草固体培养基残基中提取虫草素和虫草多糖的方法。
[0006]为了实现本发明目的，本发明提供的从蛹虫草固体培养基残基中提取虫草素和虫草多糖的方法，包括对蛹虫草固体培养基残基进行干燥、粉碎、水提、微滤、浓缩、冻干及定性定量检测等步骤。
[0007]其中，干燥步骤具体为:将蛹虫草固体培养基残基置于热风循环干燥箱内于(80 °C条件下烘干2h。
[0008]粉碎步骤具体为:干燥后培养基残基用万能粉碎机进行粉碎，过120目筛。
[0009]水提步骤具体为:向粉碎后的培养基残基中加水进行热回流提取，料水比按g:mL计为1:15。于65 °C提取2次，2h/次，每次提取料水比按g:mL计为1:15，合并2次提取液。
[0010]水提最佳条件通过设计正交实验，分别设置提取温度(分别于65°C、75°C、85°C )、提取次数(分别提取1次、2次、3次)，单次提取时间(lh/次、2h/次、3h/次)等因素。获得的虫草多糖与虫草素最佳提取条件为:于65°C提取2次，2h/次，每次提取料水比按g:mL计为1:15。
[0011]微滤步骤具体为:收集水提后的提取液，降至室温后6000rpm离心30min，取上清液用0.02 μ m陶瓷膜过滤，其截留分子量大小为10000-100000Da，收集滤液。
[0012]浓缩步骤具体为:将滤液用超滤膜浓缩的方式(超滤设备)浓缩至原体积的1/5，收集浓缩液。
[0013]本发明采用真空冷冻干燥的方法于_20°C冻干6h。
[0014]本发明还包括采用HPLC方法对冻干粉末中的虫草素以及采用苯酚-硫酸法对虫草多糖进行定性定量检测的步骤。
[0015]经检测，采用本发明方法从100g蛹虫草固体培养基残基中能提取约2.92g虫草素和约4.21g虫草多糖。
[0016]本发明以蛹虫草固体培养基残基为原料，采用正交试验设计等方法对利用蛹虫草固体培养基残基提取虫草多糖与虫草素的各种工艺条件进行分析，并确定出最佳的提取方法。
[0017]本发明方法粗提率高，操作方便，能够最大限度地利用蛹虫草培养基残基，利于工业化生产，可带来良好的社会效益、经济效益和环境效益。
【具体实施方式】
[0018]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0019]以下实施例中涉及的蛹虫草固体培养基残基源自湖南炎帝生物工程有限公司常德子公司。0.02μπι陶瓷膜(截留分子量大小为10000-100000Da)购自上海华膜实业有限公司。超滤设备购自莱特莱德超滤设备有限公司。
[0020]实施例1从蛹虫草固体培养基残基中提取虫草素和虫草多糖的方法
[0021 ] 本方法包括对蛹虫草固体培养基残基进行干燥、粉碎、水提、微滤、浓缩、冻干及定性定量检测等步骤。
[0022]1、干燥:蛹虫草固体培养基残基使用热风循环干燥箱温度在< 80°C的条件下干燥2ho
[0023]2、粉碎:将烘干的物料用万能粉碎机分别进行粉碎，过120目筛。
[0024]3、水提:将粉碎后的培养基残基加水于65°C进行热回流提取2次，2h/次，每次提取料水比按g:mL计为1:15。
[0025]4、微滤:将提取液降温后以6000rpm离心30min，然后用陶瓷膜过滤，收集滤液。
[0026]5、浓缩:将滤液倒入超滤设备中浓缩至原体积的1/5，收集浓缩液。
[0027]6、冻干:用真空冷冻干燥的方法(_20°C冻干6h)对浓缩液进行干燥。
[0028]7、虫草素和虫草多糖进行定性定量检测。
[0029]虫草素的检测:
[0030]HPLC方法灵敏度高且受样品基质影响小，主要采用反相HPLC法，以十八烷基键合硅胶(C18)为固定相，甲醇.水、甲醇.磷酸盐缓冲液或乙腈.水为流动相，常用的检测器有紫外检测器(ultrav1let detector, UVD)和二极管阵列检测器(d1de array detector,DAD/photo一d1de array，PDA)。以梓檬酸、醋酸、三乙胺的混合溶液-乙腈(98:2，体积比)为流动相，在Capcellpak C18 (4.6mmX 150mm, 5um)色谱柱上分离，UVD于260nm波长处检测。虫草素检测限(limit of detect1n，L0D)为0.2 μ g/mL，回收率为92.03 %?97.35%，相对标准偏差(relative standard deviat1n, RSD)为 0.104% ο
[0031]经检测，采用本方法从100g蛹虫草固体培养基残基中能提取约2.92g虫草素。
[0032]虫草多糖的检测:
[0033]采用苯酚-硫酸法:多糖在硫酸的作用下先水解成单糖然后迅速脱水与苯酚生成橙黄色化合物，再以分光光度法测定。苯酚-硫酸法对多糖纯度要求不高，用于测定虫草多糖含量。采用分光光度计法在488nm处测定。虫草多糖质量浓度在7.12?70.08 μ g/mL范围内线性良好，r值为0.9995，回收率为95%?105%，RSD为1.09%。
[0034]经检测，采用本方法从100g蛹虫草固体培养基残基中能提取约4.21g虫草多糖。
[0035]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1.从蛹虫草固体培养基残基中提取虫草素和虫草多糖的方法，其特征在于，包括对蛹虫草固体培养基残基进行干燥、粉碎、水提、微滤、浓缩、冻干及定性定量检测的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，干燥步骤具体为:将蛹虫草固体培养基残基置于热风循环干燥箱内于< 80°C条件下烘干2h。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，粉碎步骤具体为:干燥后培养基残基用万能粉碎机进行粉碎，过120目筛。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，水提步骤具体为:向粉碎后的培养基残基中加水进行热回流提取，料水比按g:mL计为1:15。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，于65°C提取2次，2h/次，每次提取料水比按g:mL计为1:15，合并2次提取液。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，微滤步骤具体为:收集水提后的提取液，降至室温后6000rpm离心30min，取上清液用0.02 μm陶瓷膜过滤，其截留分子量大小为10000-100000Da,收集滤液。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，浓缩步骤具体为:将滤液用超滤膜浓缩的方式浓缩至原体积的1/5，收集浓缩液。8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，采用真空冷冻干燥的方法于_20°C冻干6h。
【专利摘要】本发明提供一种从蛹虫草固体培养基残基中提取虫草素和虫草多糖的方法，包括对蛹虫草固体培养基残基进行干燥、粉碎、水提、微滤、浓缩、冻干及定性定量检测等步骤。本发明以蛹虫草固体培养基残基为原料，采用正交试验设计等方法对利用蛹虫草固体培养基残基提取虫草多糖与虫草素的各种工艺条件进行分析，并确定出最佳的提取方法。本发明方法粗提率高，操作方便，能够最大限度地利用蛹虫草培养基残基，利于工业化生产，可带来良好的社会效益、经济效益和环境效益。
【IPC分类】C07H19/16, C08B37/00, C07H1/08
【公开号】CN105294796
【申请号】CN201510767564
【发明人】王玉兰, 刘艳, 赵明, 王春芳
【申请人】湖南炎帝生物工程有限公司
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月11日