专利名称：一种蛹虫草固体培养生产类胡萝卜素的方法
技术领域：
本发明涉及一种从蛹虫草固体培养的产物中提取类胡萝卜素的方法。
背景技术：
在食品安全日益引起关注的今天，天然食用色素以其色泽自然、安全无毒越来越受到人们的重视。天然类胡萝卜素(Carotenoid)是由八个异戊二烯组成的萜类化合物，涵盖了从亮黄色到暗红色的范围。除了能为食品添色外，还具有较高的营养和保健价值。几乎所有类胡萝卜素均有抗氧化、增强免疫力、防止紫外线损伤、抗心血管疾病和抗癌等功能，
胡萝卜素、α-胡萝卜素还是维生素D的前体等。类胡萝卜素作为食品添加剂和营养增补剂，已经得到美国食品药品管理局、欧洲共同体、世界卫生组织等国际组织的认可。类胡萝卜素可以由植物、藻类、光合细菌及某些非光合细菌、真菌合成。由于微生物发酵法生产类胡萝卜素具有不受环境条件限制、便于工业化生产、提取工艺简单等优点，近年来引起国内外的普遍重视。目前已发现能合成胡萝卜素的真菌主要有三 ？1 ^β (Blakeslea trispora) > Ji ^ (Phycomyces blakesleeanus) > Il f^ BJ (Rhodotorula)、土生假丝酵母(Candida humicola)、白球拟酵母(Torulopsis Candida)等等。但是由于成本的劣势，只有很少一部分实现了商业化生产，亟需寻找新的适合类胡萝卜素工业化生产的微生物资源。蛹虫草[Cordyc印s militaris (L. ) Link]又称北虫草、北冬虫夏草，是真菌寄生于鳞翅目等昆虫的虫体上形成的虫菌复合体，是一种具有滋补作用的中药和营养品。生物分类上隶属于子囊菌门(Ascomycota)、子囊菌纲(Ascomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、 虫草菌科(Cordicipitaceae)、虫草属[Cordyc印s (Fr. ) Link]。蛹虫草具有多种药理功效， 当前，它已经在东亚地区被广泛作为滋补品及药用菌使用，我国卫生部于2009年3月16日正式将其列为了新资源食品(中华人民共和国卫生部公告2009年第3号http://WWW. moh. gov. cn/publicfiles/business/htmlfiles/zwgkzt/pgg/200903/39591.htm)。目前对蛹虫草产类胡萝卜素的研究较少，2006年付鸣佳申请了专利“从蛹虫草中发酵生产类胡萝卜素的工艺”(中国专利申请号200610018 . 4)，该专利为利用蛹虫草菌进行液体静止发酵，收集发酵液液面上的菌丝体用乙醇进行提取，存在菌丝体得率和类胡萝卜素提取率偏低的缺点。随着蛹虫草栽培的工业化，产生了大量的培养基残渣，因此，如何实现蛹虫草子实体的深层次开发和综合利用显的尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种蛹虫草固体培养生产类胡萝卜素的方法。本发明所提供的蛹虫草固体培养生产类胡萝卜素的方法，包括下述步骤1)将蛹虫草菌(Cordyc印s militaris)进行固体培养，收集培养产物；2)将所述培养产物进行破壁处理，离心，收集沉淀；3)将所述沉淀用有机溶剂进行抽提，过滤，得到类胡萝卜素粗提液，除去所述类胡萝卜素粗提液中的有机溶剂，得类胡萝卜素粗品。其中，所述培养产物具体可为蛹虫草子实体和/或蛹虫草菌丝体和/或培养基残渣。本发明中，所述固体培养过程分为菌丝体生长阶段和子实体生长阶段，所述菌丝体生长阶段的培养条件为16-20°C，避光培养7-20天；所述子实体生长阶段的培养条件为18-25°C，光照培养15-50天。上述子实体生长阶段的光照培养为自然光照射培养或不连续灯光照射(光照强度为50-1200LUX，每日照射4-12小时)培养。所述固体培养的培养基为谷物培养基，所述谷物培养基由质量份数比为 1:1-1: 1.5的谷物和营养液组成，所述谷物选自下述至少一种大米、小米、玉米渣、大麦和小麦。所述营养液选自下述a)或b)，所述a)按照下述方法制备得到将200g马铃薯煮汁，加入葡萄糖5-40g，用水定容至1000ml，即得；所述b)按照下述方法制备得到马铃薯200g煮汁，加入葡萄糖5-40g、酵母膏l-10g，用水定容至1000ml，即得。本发明中，所述步骤2、中破壁的方法具体可为液氮研磨和/或酸热法。所述步骤3)中的有机溶剂选自下述至少一种丙酮、甲醇和乙醇。所述步骤3)中所述沉淀与所述有机溶剂的配比可为Ig 5ml_20ml，并且该有机溶剂可回收重复利用；所述抽提的次数具体可为1-3次。上述方法还包括将得到的类胡萝卜素进行初步纯化的步骤；所述纯化的方法选自下述任一种1)将所述类胡萝卜素用无水乙醇溶解，真空干燥得类胡萝卜素，幻将所述类胡萝卜素用无水乙醇溶解，将无水乙醇溶液置于-20°C至-40°c，使类胡萝卜素析出，得类胡萝卜素。本发明提供了一种从蛹虫草固体培养的产物(包括菌丝体、子实体和培养基残渣)中提取类胡萝卜素的方法。该方法生产的类胡萝卜素得率高，每克ml鲜培养产物能提取得到60-700 μ g类胡萝卜素；且所得到的蛹虫草类胡萝卜素呈现鲜亮的橙黄色，为天然产物。另外，本发明中固体培养所需的培养基原材料来源丰富，价格低廉，无需特殊的设备， 同时使培养基残渣得到了开发利用。
图1为本发明提取纯化类胡萝卜素的工艺流程图。
具体实施例方式下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。下述实施例中类胡萝卜素的提取按照图1所示的流程图进行。实施例1、从蛹虫草固体培养的子实体中提取类胡萝卜素的方法(1)菌株活化将蛹虫草菌1065(保藏编号CGMCC 5. 1973)接种于马铃薯固体培养基(PDA)上活化，培养温度20°C，培养时间10天。(2)菌种培养用步骤(1)的菌丝体，在无菌条件下接种到PDA液体培养基(培养基组成为马铃薯200g煮汁，葡萄糖20g，定容至1000ml)中，培养温度20°C，培养方式为利用漩涡式摇床培养，转速150转/分钟，培养至对数生长期。(3)固体培养将步骤( 中活化的液体菌种接入大米培养基中，置于培养箱中进行培养。先在温度20°C的条件下，避光培养10天；然后自然光照射，18-25°C培养40天，收获蛹虫草子实体。所述大米培养基的配方为IOOg大米，150ml营养液，将所述大米和营养液混合后121°C灭菌1小时，即得所述大米培养基，所述营养液组成为马铃薯200g煮汁，葡萄糖20g，定容至1000ml。(4)类胡萝卜素提取将收获的新鲜子实体IOg加液氮研磨，酸热法破壁(150mllM 盐酸室温浸泡30min，沸水％iin，立即冰上冷却)，5000rpm离心lOmin，弃上清，沉淀用蒸馏水洗涤离心。然后用IOOml丙酮抽提，重复三次，合并滤液，得到类胡萝卜素粗溶液。真空浓缩除去丙酮，用无水乙醇溶解，真空干燥得类胡萝卜素干品6. 863mgo实施例2、从蛹虫草固体培养基残渣中提取类胡萝卜素的方法(1)菌株活化将蛹虫草菌1065(保藏编号CGMCC 5. 1973)接种于马铃薯固体培养基(PDA)上活化，培养温度20°C，培养时间10天。(2)菌种培养用步骤⑴的菌丝体，在无菌条件下接种到马铃薯液体培养基中， 培养温度20°C，培养方式为利用漩涡式摇床培养，转速150转/分钟，培养至对数生长期。(3)固体培养将步骤( 中活化的液体种子接入大米培养基中，置于培养箱中进行培养。先在18°C避光培养10天，然后自然光照射，18-25°C培养40天，收获蛹虫草子实体后得到培养基残渣。所述大米培养基的配方为100g大米，150ml营养液，将所述大米和营养液混合后121°C灭菌1小时，即得所述大米培养基；所述营养液组成为马铃薯200g煮汁，葡萄糖20g，酵母膏2g，定容至IOOOml。(4)类胡萝卜素提取将收获的新鲜大米培养基残渣IOg液氮研磨，酸热法破壁 (150ml IM盐酸室温浸泡30min，沸水％iin，立即冰上冷却)，5000rpm离心lOmin，弃上清， 沉淀用蒸馏水洗涤离心。用IOOml乙醇抽提，重复三次，合并滤液，得到类胡萝卜素粗溶液。 真空浓缩除去乙醇，用无水乙醇溶解，无水乙醇溶液置于-20°C，使类胡萝卜素结晶析出得 0. 695mg类胡萝卜素结晶。
权利要求
1.一种蛹虫草固体培养生产类胡萝卜素的方法，包括下述步骤1)将蛹虫草菌(Cordyc印Smilitaris)进行固体培养，收集培养产物；2)将所述培养产物进行破壁处理，离心，收集沉淀；3)将所述沉淀用有机溶剂进行抽提，过滤，得到类胡萝卜素粗提液，除去所述类胡萝卜素粗提液中的有机溶剂，得到类胡萝卜素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述培养产物为蛹虫草子实体和/或菌丝体和/或培养基残渣。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述固体培养过程分为菌丝体生长阶段和子实体生长阶段，所述菌丝体生长阶段的培养条件为16-20°C，避光培养7-20天； 所述子实体生长阶段的培养条件为18-25°C，光照培养15-50天。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述菌丝体生长阶段的光照培养为自然光照射培养或不连续灯光照射培养；所述不连续灯光照射的光照强度为50LUX-1200LUX， 每日光照4-12小时。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述固体培养的培养基为谷物培养基，所述谷物培养基由质量份数比为1 1-1 1.5的谷物和营养液组成，所述谷物选自下述至少一种大米、小米、玉米渣、大麦和小麦；所述营养液选自下述a)或b)，所述a) 按照下述方法制备得到将200g马铃薯煮汁，加入葡萄糖5-40g，用水定容至1000ml，即得； 所述b)按照下述方法制备得到马铃薯200g煮汁，加入葡萄糖5-40g、酵母膏l-10g，用水定容至1000ml，即得。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述步骤幻中破壁的方法为液氮研磨和/或酸热法。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述步骤幻中的有机溶剂选自下述至少一种丙酮、甲醇和乙醇。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述步骤⑴中所述沉淀与所述有机溶剂的配比为Ig 5-20ml，所述抽提的次数为1-3次。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述方法还包括将得到的类胡萝卜素进行纯化的步骤；所述纯化的方法选自下述任一种1)将所述类胡萝卜素用无水乙醇溶解，真空干燥得纯化的类胡萝卜素，幻将所述类胡萝卜素用无水乙醇溶解，将无水乙醇溶液置于_20°C至_40°C，使类胡萝卜素析出，得纯化的类胡萝卜素。
10.根据权利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于所述蛹虫草菌(Cordyc印S militaris)为蛹虫草菌1065，其保藏号为CGMCC 5. 1973。
全文摘要
本发明公开了一种蛹虫草固体培养生产类胡萝卜素的方法。该方法包括下述步骤1)将蛹虫草菌(Cordyceps militaris)进行固体培养，收集培养产物；2)将所述培养产物进行破壁处理，离心，收集沉淀；3)将所述沉淀用有机溶剂进行抽提，过滤，得到类胡萝卜素粗提液，除去所述类胡萝卜素粗提液中的有机溶剂，得到类胡萝卜素。采用本发明的方法生产的类胡萝卜素得率高，每克鲜培养产物能提取得到60-700μg类胡萝卜素；且所得到的蛹虫草类胡萝卜素呈现鲜亮的橙黄色，且为天然产物。另外，本发明中固体培养所需的培养基原材料来源丰富，价格低廉，无需特殊的设备；同时使生产中的培养基残渣得到了开发利用。
文档编号C12R1/645GK102234676SQ20101016895
公开日2011年11月9日 申请日期2010年5月5日 优先权日2010年5月5日
发明者姚一建, 董彩虹 申请人:中国科学院微生物研究所