专利名称：中试规模黄芪渣虫草菌固体发酵方法
技术领域：
本发明涉及生物技术应用领域，属于中药渣的利用，用工业上经“水提醇沉”提取黄芪多糖后剩余的黄芪渣作为中国拟青霉菌丝体固态发酵的基质，对其固态发酵工艺进行中试规模扩大培养的方法。
背景技术：
中药残渣是药材加工为成药后剩余的大量含各种残余成分的药渣，含有许多可利用的有效成分，但它大多被废弃，给环境带来很大的压力。随着人们环保意识的增强和科技的发展，越来越多的研究致力于解决中药渣的残余问题，因此，出现了一些中药渣利用的新技术。申请号为201110351078. 4，名为“利用维药(民族药)药渣固态发酵生产微生物饲 料添加剂及酶制剂”的专利，其方法是以维药(民族药)药渣为主要原料，经适当配方选择作为发酵的基料，经固体发酵生产有益微生物及酶制剂。中药残渣的二次利用不仅解决了药渣对环境带来的压力，还使得药渣“变废为宝”，得到了充分利用。黄芪为豆科植物蒙古黄芪和膜荚黄芪等的根，黄芪含有大量的黄酮、生物碱、多糖、皂苷等活性成份。研究证明，黄芪多糖具有提高动物生产性能、增强机体免疫功能和抗病力等多方面的功能。在工业生产上，黄芪多糖的提取方法大多数停留在传统的“水提醇沉”，这种方法黄芪多糖得率比较低，产生大批量的残渣，而且这种方法使得黄芪中其他药用成分残留于残渣中。大批黄芪残渣如果处置不当就是一种浪费，怎样进行黄芪残渣的二次开发，使其“变废为宝”就成了一个新的研究课题。本发明是采用中国拟青霉进行固体发酵，对工业黄芪渣进行二次利用的方法。经调查，申请的专利中已经有了对黄芪残渣二次利用的专利，申请号为200810151982. 9，名为“利用黄芪渣发酵生产禽畜饲料添加剂的方法”的专利，其方法是以EM原露为菌种，黄芪药渣、麦麸和红糖混合物为培养基，进行固体发酵，生产禽畜饲料添加剂，它所用的菌种是EM原露，但本发明所用的菌种是真菌中国拟青霉。另外，申请号为200910114886. 1，名为“一种真菌发酵物饲料添加剂及其制备方法和应用”的专利，其方法是利用从虫草中分离的一种蝙蝠蛾拟青霉，经诱变后得到的高产菌株作为菌种，对玉米粉和豆柏为固态发酵基质进行固态发酵，得到蝙蝠蛾拟青霉发酵物，这个发明中所用菌种虽然为真菌，但其不是对黄芪渣二次利用的发明。本发明的方法是将黄芪渣与营养物质和水进行适当配比，经灭菌制成发酵基质，将中国拟青霉种子液接种到发酵基质上进行固态发酵制得黄芪渣虫草发酵曲，再经过干燥、粉碎制成黄芪渣虫草发酵粉。本发明主要侧重“黄芪渣虫草菌固体发酵”中试规模扩大培养。对于本实验的中试规模扩大培养，我们采用浅盘发酵法，浅盘的外形为长方型，规格为280 X 180 X 120毫米，由耐高温的聚丙烯材料构成，且设有无菌通气口。本方法特征在于发酵时可将发酵物放于浅盘中，然后将浅盘置于耐高温聚丙烯材料的塑料袋中，用棉塞将其于通气口处封口，进行灭菌，接种，发酵培养。与传统固体发酵相比，本方法优点是首先，本方法解决了在发酵期间通气容易带来污染的问题；其次，本方法能有效阻止发酵过程中水分的流失；再次，本实验可以循环培养，解决了发酵罐占用且阻碍下次发酵的问题，从而解决了固体发酵周期长带来的问题；最后本方法使用的浅盘成本低，可重复使用，降低了试验成本，便于实现工业化生产。
发明内容
本发明的目的是采用新型方法对黄芪渣虫草菌固体发酵进行中试规模的扩大培养，以达到规模生产的最终目的，为黄芪渣虫草菌固体发酵进行工业化生产提供依据，为大批工业黄芪渣的处理开辟一条新路。本发明为中试规模黄芪渣虫草菌固体发酵的扩大培养，包括下述步骤I.将本发明使用的菌种中国拟青霉接种在PDA斜面上，于20°C下恒温培养7d，成熟后，用无菌水制成孢子悬浮液，待用。所述PDA斜面培养基为马铃薯培养基，其具体制备方法为去皮马铃薯200g切成·小块，加水500mL煮沸30min，四成纱布过滤后，在滤汁中加入葡萄糖20g，琼脂20g并加热，琼脂完全溶解后补足水分至IOOOmL,分装，灭菌，备用。2.将种子培养基经O. lMp，121°C，20-30min灭菌。冷却后，按1_5%量接入步骤I中的孢子悬浮液，摇勻，于20°C、150r/min恒温振荡培养箱中培养3天，作为一级种子液，用于接种到固态基质上进行固态发酵。所述种子培养液为:葡萄糖2%，蛋白胨I % ,KH2PO3 O. 3%, MgSO4 O. 15%，起始pH为自然pH。3.固体发酵培养基的制备用规格为280X180X120毫米的浅盘，装入200g-300g黄芪渣，将12. Og葡萄糖，O. 3g蛋白胨，溶于450ml水，将黄芪残渣与营养液按I : I. 5的比例混合，搅拌均匀，将浅盘装于聚丙烯塑料袋内，用棉塞封口，以此方法制备多盒固体培养基,0. lMp,121°C灭菌 20min_30min。4.接种先将固体培养基在紫外灯下表面灭菌lh，灭菌结束后将手用75%酒精消毒，在无菌环境下，拔出棉塞，将浅盘从塑料袋内拿出，按20% -30%的接种量，把种子液均匀洒到固体培养基的表面，然后将浅盘重新放入袋子内，再用棉塞封口，依次接种其他培养基。5.固体发酵接种完的培养基需在16°C _20°C条件下避光培养35d-45d。6.发酵后处理发酵结束后的产物，置60°C-70°C，鼓风条件下，经48h_60h烘干，烘干后的发酵产物，粉碎，过60目筛，得黄芪渣虫草菌发酵粉。7.按上述1-6步骤可成倍扩大每批培养浅盘数，2倍，4倍，6倍，8倍等，每批浅盘数可根据发酵规模确定。本发明的有益结果是I)通过固体发酵工艺有效利用了废弃的黄芪药渣，大批发酵后的黄芪渣，水分含量为3% _5%，粗多糖含量6% _9%，脂肪含量为I. 2% -I. 5%，粗纤维含量为35% -40%,粗蛋白含量为12% -15%，灰分6% -8% ；2)通过固体发酵工艺有效利用了废弃的黄芪药渣，将其转化为含多种中药活性成分的发酵粉，既减少了其对环境造成的污染，又能提供高附加值的发酵产品，可用于动物饲料添加剂等；
3)有效减少了黄芪渣中的粗纤维含量，实验结果表明，本发明所述中试方法可使黄芪渣粗纤维的降解率达到20%。
具体实施例方式实施例I :黄芪渣虫草菌固体发酵培养方法I.将本发明使用的菌种中国拟青霉接种在PDA斜面上，于20°C下恒温培养7d，成熟后，用无菌水制成孢子悬浮液，待用。所述PDA斜面培养基为马铃薯培养基，其具体制备方法为去皮马铃薯200g切成小块，加水500mL煮沸30min，四成纱布过滤后，在滤汁中加入葡萄糖20g，琼脂20g并加热，琼脂完全溶解后补足水分至IOOOmL,分装，灭菌，备用。、
2.将种子培养基经O. IMp, 121°C，20-30min灭菌。冷却后，按1_5%量接入步骤I中的孢子悬浮液，摇勻，于20°C、150r/min恒温振荡培养箱中培养3天，作为一级种子液，用于接种到固态基质上进行固态发酵。所述种子培养液为葡萄糖2%，蛋白胨I % ,KH2PO3 O. 3%, MgSO4 O. 15%，起始pH为自然pH。3.固体发酵培养基的制备用规格为280X180X120毫米的浅盘，装入200g_300g黄芪渣，将12. Og葡萄糖，O. 3g蛋白胨，溶于450ml水，将黄芪残渣与营养液按I : I. 5的比例混合，搅拌均匀，将浅盘装于聚丙烯塑料袋内，用棉塞封口，以此方法制备多盒固体培养基,0. lMp,121°C灭菌 20min_30min。4.接种先将固体培养基在紫外灯下表面灭菌lh，灭菌结束后将手用75%酒精消毒，在无菌环境下，拔出棉塞，将浅盘从塑料袋内拿出，按20% -30%的接种量，把种子液均匀洒到固体培养基的表面，然后将浅盘重新放入袋子内，再用棉塞封口，依次接种其他培养基。5.固体发酵接种完的培养基需在16°C _20°C条件下避光培养35d_45d。6.发酵后处理发酵结束后的产物，置60°C _70°C，鼓风条件下，经48h_60h烘干，烘干后的发酵产物，粉碎，过60目筛，得黄芪渣虫草菌发酵粉。实施例2 :黄芪渣虫草菌固体发酵扩大培养I.按实施例I的培养方法培养20个浅盘，制备种子液到接种完毕需要4d，使用黄芪渣6000g，培养38d，发酵后得发酵产物4200g，产物得率为70 %。2.按实施例I的培养方法培养40个浅盘，制备种子液到接种完毕需要4d，使用黄芪渣12000g，培养38d，发酵后得发酵产物8400g，产物得率为70%。3.按实施例I的培养方法培养80个浅盘，制备种子液到接种完毕需要4d，使用黄芪渣24000g，培养38d，发酵后得发酵产物16800g，产物得率为70 %。4.按实施例I的培养方法培养160个浅盘，制备种子液到接种完毕需要4d，使用黄芪渣48000g，培养38d，发酵后得发酵产物33600g，产物得率为70 %。5.本方法制备种子液到接种完毕需要4d，从第五天可以培养第二批种子液，开始第二批发酵，即以4d为周期，可以循环培养，随着人力的增加可以扩大每批发酵的规模，并进行第三批、第四批、第五批等，实现工业化生产。
权利要求
1.中试规模黄芪渣虫草菌固体发酵方法，以工业上经“水提醇沉”提取黄芪多糖后剩余的黄芪残渣为原料，用中国拟青霉进行固态发酵工艺的中试规模培养。对于本实验的中试规模扩大培养，我们采用浅盘发酵法，浅盘的外形为长方型，规格为280 X 180 X 120毫米，由耐高温的聚丙烯材料构成，且设有无菌通气口。本方法特征在于以工业上“水提醇沉”提取黄芪多糖后剩余的黄芪渣为原料，将该原料烘干、粉碎、加入速效营养物质和水，混合均匀后放于浅盘中，然后将浅盘置于聚丙烯材料的塑料袋中，用棉塞将其通气口处封口，进行灭菌。灭菌后接种中国拟青霉种子液，在好氧条件下进行浅盘固态发酵，发酵产物经干燥、粉碎后得到发酵产物一黄芪渣虫草菌发酵粉。其中每个浅盘的装盘量为200g-300g，每次培养20盒，可利用原料4000g-600()g。每批浅盘数可根据发酵规模确定。
2.根据权利要求I所述的“工业黄芪渣用中国拟青霉进行固态发酵工艺的中试规模培养”中的中试规模培养方法，其特征在于以浅盘发酵法将黄芪渣虫草菌固体发酵规模扩大2倍、4倍、8倍等，即可以成倍扩大发酵规模；除此之外由于本方法不会存在“发酵罐被占用而阻碍发酵进程”的问题，所以随着人力增加，本方法可以充分扩大培养规模，而且可以循环培养，使其工业化生产成为可能，可得到性能稳定的“黄芪渣虫草菌发酵粉”。
3.根据权利要求I所述的“工业黄芪渣用中国拟青霉进行固态发酵工艺的中试规模培养”中固态发酵的条件，固体培养基制备固态物质与营养水按I : I. 5质量比进行配料，并将其混合均匀，营养水中无水葡萄糖12份、蛋白胨O. 3份，水450份，pH值自然。
4.根据权利要求I所述的“工业黄芪渣用中国拟青霉进行固态发酵工艺的中试规模培养”中固态发酵的条件，选用菌种为中国拟青霉。
5.根据权利要求I所述的“工业黄芪渣用中国拟青霉进行固态发酵工艺的中试规模培养”中固态发酵的条件，灭菌要求蒸汽压力O. IMp，温度121°C，时间20min-30min ；
6.根据权利要求I所述的“工业黄芪渣用中国拟青霉进行固态发酵工艺的中试规模培养”中固态发酵的条件，接种量20% -30%，发酵条件温度16°C _20°C，发酵时间35d_45d ；
7.根据权利要求I所述的“工业黄芪渣用中国拟青霉进行固态发酵工艺的中试规模培养”中固态发酵的条件，干燥条件60°C -70°C鼓风干燥。
8.根据权利要求I所述的“黄芪渣虫草菌发酵粉”可在饲料添加剂和医药保健等领域应用。
全文摘要
本发明涉及生物技术应用领域，属于中药渣的利用，工业上提取黄芪多糖后剩余的黄芪渣作为中国拟青霉菌丝体固态发酵的基质，对其固态发酵工艺进行中试规模扩大培养的方法。“黄芪渣虫草菌固态发酵工艺”中试规模培养方法浅盘发酵法。浅盘的外形为长方型，规格为280×180×120毫米，由耐高温的聚丙烯材料构成，且设有无菌通气口。本方法特征在于发酵时可将发酵物放于浅盘中，然后将浅盘置于聚丙烯材料的塑料袋中，用棉塞将其于通气口处封口，进行灭菌，接种。随着人力增加，本方法可以充分扩大培养规模，而且可以循环培养，使其工业化生产成为可能，可得到性能稳定的“黄芪渣虫草菌发酵粉”。
文档编号C05G3/00GK102715017SQ201210239320
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月12日 优先权日2012年7月12日
发明者刘安军, 孙会轻, 朱振元, 肖超岭 申请人:天津科技大学