青杄转录因子PwHAP5及其编码基因与应用的制作方法

专利名称：：青杄转录因子PwHAP5及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及青杆转录因子PwHAP5及其编码基因与应用。
背景技术：
：农作物的生产受到盐碱、干旱等非生物胁迫的影响非常严重。全世界约有20%的耕地和50%的灌溉田受到不同程度的盐害威胁，并有逐年增加的趋势。我国盐渍土地面积约为1.4亿亩，占耕地总面积的近7%，此外还有盐渍荒地2亿多亩。全世界干旱和半干旱地区总面积占陆地总面积的34.9%；我国干旱、半干旱耕地面积占总面积的51%。通过转基因提高作物的耐盐抗旱能力是一条行之有效的办法。因此，寻找与盐、干旱胁迫有关的基因并研究其具体功能，以及调控途径具有重要的理论和实践意义。早期的耐盐基因工程主要集中在清除自由基和增加渗透调节物质两个方面，并且主要通过转化单个或多个功能基因来提高转基因植株的耐盐能力，虽然转基因植株的耐盐能力有所提高，但效果不太明显。最近，定位在细胞核内的许多调节盐胁迫下功能基因表达的转录因子从许多植物中分离出来。研究结果表明通过这些转录因子调节后期的许多功能基因的表达，可以大大提高转基因植株的耐盐性，从而很大程度上促进了耐盐基因工程方面的研究工作并取得突破性进展。HAP作为转录因子以其DNA结合域与一些基因启动子区的CCAAT序列结合来调节转录活性。目前对HAP的转录调控机制的研究主要是在哺乳动物中进行的，在植物中知之甚少。研究表明HAP类转录因子可参与植物的多种生长发育及生理生化过程，目前还未见对于其在种子萌发过程中抗盐耐旱方面的报道。
发明内容本发明的目的在于提供一种与植物种子萌发的蛋白。本发明提供的蛋白，与植物种子萌发相关，名称为PwHAP5，来源于青杆(PiceawilsoniiMast·)，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物种子萌发相关的由1)衍生的蛋白质。为了使1)中的PwHAP5便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1.标签的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述2)中的PwHAP5可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的PwHAP5的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。上述与植物种子萌发相关的蛋白的编码基因(命名为PwHAP5)也属于本发明的保护范围之内。上述PwHAP5基因具体可为如下1)_4)中任一所述的基因1)其编码序列是序列表中序列1；2)其核苷酸序列是序列表中的序列3；3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且编码所述蛋白的基因；4)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。序列1中有606个核苷酸，可编码序列表中序列2所述的蛋白。上述严格条件可为用0.IXSSPE(或0.1XSSC)，0.SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65°C下杂交并洗膜。扩增上述PwHAP5基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。含有上述PwHAP5基因的表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。含有上述PwHAP5基因的重组载体也属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有PwHAP5基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。使用PwHAP5基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此夕卜，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。所述重组载体具体可为在pBI121的多克隆位点间插入上述PwHAP5基因得到的重组表达载体。本发明的另一目的在于提供一种培育转基因植物的方法。本发明提供的培育转基因植物的方法是将PwHAP5基因转入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物的种子在逆境下的萌发率高于所述目的植物。上述的PwHAP5基因可通过上述的重组表达载体导入目的植物中的。携带有本发明的PwHAP5基因的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。进一步，上述逆境是高盐环境或干旱环境。上述高盐环境具体可以是75mM、100mM、150mM或200mM的Nacl水溶液引起的环境。上述干旱环境具体可以是100mM、200mM、300mM或400mM的甘露醇水溶液模拟得到的干旱环境。上述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，优选是拟南芥。实验证明本发明获得的转基因拟南芥的种子在培养基中Nacl浓度为75mM、100mM、150mM和200mM时的萌发率显著高于野生型对照和空载体对照的种子萌发率。并且本发明获得的转基因拟南芥的种子在培养基中甘露醇浓度为100mM、200mM、300mM和400mM时的的萌发率显著高于野生型对照和空载体对照的种子萌发率。图1为PwHAP5基因在青杆各组织中的表达情况。图2为转基因拟南芥分子检测结果。图3野生型拟南芥和转入PwHAP5基因的拟南芥种子在IOOmM的NaCl处理下萌发7天的观测结果。图4为野生型拟南芥和转入PwHAP5基因的拟南芥种子在不同浓度NaCl处理下萌发率测定结果。图5为野生型拟南芥和转入PwHAP5基因的拟南芥种子在不同浓度甘露醇处理下萌发率测定结果。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、转录因子PwHAP5及其编码基因的发现1、青杆花粉的处理于青杆(ZhangLY,LinJX,etal.PlantScience,2007，1721210-1217.)(PiceawilsoniiMast.，采自北京中科院植物所)花序开放的晴天上午，用消毒过的镊子，取下黄色的花粉块，放在白色洁净的纸上，然后放入消毒过的干燥玻璃瓶内，置于室内阴干，再分装于干燥的玻璃瓶内，密封，置于-20°C冰箱里贮藏备用。将贮存于_20°C冰箱的花粉转移至4V复苏12小时，之后再转移到室温继续复苏2小时。将复苏后的花粉置于液体培养基中，在室温(25士1°C)下萌发。培养基的成分包括12%蔗糖，0.03%硝酸钙或0.1%硝酸钙，0.01%硼酸，5mM柠檬酸-磷酸缓冲液，pH5.8。在青杆花粉培养24小时时取样。2、总RNA的提取采用RNAeasyplantminikit(Qiagen公司产品)提取总RNA。3、使用SMARTcDNALibraryConstructionKit构建青杆花粉对照cDNA文库以及Ca2+诱导cDNA文库。4.使用反相Northern差异筛选法筛选有表达差异的cDNA片断。5.将携带有表达差异的cDNA片断的pTriplEx2载体转入大肠杆菌BM25.8。6.序列测定本工作在上海生工生物工程技术服务有限公司进行。获得一606bp的cDNA片断(命名为PwHAP5)，核苷酸序列如序列表中序列1所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列2所示。7.同源检索利用BLAST软件将分离出的序列与基因银行(Genbank)中的序列进行比较，确定它属于青杆HAP类转录因子基因。实施例2、通过半定量RT-PCR分析PwHAP5基因的组织表达情况分别提取青杆花粉、针叶、树皮和根组织的RNA，反转录合成cDNA；然后分别以上述各组织的cDNA为模板，以5，-ATCAGCAGCAGCCCACAA-3’和5’-GGTAACCAGATGAGGGAG-3，为引物进行PCR扩增，检测PwHAP5基因在青杆不同组织中的表达情况。同时以EFl-α基因作为内参，扩增EFl-α基因的5，引物为:5，-AACTGGAGAAGGAACCCAAG-3，，3，引物为5’-AACGACCCAATGGAGGATAC-3’。PCR反应条件先94°C预变性5min；然后94°C10sec，56°C10sec，72°C20sec,共28个循环；再72°C延伸5min。PwHAP5基因在各组织中的表达情况如图1所示。结果表明，PwHAP5在所有组织中均有表达，根中表达量较低，针叶中表达量最高。实施例3、转基因拟南芥的获得及其检测一、重组表达载体的构建1、PwHAP5基因的获得制备下述引物对引物1:5‘-ATGGATCAGCAGCAGCCCA-3，；引物2:5‘-TCAACTGCTGCCATGAGGAGG-3，。(PiceawilsoniiMast.，)(ZhangLY,LinJX,etal.PlantScience,2007，172:1210-1217·)(记载过该材料的非专利文献是ZhangLY，HaoHQ,LinJX.ThelocalizationofRacGTPaseinPiceawillsoniipollentubesimpliesrolesintubegrowthandthemovementofthetubenucleusandspermcells.PlantScience,2007,172:1210-1217，公众可从北京林业大学获得)的cDNA为模板，用上述引物1和2进行PCR扩增，测序表明扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，序列1中有606个核苷酸，可编码序列表中序列2所述的蛋白。将序列2所示的蛋白命名为PwHAP5，将编码序列2所示蛋白的基因命名为PwHAP5。2、重组表达载体的获得将PwHAP5基因与pMD18_T载体相连接，操作步骤按照Takara公司产品pMD18-TVectorsystem的说明书进行；将与pMD18_T载体相连后的连接产物用限制性内切酶BamHI和SalI进行双酶切，得到含有上述PwHAP5基因的DNA片段(该DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示)，酶切产物与经相同酶切的质粒PBI121(购自Clontech公司)相连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂布在含有5-溴-4-氯_3_吲哚-β-D-半乳糖苷、X-gal和lOOug/ml氨苄青霉素的LB平板上培养过夜。挑取白色单菌落，在LB液体培养基中培养过夜并进行菌落PCR鉴定；同时碱法提取质粒DNA进行序列测定。测序结果表明，PwHAP5基因已正确连接到质粒PBI121上，将得到的重组表达载体命名为PBI121-PwHAP5。二、转基因拟南芥的获得用上述步骤一构建的重组表达载体PBI121_PwHAP5转化农杆菌GV3101(记载过该材料的非专利文献程振东，卫志明，许智宏。根癌农杆菌对甘蓝型油菜的转化及转基因植株的再生。植物学报，1994，36(9):657-663，公众可从北京林业大学获得)的感受态细胞，挑取转入重组表达载体PBI121-PwHAP5的农杆菌的单克隆接种于含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，28°C振荡培养两天。将发酵液3000rpm/min离心5分钟，所得农杆菌沉淀用含5%蔗糖和0.03%SilwetL-77的侵染液悬浮。采用沾花浸染法转化哥伦比亚生态型野生型拟南芥(Col-O)(可以购自美国拟南芥生物资源中心，ABRC)，收获该当代转基因拟南芥植株所接的种子(T1代)，在含有50mg/LKan(卡那霉素)的MS培养基筛选萌发的种子。将在上述培养基上萌发的T1代幼苗移到培养土中，收获种子(1~2代)，然后经相同的筛选过程得到纯合的T3代转pBI121-PwHAP5的转基因拟南芥种子。最后将T3代转基因拟南芥种子直接播种到培养土中，长出的T3代转基因拟南芥植株在长日照条件下生长两周左右开花。T3代植物分子检测的引物如下引物1:5‘-ATGGATCAGCAGCAGCCCA-3，；引物2:5‘-TCAACTGCTGCCATGAGGAGG-3，。结果如图2(1-6表示不同转基因株系；-表示阴性对照；+表示阳性对照)所示，不同转基因株系的目的基因的表达量显著高于阴性对照(阴性对照是野生型对照及下述的空载体对照)。三、种子萌发试验本实验设置以下两个对照野生型对照为转入任何质粒的野生型拟南芥(Col-O)；空载体对照按照获得T3代转入重组表达载体pBI121-PwHAP5的转基因拟南芥的方法，将空载体PBI121转入野生型拟南芥中，然后进行继代培养得到T3代转pBI121的转基因拟南芥。1、高盐条件下的种子萌发实验取野生型拟南芥、空载体对照和上述T3代转入重组表达载体PBI121_PwHAP5的转基因拟南芥的种子，在MS培养基上进行种子萌发实验，其中培养基中含不同Nacl浓度(分别是75mM、100mM、150mM和200mM)，实验条件是光周期为16小时光照，8小时黑暗；光强为300-400umol/M2/S；光照条件下的温度为22_24°C，相对湿度为70-90%；黑暗条件下的温度为18-20°C，相对湿度大于90%。在第7天统计种子萌发率，实验重复3次，测定结果如图3和图4所示(WT表示野生型拟南芥，T表示转入重组表达载体PBI121-PwHAP5的转基因拟南芥；空载体对照和野生型对照的表型一致，故图中未显示空载体对照)，T3代转入重组表达载体PBI121-PwHAP5的转基因拟南芥的种子在培养基中Nacl浓度为75mM、100mM、150mM和200mM时的萌发率显著高于野生型对照和空载体对照的种子萌发率。2、甘露醇模拟干旱胁迫条件下的种子萌发实验取野生型拟南芥、空载体对照和上述T3代转入重组表达载体PBI121_PwHAP5的转基因拟南芥的种子，在MS培养基上进行种子萌发实验，其中培养基中含不同甘露醇浓度(分别是0、100mM、200mM、300mM和400mM)，实验条件是光周期为16小时光照，8小时黑暗；光强为300-400umOl/M2/S；光照条件下的温度为22_24°C，相对湿度为70-90%；黑暗条件下的温度为18-20°C，相对湿度大于90%。在第7天统计种子萌发率，实验重复3次，测定结果如图5所示(WT表示野生型拟南芥，T表示转入重组表达载体PBI121-PwHAP5的转基因拟南芥；空载体对照和野生型对照的表型一致，故图中未显示空载体对照)，T3代转入重组表达载体PBI121-PwHAP5的转基因拟南芥的种子在甘露醇浓度为100mM、200mM、300mM和400mM时的的萌发率显著高于野生型对照和空载体对照的种子萌发率。权利要求一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物种子萌发相关的由1)衍生的蛋白质。2.权利要求1所述蛋白的编码基因。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述蛋白的编码基因为如下1)_4)中任一所述的基因1)其编码序列是序列表中序列1；2)其核苷酸序列是序列表中的序列3；3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且编码权利要求1所述蛋白的基因；4)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的基因。4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、转基因细胞系或重组菌。5.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为在PBI121的多克隆位点间插入权利要求2或3所述基因得到的重组表达载体。7.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因转入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物的种子在逆境下的萌发率高于所述目的植物。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于权利要求2或3所述的编码基因是通过权利要求4或5所述的重组表达载体导入目的植物中的。9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述逆境是高盐或干旱环境。10.根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，优选是拟南芥。全文摘要本发明公开了一种青杄转录因子PwHAP5及其编码基因与应用。所述PwHAP5是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物种子萌发相关的由1)衍生的蛋白质。将PwHAP5蛋白的编码基因导入拟南芥中后，转基因拟南芥的种子在高盐或干旱环境下的萌发率显著高于野生型拟南芥。文档编号C12N1/19GK101824080SQ20101016858公开日2010年9月8日申请日期2010年5月4日优先权日2010年5月4日发明者于彦丽,张凌云,李彦泽,郑成超申请人:北京林业大学