醇类的发酵生产的制作方法

醇类的发酵生产的制作方法
【专利摘要】本发明涉及工业微生物和醇生产的领域。本发明还涉及能够经由工程化的途径生产发酵产物的微生物的开发，以及所述微生物的使用。用于生产丁醇的方法，其包括下列步骤：(a)提供产丁醇菌，(b)使所述产丁醇菌与一种或多种碳底物在其中丁醇以有效收率被生产的条件下接触；(c)收集所述产丁醇菌；(d)以至少约6g/L的浓度回收丁醇；(e)使(c)的所收集的产丁醇菌与一种或多种碳底物在其中丁醇以有效收率被生产的条件下接触，并且其中所述有效收率为(b)的有效收率的至少约90％；(f)重复步骤(c)-(e)；以及，任选地使(c)的所收集的产丁醇菌在至少约0.3％的丁醇的存在下暴露于pH小于或等于约2.0的条件下至少约1小时。本发明还涉及改善细胞活力和生产能力的方法以及用以提高发酵产物的收率的循环利用和酸洗涤的使用。
【专利说明】醇类的发酵生产
[0001] 本专利申请要求提交于2011年12月30日的美国临时申请61/581，877 ;提交于 2012年5月9日的印度专利申请1423/DELNP/2012;以及提交于2012年8月9日的美国临 时申请61/681，230的权益；其全部内容全部以引用方式并入本文。
[0002] 序列表
[0003] 连同本文提交的序列表（CL5196W0PCT_SequenceListing. txt)中提供的序列（以 引用方式并入本文），符合37C. F. R. § § 1. 821-1. 825 ( "对含有核苷酸序列和/或氨基酸 序列公开内容的专利申请的要求-序列规则"（Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures-the Sequence Rules))，并且符合世界知识产权组织（World Intellectual Property Organization) (WIPO) ST. 25标准（2009)以及EPO和PCT的序列表要求（规则5. 2和 49.5(a-|3)以及行政指令（Administrative Instructions)的 208 节和附录 C)。用于核 苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循37C. F. R. § 1. 822所示的规定。

【技术领域】
[0004] 本发明涉及工业微生物和醇生产的领域。本发明还涉及能够经由工程化的途径生 产发酵产物的微生物的开发，以及所述微生物的使用。本发明还涉及改善细胞活力和生产 能力的方法以及用以提高发酵产物的收率的循环利用和酸洗涤的使用。

【背景技术】
[0005] 丁醇是一种重要的工业化学品，其可用作燃料添加剂、塑料工业中的化学原料以 及食品和香料工业中的食品级提取剂。每年使用来源于石油化学品的原料通过化学合成生 产100至120亿磅的丁醇。用于丁醇异构体（异丁醇）的化学合成的方法是已知的，诸如羰 基合成、一氧化碳的催化氢化（Ullmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第6 版，2003，Wiley_VCH Verlag GmbH and Co.，Weinheim，Germany，第 5 卷，716-719 页）和甲 醇与正丙醇的格尔伯特缩合（Carlini 等人，J. Molec. Catal. A. Chem. 220 :215-220, 2004)。 这些方法使用来源于石油化学品的起始材料。由植物来源的原材料生产异丁醇能够使化石 燃料的使用最小化，并将代表本领域中的进步。此外，利用植物来源的材料或其他生物质源 的化学品和燃料的生产将提供对石油化学品工艺的对生态环境友好的且可持续的替代方 案。
[0006] 异丁醇可以以生物方式作为酵母发酵的副产物产生。它是"杂醇油"的一种组分， 所述杂醇油由这群真菌氨基酸的不完全代谢形成。异丁醇具体地讲由L-缬氨酸的分解代 谢而产生。在L-缬氨酸的胺基作为氮源被利用后，所得的a-酮酸被酶脱羧并还原成异丁 醇，这就是所谓的 Ehrlich 途径（Dickinson 等人，J. Biol. Chem. 273 :25752-25756,1998)。
[0007] 诸如基因工程和代谢工程的技术可被用于修饰微生物，以从植物来源的材料或其 他的生物质源生产某些产物。例如，通过基因的插入诸如编码生物合成途径的基因的插入、 基因的缺失、或对调控因子诸如启动子的修饰，可以修饰微生物。微生物还可以被工程化以 改善细胞的生产能力和收率、消除生物合成途径的副产物、和/或用于菌株的改善。表达用 于生产丁醇异构体（包括异丁醇）的工程化的生物合成途径的微生物的例子描述于美国专 利 7, 851，188 和 7, 993, 889 中。
[0008] 然而，在发酵过程中暴露于醇类诸如乙醇和丁醇，可对细胞活力、细胞生产能力、 和产物收率具有负面影响。这些醇类的积聚能够抑制细胞的生长并最终影响这些醇类的发 酵生产。因此，在这些醇类的存在下，存在对表现出改善的细胞生长和生产的微生物的开发 以及维持和/或改善细胞活力和细胞生产能力的方法的需求。
[0009] 本发明涉及此类方法的开发以及能够经由在该微生物中的工程化的途径生产发 酵产物并且具有改善的细胞活力和细胞生产能力的微生物的开发。


【发明内容】

[0010] 本发明涉及用于生产醇的方法，所述方法包括：(a)提供微生物，其中所述微生物 产生醇；(b)使所述微生物与一种或多种碳源在其中醇被生产的条件下接触；（c)收集所述 微生物；（d)回收所述醇；（e)使步骤（c)的所收集的微生物与一种或多种碳源在其中醇被 生产的条件下接触；(f)重复步骤（c)-(e);以及任选地，使步骤（c)的微生物暴露于低pH 条件下。在一些实施例中，步骤（c)-(e)被重复至少10次、至少20次、至少30次、至少40 次、至少50次、至少100次、或更多次。
[0011] 本发明还涉及用于生产丁醇的方法，所述方法包括：(a)提供产丁醇菌；(b)使所 述产丁醇菌与一种或多种碳源在其中丁醇以有效收率被生产的条件下接触；（c)收集所述 产丁醇菌；（d)回收丁醇；（e)使步骤（c)的所收集的产丁醇菌与一种或多种碳源在其中丁 醇以有效收率被生产的条件下接触，并且其中所述有效收率是步骤（b)的有效收率的至少 约90% ;(f)重复步骤（c)-(e);以及任选地，使步骤（c)的所收集的产丁醇菌暴露于低pH 条件下。在一些实施例中，步骤（c)的所收集的产丁醇菌在至少约0.3%的丁醇的存在下 被暴露于小于或等于约2.0的pH的条件下至少约一小时。在一些实施例中，步骤（d)的丁 醇以至少约6g/L的浓度被回收。在一些实施例中，丁醇在步骤（e)中以一定有效收率被生 产，所述有效收率为步骤（b)中有效收率的至少约99%。在一些实施例中，步骤（c)-(e)被 重复至少10次、至少20次、至少30次、至少40次、至少50次、至少100次、或更多次。
[0012] 本发明还涉及用于改善细胞活力和生产能力的方法，包括（a)收集来自醇发酵的 微生物；以及（b)使所述微生物与富含营养物质的培养基接触。本发明涉及用于改善细胞 活力和生产能力的方法，所述方法包括（a)收集来自醇发酵的微生物；(b)使所述微生物暴 露于低PH条件下；(c)收集所述微生物；以及（d)使所收集的微生物与富含营养物质的培 养基接触。
[0013] 本文所述的本发明的另一个方法是用于生产醇的方法，所述方法包括（a)提供微 生物，其中所述微生物产生醇；(b)使所述微生物与一种或多种碳底物在其中醇被生产的 条件下接触；（c)收集所述微生物；（d)回收所述醇；（e)使步骤（c)的微生物与富含营养物 质的培养基接触；（f)收集步骤（e)的微生物；（g)使步骤（f)的微生物与一种或多种碳底 物在其中醇被生产的条件下接触；以及（h)任选地重复步骤（c)-(g)。
[0014] 本发明还涉及用于生产醇的方法，所述方法包括（a)提供微生物，其中所述微生 物产生醇；(b)使所述微生物与一种或多种碳底物在其中醇被生产的条件下接触；（c)收集 所述微生物；（d)回收所述醇；（e)使步骤（c)的微生物暴露于低pH条件下；（f)收集来自 步骤（e)的微生物；（g)使步骤⑴的微生物与富含营养物质的培养基接触；(h)收集步骤 (g)的微生物；（i)使所述微生物与一种或多种碳底物在其中醇被生产的条件下接触；以及 (j)任选地重复步骤（c) _(i)。
[0015] 在本文所述的工艺和方法的一些实施例中，使微生物与富含营养物质的培养基接 触的步骤可在有氧条件下进行。在本文所述的工艺和方法的一些实施例中，pH小于或等于 约2。在本文所述的工艺和方法的一些实施例中，pH条件可以是约2至约4。在一些实施 例中，所述微生物可暴露于PH小于或等于约2. 0的条件下至少约一小时。
[0016] 在一些实施例中，通过本文所述的工艺和方法生产的醇是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、 戊醇、和己醇。在一些实施例中，所述丁醇可以是1-丁醇、2-丁醇、2-丁酮、异丁醇、或它们 的混合物。
[0017] 在一些实施例中，所述微生物可经受细胞循环利用。在一些实施例中，所述微生物 可被循环利用至少5次。在一些实施例中，所述微生物可被循环利用至少10次。在一些实 施例中，所述微生物可在循环利用步骤中被酸洗涤。在一些实施例中，所述微生物可在循环 利用步骤之后被酸洗涤。
[0018] 在本文所述的工艺和方法的一些实施例中，与碳底物接触的步骤可在提取剂的存 在下进行。在一些实施例中，与碳底物接触的步骤可在厌氧条件下进行。在一些实施例中， 与碳底物接触的步骤可在微氧条件下进行。在一些实施例中，接触的步骤可以是第一次接 触。在一些实施例中，循环利用可在厌氧条件中进行。在一些实施例中，循环利用可在微氧 条件中进行。
[0019] 在一些实施例中，所述碳底物可选自低聚糖、多糖、单糖、以及它们的混合物。在一 些实施例中，所述碳底物可选自果糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖、蔗糖、淀粉、纤维素、原 料、乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐、甘油、玉米醪、甘蔗、生物质、C5糖例如木糖和阿拉伯糖、以及它 们的混合物。
[0020] 在一些实施例中，所述微生物可以是重组宿主细胞。在一些实施例中，所述微生 物可以是产丁醇菌。在一些实施例中，所述微生物可以是产异丁醇菌。在一些实施例中， 所述微生物可包含丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径可以是异 丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷 酸，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至 2, 3-二羟基异戊酸；（c) 2, 3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸；（d) 2-酮异戊酸至异丁醛；以及 (e)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷 酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、酮异戊酸脱羧酶、和/或 醇脱氢酶活性。
[0021] 在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径可以是异丁醇生物合成途径。在一些 实施例中，所述异丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自下列 的底物至产物的转化：（a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2, 3-二羟基异戊酸；（c) 2， 3_二羟基异戊酸至a-酮异戊酸的转化；（d) a-酮异戊酸至异丁酰-CoA的转化；（e)异丁 酰-CoA至异丁醛的转化；以及（f)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，所述异丁醇生物合 成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶活性；乙酰羟酸还原异构 酶活性；乙酰羟酸脱水酶活性；支链酮酸脱氢酶活性；醛脱氢酶活性；和/或支链醇脱氢酶 活性。
[0022] 在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径可以是1- 丁醇生物合成途径。在一些实 施例中，所述1- 丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自下列的 底物至产物的转化：（a)乙酰-CoA至乙酰乙酰-CoA的转化；(b)乙酰乙酰-CoA至3-羟丁 酰-CoA的转化；（c) 3-羟丁酰-CoA至丁烯酰-CoA的转化；（d) 丁烯酰-CoA至丁酰-CoA的 转化；（e) 丁酰-CoA至丁醛的转化；以及（f) 丁醛至1-丁醇。在一些实施例中，所述1-丁醇 生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰-CoA乙酰转移酶活性；3-羟 丁酰-CoA脱氢酶活性；巴豆酸酶活性；丁酰-CoA脱氢酶活性；丁醛脱氢酶活性、和/或丁 醇脱氢酶活性。
[0023] 在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径可以是2-丁醇生物合成途径。在一些 实施例中，所述2- 丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自下 列的底物至产物的转化：（a)丙酮酸至a-乙酰乳酸的转化；(b)a_乙酰乳酸至乙偶姻的转 化；（c)乙偶姻至3-氨基-2- 丁醇；（d) 3-氨基-2- 丁醇至磷酸-3-氨基-2- 丁醇；（e)磷 酸-3-氨基-2-丁醇至2-丁酮；和（f)_ 丁酮至2-丁醇。在一些实施例中，所述2-丁醇生 物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶活性；乙酰乳酸脱羧 酶活性；乙偶姻胺化酶活性；氨基丁醇激酶活性；磷酸氨基丁醇磷酸化酶活性；和/或丁醇 脱氢酶活性。
[0024] 在一些实施例中，所述2-丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多 肽催化选自下列的底物至产物的转化：（a)丙酮酸至a-乙酰乳酸的转化；(b) a-乙酰乳酸 至乙偶姻的转化；（c)乙偶姻至2, 3- 丁二醇的转化；（d) 2, 3- 丁二醇至2- 丁酮的转化；以 及（e)2_ 丁酮至2-丁醇。在一些实施例中，所述2-丁醇生物合成途径可包含编码多肽的 多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶活性；乙酰乳酸脱羧酶活性；丁二醇脱氢酶活性；丁 二醇脱水酶活性；和/或丁醇脱氢酶活性。
[0025] 在一些实施例中，一种或多种底物至产物的转化可利用NADH或NADPH作为辅因 子。在一些实施例中，NADH是辅因子。
[0026] 在一些实施例中，所述微生物的丁醇途径可包含至少一种多肽，所述至少一 种多肽选自具有下列酶学委员会编号的酶：EC 2. 2. 1.6、ECL1.1.86、EC 4. 2. 1.9、 EC 4. 1.1. 72、EC 1.1. 1.1、EC 1.1. 1.265、EC 1.1. 1.2、EC 1.2. 4. 4、EC 1.3.99.2、 EC 1.2. 1.57、EC 1.2. 1.10、EC 2. 6. 1.66、EC2. 6. 1.42、EC 1.4. 1.9、EC 1.4. 1.8、 EC 4. LI. 14、EC 2. 6. 1.18、EC 2. 3. 1.9、EC 2. 3. 1.16、EC 1.1. 130、EC 1.1. 1.35、EC I. I. 1. 157、EC 1.1. 1.36、EC4. 2. 1.17、EC 4. 2. 1.55、EC 1.3. 1.44、EC 1.3. 1.38、EC 5. 4. 99. 13、EC4. I. 1. 5、EC 2. 7. 1. 29、EC I. I. 1. 76、EC 1. 2. 1. 57、和 EC 4. 2. 1. 28。
[0027] 在一些实施例中，所述微生物的工程化的丁醇途径可包含至少一种选自下列一组 酶的多肽：乙酰乳酸合酶、乙酰羟酸异构还原酶、乙酰羟酸脱水酶、支链a-酮酸脱羧酶、支 链醇脱氢酶、酰化醛脱氢酶、支链酮酸脱氢酶、丁酰-CoA脱氢酶、丁醛脱氢酶、转氨酶、缬氨 酸脱氢酶、缬氨酸脱羧酶、W-转氨酶、乙酰-CoA乙酰转移酶、3-羟丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸 酶、丁酰-CoA脱氢酶、异丁酰-CoA变位酶、乙酰乳酸脱羧酶、乙偶姻胺化酶、丁醇脱氢酶、丁 醛脱氢酶、乙偶姻激酶、磷酸乙偶姻胺化酶、磷酸氨基丁醇磷酸化酶、氨基丁醇激酶、丁二醇 脱氢酶、和丁二醇脱水酶。
[0028] 在一些实施例中，所述微生物或产丁醇菌可包含一种或多种改变了cAMP信号转 导途径的一种或多种组分的表达和/或活性的修饰。在一些实施例中，所述微生物或产丁 醇菌可包含一种或多种改变了一种或多种磷酸二酯酶的表达和/或活性的修饰。在一些实 施例中，所述微生物或产丁醇菌可包含被降低的或被除去的磷酸二酯酶和/或磷酸二酯酶 活性。在一些实施例中，所述微生物或产丁醇菌可包含编码具有磷酸二酯酶活性的多肽的 多核苷酸中的修饰。在一些实施例中，所述微生物或产丁醇菌可在编码具有磷酸二酯酶活 性的多肽的内源性多核苷酸中包含插入、缺失、突变、和/或取代。在一些实施例中，具有磷 酸二酯酶活性的多肽可对应于酶学委员会编号EC 3. 1.4. 17。在一些实施例中，具有磷酸二 酯酶活性的多肽可以是I3DE1。
[0029] 在一些实施例中，所述微生物或产丁醇菌不表达丙酮酸脱羧酶或具有降低的所述 丙酮酸脱羧酶的表达。在一些实施例中，所述表达的降低是编码丙酮酸脱羧酶的基因的插 入、缺失、突变、和/或取代的结果。在一些实施例中，所述微生物或产丁醇菌可包含编码具 有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸中的修饰。在一些实施例中，所述微生物或产丁醇 菌可在编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性多核苷酸中包含插入、缺失、突变、和/ 或取代。在一些实施例中，具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽可选自：?0(：1、^^5、？006、以及它 们的组合。在一些实施例中，编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性多核苷酸可选自： PDC1、PDC5、PDC6、以及它们的组合。
[0030] 在一些实施例中，所述微生物或产丁醇菌不表达3-磷酸甘油醛脱氢酶或具有降 低的所述3-磷酸甘油醛脱氢酶的表达。在一些实施例中，所述表达的降低是编码3-磷酸 甘油醛脱氢酶的基因的插入、缺失、突变、和/或取代的结果。在一些实施例中，所述微生物 或产丁醇菌不表达BDHl或具有降低的所述BDHl的表达。在一些实施例中，所述表达的降 低是编码BDHl的基因的插入、缺失、突变、和/或取代的结果。在一些实施例中，所述微生 物或产丁醇菌不表达编码乙酰乳酸还原酶的基因或具有降低的所述编码乙酰乳酸还原酶 的基因的表达。在一些实施例中，所述表达的降低是编码YMR226C的基因的插入、缺失、突 变、和/或取代的结果。
[0031] 在一些实施例中，所述微生物或产丁醇菌可以是酵母细胞。在一些实施例中， 所述酵母细胞可以是选自下列的酵母属的成员：酵母属（Saccharomyces)、裂殖酵母属 (Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属（Hansenula)、假丝酵母属（Candida)、克鲁维酵母 属（Kluyveromyces)、耶氏酵母属（Yarrowia)、伊萨酵母属（Issatchenkia)、和毕赤酵母属 (Pichia)。在一些实施例中，所述微生物可以是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)。
[0032] 本发明还涉及包含如本文所述的微生物或产丁醇菌的组合物。在一些实施例中， 所述组合物还包含富含营养物质的培养基。在一些实施例中，所述组合物可具有小于或等 于约2的pH。在一些实施例中，所述组合物可具有约2至约4的pH。

【专利附图】

【附图说明】
[0033] 图1示出了菌株PNY860的四分平板。孢子活力如下：4+:0-，n=15 ;3+:l-，n= 2 ;2+ :2_，n = 1 ;1+ :3_，n = 0 ;0+ :4_，n = 0?活力和菌落大小是一定程度上可变的，但没 有微菌落。
[0034]图2示出了来自对4个菌落的接合型分析的PCR产物的琼脂糖凝胶，这些菌落来 自是PNY860的孢子子代的2个四分体。泳道1是PNY860。泳道2是PNY860-1A。泳道3 是 PNY860-1B。泳道 4 是 PNY860-1C。泳道 5 是 PNY860-1D。泳道 6 是 PNY860-2A。泳道 7 是 PNY860-2B。泳道 8 是 PNY860-2C。泳道 9 是 PNY860-2D。
[0035] 图3示出了不同的异丁醇生物合成途径。标记为"a"、"b"、"C"、"d"、"e"、"f"、 " g"、"h"、"〗"、"r、和"k"的步骤代表下述的底物至产物的转化。例如，" a"可被乙酰乳酸 合酶催化；"b"可被，例如，乙酰羟酸还原异构酶催化；"c"可被，例如，乙酰羟酸脱水酶催 化；"d"可被，例如，支链酮酸脱羧酶催化；"e"可被，例如，支链醇脱氢酶催化；"f"可被， 例如，支链酮酸脱氢酶催化；"g"可被，例如，乙酰化醛脱氢酶催化；"h"可被，例如，转氨酶 或缬氨酸脱氢酶催化；"i"可被，例如，缬氨酸脱羧酶催化；"j"可被，例如，w转氨酶催化； 以及"k"可被，例如，异丁酰-CoA变位酶催化。
[0036] 图4示出了 1-丁醇生物合成途径。标记为"&"、％"、"(："、"(1"、"6"、和"广的步骤 代表下述的底物至产物的转化。例如，"a"可被乙酰-CoA乙酰基转移酶催化；"b"可被，例 如，3-羟丁酰-CoA脱氢酶催化；"c"可被，例如，巴豆酸酶催化；"d"可被，例如，丁酰-CoA 脱氢酶催化；"e"可被，例如，丁醛脱氢酶催化；以及"f"可被，例如，丁醇脱氢酶催化。
[0037] 图5示出了 2- 丁醇和2- 丁酮生物合成途径。

【具体实施方式】
[0038] 本发明涉及生产发酵产物的微生物，以及在有利的经济的工艺条件下以高的速率 和滴度生产诸如丁醇的发酵产物的优化。
[0039] 在醇类的发酵生产过程中，微生物可能经受多种胁迫条件，包括，例如，醇的毒性、 氧化胁迫、渗透胁迫、以及pH、温度、和营养物质可用性的波动。这些胁迫条件的影响可导致 细胞生长的抑制和降低的细胞活力，这能够最终导致发酵生产能力和产物收率的降低。通 过调整微生物的代谢过程适应这些胁迫条件的能力，对于维持有效的醇类生产是有利的。 例如，当暴露于特定胁迫剂时，通过修饰某些代谢过程，诸如生长、信号转导、转录、和/或 翻译后活性，微生物可响应这些胁迫条件。
[0040] 在酵母中，3' -5'-环腺苷单磷酸（cAMP)信号转导途径是细胞的生长和增殖、 对营养物质可用性的响应、细胞周期进行、代谢和形态发生、细胞防御、和胁迫响应的关键 调节子。在正常条件下，诸如葡萄糖的激动剂经由G蛋白偶联的受体途径激活腺苷酸环化 酶，导致提高的cAMP水平，这继而激活蛋白激酶A(PKA)(即，cAMP结合PKA的调节亚基）， 并最终导致由例如Msn2p/Msn4p和Yaplp介导的胁迫响应的抑制。在胁迫条件下，cAMP的 水平经由Ras/cAMP途径被下调，而cAMP的这些较低的水平导致对胁迫响应的抑制的释放。 因此，控制cAMP水平在酵母中对于细胞的胁迫耐受性是重要的。
[0041] Ras/cAMP途径参与多种胁迫响应，并因此是酵母中胁迫抗性的主要决定子。例如， Ras/cAMP途径参与细胞对渗透胁迫、高渗胁迫、和冻融的响应的调控（Park,等人Biochem. Biophys. Res. Comm. 327 :311_319, 2005)。
[0042] cAMP的水平受其通过腺苷酸环化酶活性的合成和其通过被环核苷酸磷酸二酯酶 (F 1DE)水解的降解的调控。两种磷酸二酯酶，F1DEl和F1DEZ,已在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)中被鉴定（Nikawa，等人 Mol. Cell. Biol. 7(10) :3629-3636,1987)。PDEl 是低 亲和力的cAMP磷酸二酯酶，而TOE2是高亲和力的cAMP磷酸二酯酶。PDEl已被显示通过 水解cAMP (这导致PKA的抑制）而在激动剂诱导的cAMP信号作用（例如，瞬时的，适应条 件）的下调中起作用。I3DEl活性是受PKA介导的磷酸化调控的，S卩，I 3DEl被PKA磷酸化导 致提高的磷酸二酯酶活性（Ma，等人Mol. Biol. Cell 10:91-104,1999)。因此，通过PDEl的 破坏对cAMP水平和PKA活性的调节可为控制酵母中的胁迫耐受性的有效方法。
[0043] 随着对可持续的生物燃料作为替代性能源的重新关注和对开发有效的和对环境 友好的生产方法的期望，使用发酵工艺生产醇是替代当前的合成工艺的可行选项。然而，一 些以特定收率生产醇（例如，乙醇、丁醇）的微生物还具有低的醇毒性阈值。因此，用于醇 的商业生产的发酵工艺的开发受到醇的毒性的限制。如上文所述，醇的毒性能够在微生物 中产生胁迫响应，导致，例如，细胞生长的抑制和细胞活力的降低。
[0044] 本发明涉及具有改善的细胞活力和/或提高的醇的耐受性的微生物。在一些实施 例中，通过使cAMP信号转导途径的一种或多种组分的表达和/或活性改变的一种或多种修 饰，微生物可被工程化，以表现出改善的细胞活力和/或提高的醇的耐受性。在一些实施例 中，cAMP信号转导途径的一种或多种组分可以是磷酸二酯酶。在一些实施例中，所述磷酸 二酯酶可以是PDEl。
[0045] 在一些实施例中，使表达和/或活性改变的一种或多种修饰可以是编码cAMP信号 传导途径的一种或多种组分的一种或多种内源性基因的表达的消除或降低。在一些实施例 中，使表达和/或活性改变的修饰可以是编码磷酸二酯酶的内源性基因的表达的消除或降 低。在一些实施例中，使表达和/或活性改变的修饰可以是编码I 3DEl的内源性基因的表达 的消除或降低。
[0046] 在一些实施例中，微生物可包含一种或多种改变了 cAMP信号转导途径的一种或 多种组分的表达和/或活性的修饰。在一些实施例中，微生物可包含一种或多种改变了一 种或多种磷酸二酯酶的表达和/或活性的修饰。在一些实施例中，微生物可包含一种或多 种改变了 I3DEl的表达和/或活性的修饰。
[0047] 在一些实施例中，微生物可包含使编码cAMP信号传导途径的一种或多种组分的 一种或多种内源性基因的表达消除或降低的一种或多种修饰。在一些实施例中，微生物可 包含使编码磷酸二酯酶的内源性基因的表达消除或降低的一种或多种修饰。在一些实施例 中，微生物可包含使编码I 3DEl的内源性基因的表达消除或降低的一种或多种修饰。在一些 实施例中，微生物可包含消除或降低磷酸二酯酶的活性的一种或多种修饰。在一些实施例 中，微生物可包含消除或降低I 3DEl的活性的一种或多种修饰。
[0048] 在一些实施例中，微生物可包含一种或多种改变了 cAMP信号转导途径的一种或 多种组分和丁醇生物合成途径的表达和/或活性的修饰。在一些实施例中，微生物可包含 一种或多种改变了一种或多种磷酸二酯酶和丁醇生物合成途径的表达和/或活性的修饰。 在一些实施例中，微生物可包含一种或多种改变了 I3DEl和丁醇生物合成途径的表达和/或 活性的修饰。在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径可以是1-丁醇生物合成途径、2-丁 醇生物合成途径、2-丁酮生物合成途径、或异丁醇生物合成途径。
[0049] 在一些实施例中，微生物可包含使编码cAMP信号传导途径和丁醇生物合成途径 的一种或多种组分的一种或多种内源性基因的表达消除或降低的一种或多种修饰。在一些 实施例中，微生物可包含一种或多种使编码磷酸二酯酶和丁醇生物合成途径的内源性基因 的表达消除或降低的修饰。在一些实施例中，微生物可包含一种或多种使编码I3DEl和丁 醇生物合成途径的内源性基因的表达消除或降低的修饰。在一些实施例中，微生物可包含 一种或多种使磷酸二酯酶和丁醇生物合成途径的活性消除或降低的修饰。在一些实施例 中，微生物可包含一种或多种使I3DEl和丁醇生物合成途径的活性消除或降低的修饰。在一 些实施例中，所述丁醇生物合成途径可以是1-丁醇生物合成途径、2-丁醇生物合成途径、 2_丁酮生物合成途径、或异丁醇生物合成途径。
[0050] 本发明涉及包含本文所提供的微生物的组合物。例如，在一些实施例中，组合物可 包含包含了一种或多种改变了cAMP信号转导途径的一种或多种组分的表达和/或活性的 修饰的微生物。在一些实施例中，组合物可包含包含了一种或多种改变了一种或多种磷酸 二酯酶的表达和/或活性的修饰的微生物。在一些实施例中，组合物可包含包含了一种或 多种改变了I3DEl的表达和/或活性的修饰的微生物。
[0051] 在一些实施例中，组合物可包含包含了一种或多种改变了cAMP信号转导途径的 一种或多种组分和丁醇生物合成途径的表达和/或活性的修饰的微生物。在一些实施例 中，组合物可包含包含了一种或多种改变了一种或多种磷酸二酯酶和丁醇生物合成途径的 表达和/或活性的修饰的微生物。在一些实施例中，组合物可包含包含了一种或多种改变 了I3DEl和丁醇生物合成途径的表达和/或活性的修饰的微生物。在一些实施例中，所述 丁醇生物合成途径可以是1-丁醇生物合成途径、2-丁醇生物合成途径、2-丁酮生物合成途 径、或异丁醇生物合成途径。
[0052] 在一些实施例中，所述微生物表现出与亲本细胞相比提高的醇类生产。在一些实 施例中，醇类的生产可通过测量被确定，例如测量：液体培养基滴度（每升液体培养基生产 的醇类克数）、醇类收率（每克消耗的底物生产的醇类克数）、体积生产能力（每升每小时 生产的醇类克数）、特异性生产能力（每克重组细胞生物质每小时生产的醇类克数）、或它 们的组合。
[0053] 本发明还涉及在醇类的发酵中改善和/或维持微生物的细胞生长和细胞活力的 方法。在一些实施例中，所述方法包括获得微生物（例如，亲本细胞）并引入使cAMP信号转 导途径的一种或多种组分的表达和/或活性改变的修饰。在一些实施例中，所述方法包括 获得微生物并引入使编码cAMP信号传导途径的一种或多种组分的一种或多种内源性基因 的表达消除或降低的一种或多种修饰。在一些实施例中，所述方法包括获得微生物并引入 使编码磷酸二酯酶的一种或多种内源性基因的表达消除或降低的一种或多种修饰。在一些 实施例中，所述方法包括获得微生物并引入使编TOEl的内源性基因的表达消除或降低的 一种或多种修饰。在一些实施例中，所述方法包括获得微生物并引入使磷酸二酯酶的活性 消除或降低的一种或多种修饰。在一些实施例中，所述方法包括获得微生物并引入使PDEl 的活性消除或降低的一种或多种修饰。
[0054] 本发明还涉及通过发酵方法生产醇的方法。在一些实施例中，所述方法包括在其 中醇被生产的条件下培养本文所提供的微生物并回收醇类。在一些实施例中，所述醇可以 是丁醇。在一些实施例中，所述醇可以是1-丁醇、2-丁醇、2-丁酮、异丁醇、或叔丁醇。
[0055] 在发酵过程中，微生物污染可以是一个问题。例如，细菌可经由原料被引入发酵过 程。由于细菌易于比酵母更快地分裂，这能够导致显著水平的微生物污染。此外，可采用细 胞的循环利用以改善发酵工艺的效率。例如，通过将酵母重新引入发酵容器（或发酵罐） 中，发酵容器内的酵母浓度被持续维持在高水平，而没有使糖类离开所期望的发酵产物的 生产而显著地转向细胞的生长。细胞的循环利用可被用于提高体积转化率。通过从收获的 发酵液持续地分离酵母（诸如通过离心），然后将酵母再循环至发酵罐，能够实现可发酵的 糖类至丁醇的体积转化率的提高。然而，由于如此重复地再循环利用酵母，非期望的微生物 诸如细菌，也可与酵母一起被再循环。这些微生物污染物能够竞争营养物质，而营养物质的 耗竭可抑制酵母细胞的生长。此外，微生物污染物能够抑制酵母的代谢。例如，微生物可产 生对细胞活力具有负面影响的代谢物，并可导致发酵产物收率的降低。
[0056] 对发酵工艺中微生物污染的控制可通过对细胞悬浮液的酸洗涤进行。酸处理的一 个目的是消灭不能承受低PH条件的污染性微生物，而基本不降低细胞活力或发酵能力。然 而，PH条件的改变能够在微生物中产生胁迫响应，导致细胞生长的抑制和细胞活力的降低。 本发明涉及在低PH条件的存在下具有改善的细胞活力的微生物，以及通过发酵工艺生产 醇的方法，其中所述方法包括循环利用所述微生物和对微生物悬浮液进行酸洗涤的步骤。 例如，所述方法可包括（a)提供微生物，（b)使所述微生物与一种或多种碳底物在其中醇被 生产的条件下接触；（c)收集所述微生物；（d)回收所述醇；（e)使所收集的微生物与一种 或多种碳底物在其中醇被生产的条件下接触；以及（f)使所述微生物暴露于低PH条件下。 在一些实施例中，步骤（c)-(e)可被重复。
[0057] 经受酸处理和/或细胞循环利用的微生物可能具有细胞活力和生产能力的损失。 为了维持微生物的细胞活力和生产能力，可通过添加富含营养物质的培养基并在富含营养 物质的培养基中温育微生物一段时间，使所述微生物恢复活力。在恢复活力阶段之后，可通 过例如离心收集微生物，并重悬在新鲜的生产培养基中，用于继续发酵。
[0058] 本发明还涉及使微生物恢复活力以用于醇类发酵的方法。在恢复活力之后，微生 物可被再循环至发酵过程中。在一些实施例中，所述方法包括（a)提供微生物，（b)使所 述微生物与一种或多种碳底物在其中醇被生产的条件下接触；（c)收集所述微生物；（d)回 收所述醇；（e)使所述微生物与富含营养物质的培养基接触；（f)收集来自步骤（e)的微生 物；以及（g)使所述微生物与一种或多种碳底物在其中醇被生产的条件下接触。在一些实 施例中，步骤（c)-(g)可被重复。在一些实施例中，与碳底物的第一次接触在提取剂的存在 下发生。在一些实施例中，提取剂可被包括在，例如，步骤（b)和（g)中。
[0059] 在一些实施例中，所述方法包括（a)提供微生物，（b)使所述微生物与一种或多种 碳底物在其中醇被生产的条件下接触；(C)收集所述微生物；（d)使所收集的微生物暴露于 低PH条件下；（e)收集步骤（d)的微生物；（f)使步骤（e)的微生物与富含营养物质的培养 基接触；（g)收集步骤（f)的微生物；以及（h)使步骤（g)的微生物与一种或多种碳底物在 其中醇被生产的条件下接触；在一些实施例中，步骤（c)-(h)可被重复。在一些实施例中， 所述方法还包括回收醇类的步骤。在一些实施例中，与碳底物的第一次接触在提取剂的存 在下发生。
[0060] 除非另行定义，否则本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技 术人员通常理解的一样。如发生矛盾，以本专利申请（包括其定义）为准。此外，除非上下 文另有所需，单数术语将包括复数并且复数术语将包括单数。为所有目的，所有的出版物、 专利、以及本文提及的其它参考资料均全文以引用方式并入本文。
[0061] 为了进一步限定本发明，本文提供了以下术语和定义。
[0062] 如本文所用，术语"包含"、"包括"、"具有"、"含有"或它们的任何其它变型将被理 解为是指包括指定的整数或整数组但不排除任何其它整数或整数组。例如，包含一系列元 素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而能够包括其它未明确 列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非另外特 别说明，否则"或"是指包含性的或，而不是指排它性的或。例如，以下中任一者均满足条件 A或B :A是真的（或存在的）且B是假的（或不存在的）、A是假的（或不存在的）且B是 真的（或存在的）、以及A和B都是真的（或存在的）。
[0063] 如本文所用，术语"由1/4组成"、或变型如"由1/4构成"或"包括"，如本说明书和 权利要求通篇所使用的，表示任何所列举的整数或整数的组的涵盖，但是没有附加的整数 或整数的组可被添加至所指定的方法、结构、或组合物。
[0064] 如本文所用，如整个说明书和权利要求中所使用的，术语"基本上由...组成"或 诸如"基本上由...组成"的不同时态的变型表明包括任何所列举的整数或整数的组，并且 任选地包括未在实质上改变指定的方法、结构或组合物的基本或新颖特性的任何所列举的 整数或整数的组（参见，例如，M. P. E. P. § 2111. 03)。
[0065] 同样，涉及元素或组分实例（即次数）的数目在本发明元素或组分前的不定冠词 "一个"或"一种"旨在是非限制性的。因此，应将"一个"或"一种"理解为包括一个或至少 一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
[0066] 如本文所用，术语"发明"或"本发明"为非限制性术语，并且不旨在意指本发明的 任何单独实施例，而是涵盖如专利申请所述的所有可能的实施例。
[0067] 如本文所用，修饰本发明的成分或反应物的量使用的术语"约"是指可以通过例如 以下方式而发生的用数字表示的量的变化：在真实世界中用于产生浓缩物或溶液的一般测 量和液体处理操作；通过这些操作中非故意的误差；用于制备组合物或执行方法的成分的 制造、来源或纯度中的差异；等。术语"约"还包括由于产生自特定起始混合物的组合物的 不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语"约"来修饰，权利要求包括量的等同量。在 一个实施例中，术语"约"指在报告数值的10%范围内，优选在报告数值的5%范围内。 [0068] 在一些情况下，如本文所用，"生物质"是指产生发酵产物的微生物的细胞生物质， 通常以g/L干细胞重量（dew)的单位提供。
[0069] 术语"发酵产物"包括所关注的任何所期望的产物，包括但不限于醇类（例如，低 级烷基醇）诸如乙醇和丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、富马酸、苹 果酸、衣康酸、1，3-丙烷-二醇、乙烯、甘油、异丁酸盐等。
[0070] 术语"醇"是指能够在发酵过程中由微生物产生的任何醇。醇包括具有1-10个碳 原子的任何直链或支化的、饱和或不饱和的醇分子（例如，低级烷基醇）。例如，醇包括甲 醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、和己醇。
[0071] 术语"丁醇"是指1-丁醇、2-丁醇、2-丁酮、异丁醇、叔丁醇、或它们的混合物。异 丁醇也被称为2-甲基-1-丙醇。
[0072] 如本文所用，术语"丁醇生物合成途径"是指产生1-丁醇、2-丁醇、2-丁酮、或异丁 醇的酶途径。例如，异丁醇生物合成途径在美国专利公开申请公布2007/0092957中公开， 该专利以引用方式并入本文。
[0073] 术语"异丁醇生物合成途径"是指生产异丁醇的酶途径。有时，"异丁醇生物合成 途径"与"异丁醇生产途径"同义地被使用。
[0074] 如本文所用，术语"1-丁醇生物合成途径"是指产生1-丁醇的酶途径。
[0075] 如本文所用，术语"2-丁醇生物合成途径"是指产生2-丁醇的酶途径。
[0076] 如本文所用，术语"2- 丁酮生物合成途径"是指产生2- 丁酮的酶途径。
[0077] 如本文所用，术语"提取剂"是指可用于从发酵液中提取醇的一种或多种溶剂。在 一些实施例中，所述溶剂可以是有机溶剂。
[0078] "重组宿主细胞"被定义为经过遗传学操作以表达生物合成生产途径的宿主细胞， 其中该宿主细胞以相对于未经修饰的宿主细胞更高的量产生生物合成产物，或产生未经修 饰的宿主细胞通常不产生的生物合成产物。术语"重组微生物宿主细胞"可与术语"重组宿 主细胞"可互换地使用。
[0079] 术语"可发酵的碳底物"是指能被微生物代谢的碳源，所述微生物诸如本文所公开 的那些。适宜的可发酵的碳底物包括但不限于单糖，诸如葡萄糖或果糖；二糖诸如乳糖或蔗 糖；低聚糖；多糖诸如淀粉、纤维素、木质纤维素、或半纤维素；一碳底物；脂肪酸；或它们的 组合。
[0080] 术语"磷酸二酯酶"是指具有催化磷酸二酯键的水解的酶活性的多肽（或多种多 肽）。例如，磷酸二酯酶水解环核苷酸，3' -5'-环腺苷单磷酸（cAMP)和3' -5'-环 鸟苷单磷酸（cGMP)。所述酶作为EC 3. 1.4. 17是已知的并且是可用的，例如，来自酿 酒酵母（Saccharomyces cerevistae) (GenBank No :CAA64139、CAA96968)、奇异酵母 (Saccharomyces paradoxus) (Gen Bank ID AABYO1000014)、米卡塔酵母（Saccharomyces mikatae) (AABZ01000018、AACHO1000636)、库德里阿兹威酵母（Saccharomyces kurdriavzevii)(AACI02000304)、贝酵母（Saccharomyces bayanus)(AACA01000014)、 Vanderwaltozyma polyspora(XM001642700、AAXN01000222、NZ_AAZN01000222)、鲁氏接合 酵母（Zygosaccharomyces rouxii) (NC012994)。
[0081] 如本文所用，术语"发酵培养基"是指任何的下列的混合物：水、糖类（可发酵的碳 底物）、溶解的固体、悬浮的固体、产生发酵产物的微生物、发酵产物、以及发酵容器中容纳 的材料的全部其他组分，在所述发酵容器中，由所存在的微生物通过可发酵的碳底物至发 酵产物、水和二氧化碳（CO2)的反应产生发酵产物。有时，如本文所用，术语"发酵液"和"发 酵混合物"可与"发酵培养基"同义地使用。
[0082] 如本文所用，术语"有氧条件"是指存在氧气的生长条件。
[0083] 如本文所用，术语"微氧条件"是指具有低水平的溶解氧的生长条件。例如，氧气 水平可以是小于空气饱和度的约1%。
[0084] 如本文所用，术语"厌氧条件"是指不存在氧气的生长条件。应当理解，在许多发 酵过程中，在过程开始时存在初始量的氧气，但这些氧气随着发酵的进程被耗竭，使得大部 分的过程是在可检测的氧气的不存在下进行的。
[0085] 术语"碳底物"是指能够被本文所公开的微生物代谢的碳源。本文提供了碳底物 的非限制性例子，包括但不限于单糖、寡糖、多糖、乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐、甘油、二氧化碳、 甲醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、右旋糖、以及它们的混合物。
[0086] 如本文所用，术语"产丁醇菌"和"产异丁醇菌"分别是指能够产生丁醇或异丁醇 的微生物。
[0087] 如本文所用，术语"利用蔗糖的产异丁醇菌"是指能够从蔗糖产生异丁醇的微生 物。此类微生物通常是包含工程化的异丁醇生物合成途径的重组微生物。
[0088]如本文所用，术语"收率"指以g/g表示的产物量/碳源量。可将收率例示为用葡 萄糖作为碳源。应当理解，除非另外指明，将收率表达为理论收率的百分比。对于微生物或 代谢途径，将"理论收率"定义为每个底物总量能够产生的产物最大量，所述最大量通过用 于制备所述产物的代谢途径的化学计量而决定。例如，一种典型的葡萄糖至异丙醇的转化 的理论收率是0. 33g/g。如此，29. 7g/g的从葡萄糖至异丙醇的收率将被表达为理论收率的 90%或90%理论收率。应当理解，虽然在本公开中将收率例示为用葡萄糖作为碳源，本发明 能够应用于其他碳源并且所述收率可能取决于使用的碳源而变化。本领域的技术人员能够 计算不同碳源的收率。
[0089]如本文所用，术语"有效滴度"是指每升发酵培养基通过发酵产生的醇的总量。醇 的总量包括：（i)发酵培养基中的醇的量；（ii)从有机提取剂回收的醇的量；以及（iii)如 果利用气提，从气相回收的醇的量。
[0090] 如本文所用，术语"有效速率"是指每小时的发酵每升发酵培养基通过发酵生产的 醇的总量。
[0091] 如本文所用，术语"有效收率"是指发酵期间由本文所述的微生物消耗每单位可发 酵的碳底物产生的醇的量。
[0092] 如本文所用，术语"特异性生产能力"是指细胞的每克干细胞重量每单位时间产生 的醇的克数。
[0093]术语"衍生物"和"类似物"是指不同于本发明的酶，但保留了它们的基本特性的多 肽。术语"衍生物"还可指不同于本发明的宿主细胞，但保留了它们的基本特性的宿主细胞。 一般来讲，衍生物和类似物与本发明的酶是总体上非常相似的，并且在许多区是相同的。术 语"来源于"、"衍生物"、和"类似物"当指本发明的酶时包括保留了所对应的天然多肽的活 性或其催化域的活性的至少一些的任何多肽。
[0094] 本文所公开的酶的衍生物是经过改变以表现出未见于天然多肽的特征的多肽。衍 生物能够通过取代（例如氨基酸取代）、化学的、酶学的、或其他适合的方法被天然存在的 氨基酸之外的部分（例如，可检测的部分诸如酶或放射性同位素）共价地修饰。衍生物的 例子包括融合蛋白、或基于天然存在的蛋白质序列但已被改变的蛋白质。例如，蛋白质能够 通过关于特定氨基酸序列、和/或特定二级、三级、和/或四级结构的知识而被设计。衍生 物包括基于对天然的或合成的在先的序列（其随后被任选地修饰，经常但并不一定地赋予 一些改善的功能）的知识被修饰的蛋白质。如此，这些序列或蛋白质被称为来源于特定蛋 白质或氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，衍生物可保留与该衍生物所"来源于"的序 列至少约50 %的同一性、至少约60 %的同一性、至少约70 %的同一性、至少约80 %的同一 性、至少约90 %的同一性、至少约95 %的同一性、至少约97 %的同一性、或至少约99 %的同 一性。在本发明的一些实施例中，如果使用分子遗传技术将酶的部分或全部的DNA序列扩 增并置于新的宿主细胞内，则该酶被称为来源于天然存在于特定物种中的酶。
[0095]多妝和多核苷酸
[0096]如本文所用，术语"多肽"旨在涵盖单数的"多肽"以及复数的"多肽"，并指由单体 (氨基酸）通过酰胺键（也被称为肽键）线性连接组成的分子。术语"多肽"是指任何两个 或更多个氨基酸的链，并且不涉及产物的特定长度。因此，定义"多肽"包括用于指两个或 更多个氨基酸的单链或多链的肽、二肽、三肽、低聚肽、"蛋白质、" "氨基酸链、"或任何其他 术语，并且术语"多肽"可用于取代任何这些术语或与它们互换使用。一条多肽可来源于天 然生物源或由重组技术产生，但不一定是由一条指定的核酸序列翻译的。它可由任何方式 生成，包括通过化学合成。用于本发明中的多肽包括全长的多肽和它们的片段。
[0097] 如本文所用，"降低的活性"或"降低的表达"是指与导致活性或表达的降低的变化 之前多肽的相同的生物学活性或表达相比，多肽的已知的生物学活性或表达的任何可测量 的降低。此类变化能够包括多肽或编码多肽的多核苷酸的修饰，如本文所述。本文所公开 的多肽的降低的活性或表达能够通过本领域所熟知的和本文所公开的方法测定。
[0098] 如本文所用，"被除去的活性"或"被除去的表达"是指与导致活性或表达的除去的 变化之前多肽的相同的生物学活性或表达相比，多肽的已知的生物学活性或表达的除去。 此类变化能够包括多肽或编码多肽的多核苷酸的修饰，如本文所述。被除去的活性或表达 包括与导致活性或表达的除去的变化之前多肽的相同的生物学活性或表达相比，不可测量 的多肽的生物学活性或表达。本文所公开的多肽的被除去的活性或表达能够通过本领域所 熟知的和本文所公开的方法测定。
[0099]如本文所用，"升高的活性"或"升高的表达"是指与导致活性或表达的升高的变化 之前多肽的相同的生物学活性或表达相比，多肽的已知的生物学活性或表达的任何可测量 的升高。此类变化能够包括多肽或编码多肽的多核苷酸的修饰，如本文所述。本文所公开 的多肽的升高的活性或表达能够通过本领域所熟知的和本文所公开的方法测定。
[0100] "分离的"多肽或其片段、变体、或衍生物，是指不在其天然环境下的多肽。不需要 特别的纯化水平。例如，分离的多肽能够从它原生的或天然的环境中去除。为了本发明的 目的，在宿主细胞中重组产生的多肽和表达的蛋白质被认为是分离的，即为天然的或重组 的多肽，其已通过任何适合的技术被分离、分馏、或部分地或充分地纯化。
[0101]本发明的多肽可具有约 10 ;20 ;25 ;50 ;75 ;100 ;200 ;500 ;1，000 ;2,000 ;或更多 个氨基酸的大小。多肽可具有限定的三维结构，但是它们不一定具有此类结构。具有限定 的三维结构的多肽称为折叠多肽，并且不具有限定三维结构，而是可能采用多种不同构象 的多肽称为非折叠多肽。
[0102] 本发明的多肽也包括前述多肽的衍生物、类似物、或变体，以及它们的任何组合。 术语"活性变体"、"活性片段"、"活性衍生物"、和"类似物"是指本发明的多肽。本发明多肽 的变体包括具有由于氨基酸的取代、缺失和/或插入导致的修改的氨基酸序列的多肽。变 体可为天然存在的或非天然存在的。非天然存在的变体可使用本领域已知的诱变技术产 生。变体多肽可包含保守的或非保守的氨基酸取代、缺失、和/或添加。本发明多肽的衍生 物可以是经过修改以表现出天然多肽不存在的附加特性的多肽。例子包括融合蛋白。变体 多肽本文也可称为"多肽类似物。如本文所用，多肽的"衍生物"指具有一个或多个通过功 能侧基反应化学衍生化的残基的目的多肽。"衍生物"也包括包含一个或多个天然存在的 氨基酸（二十个标准氨基酸）衍生物的那些肽。例如，可将4-羟脯氨酸取代成脯氨酸；可 将5-羟赖氨酸取代成赖氨酸；可将3-甲基组氨酸取代成组氨酸；可将高丝氨酸取代成丝 氨酸；并且可将鸟氨酸取代成赖氨酸。
[0103] "片段"是本发明中所用的多肽或其他酶的独特部分，其与亲本全长序列相比序列 相同但长度更短。片段可包含至多减去一个氨基酸残基的全长指定序列。例如，片段可包 含约5个至约1000个连续的氨基酸残基。片段的长度可以是至少5个、至少10个、至少15 个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少75个、至少 100个、至少150个、至少250、或至少500个连续的氨基酸残基。片段可优选选自分子的某 些区。例如，多肽片段可包含某一长度的连续的氨基酸，其选自多肽前100个或200个氨基 酸，如某些限定序列所示。清楚地是，这些长度是示例性的，并且本实施例包括由本说明书 (包括序列表、表和图）支持的任何长度。
[0104] 作为另外一种选择，编码这些相同或相似多肽的重组变体可通过利用基因编码中 的"冗余"来合成或选择。可将多个密码子取代诸如产生多个限制性位点的沉默改变引入， 以将克隆优化到质粒或病毒载体中或在宿主细胞体系中表达。
[0105] 氨基酸"取代"可以是一个氨基酸替换为另一个具有相似结构和/或化学性质的 氨基酸的结果，即，保守的氨基酸替换，或者可以是一个氨基酸替换为另一个具有不同结构 和/或化学性质的氨基酸的结果，即，非保守的氨基酸替换。"保守"氨基酸取代可基于所涉 及的残基在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质上的相似性进行。例如， 非极性（疏水性）氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸 和甲硫氨酸；极性的中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺 和谷氨酰胺；带正电的（碱性）氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；而带负电的（酸性） 氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。作为另外一种选择，"非保守的"氨基酸取代可以通过选择 任何这些氨基酸在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、或两亲性性质方面的差异实现。"插 入"或"缺失"可以在约1个至约20个氨基酸的范围内，更优选地在约1个至约10个氨基 酸的范围内。通过系统地利用重组DNA技术产生多肽分子中的氨基酸的插入、缺失、或取 代，并检测所得重组变体的活性，可以以实验方法确定所允许的变型。
[0106] 如本文所用，术语"变体"（关于多肽）是指使用例如重组DNA技术诸如诱变生成 的，通过氨基酸插入、缺失、突变、和取代而与本发明专门列举的多肽不同的多肽。通过将特 定多肽的序列与同源的多肽（例如酵母或细菌的）的序列进行比较，并使高度同源区（保 守区）中进行的氨基酸序列改变的数量最小化，或通过用共有序列代替氨基酸，可以发现 用以确定哪些氨基酸残基可以被替代、添加、或缺失而不会破坏所关注的活性的指导。
[0107] 具有与本发明的查询氨基酸序列至少有例如95% "同一性"的氨基酸或多肽序列 的多肽指受试多肽的氨基酸序列与查询序列相同，不同的是受试多肽序列每1〇〇个查询氨 基酸序列的氨基酸可包括至多五个氨基酸改变。换句话讲，为了获得具有与查询氨基酸序 列至少95%相同的氨基酸序列的多肽，受试序列中至多5%的氨基酸残基可被插入、缺失、 或被另一个氨基酸取代。参考序列的这些改变可发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端 位置，或者发生在那些末端位置间的任何位置，散布在参考序列残基中的单个位置上或者 在参考系列内的一个或多个邻接基团上。
[0108] 实际上，可使用已知的计算机程序常规地测定是否任何特定的多肽与参考多肽为 至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的。用于确定查询序列（例如， 本发明的序列）与目的序列间的最佳总体匹配的优选方法（也称为全局序列比对），可使用 基于 Brutlag 等人（Comp. Appl. Biosci. 6 :237_245,1990)的 FASTDB 计算机程序确定。在 序列比对中，查询和目的序列都是核苷酸序列或者都是氨基酸序列。所述全局序列比对的 结果是百分比同一性。FASTDB氨基酸比对中使用的优选参数为：Matrix = PAMO, k-tuple =2,Mismatch Penalty = I,Joining Penalty = 20,Randomization Group Length = 0, Cutoff Score = l，Window Size =序列长度，Gap Penalty = 5，Gap Size Penalty-0. 05， Window Size = 500或者受试氨基酸序列的长度，取任何一个更短的。
[0109] 如果由于N-或C-末端的缺失而不是由于内部缺失导致受试序列比查询序列更 短，必须对结果进行人工修正。这是因为FASTDB程序当计算全局百分比同一性时不截短受 试序列的N-末端和C-末端。对于相对于查询序列在N-末端和C-末端截短的受试序列， 通过计算为受试序列的N-末端和C-末端的查询序列残基的数目来修正百分比同一性，上 述残基不与对应的受试序列残基匹配/对齐，将它们计算为占查询序列总碱基的百分比。 通过FASTDB序列比对的结果测定是否残基是匹配的/对齐的。然后从百分比同一性中减 去通过上述FASTDB程序使用特定参数计算出的这个百分比以得到最终的百分比同一性评 分。将这个最终的百分比同一性评分用于本发明的目的。仅认为不与查询序列匹配/对齐 的受试序列的N-末端和C-末端残基适用于人工调节百分比同一性评分。即，仅有的在受 试序列最远的N-末端和C-末端残基之外的查询残基位置。
[0110] 例如，将90个氨基酸残基的受试序列与100个残基的查询序列进行比对以确定百 分比同一性。缺失发生在受试序列的N-末端并且因此FASTDB比对不显示N-末端前10个 残基的匹配/对齐。所述10个未配对的残基占序列的10% (在N-末端和C-末端未匹配 的残基数目/查询序列中的残基总数），因此从通过FASTDB程序计算的百分比同一性评分 中减去10%。如果剩余的90个残基是完全匹配的，所述最终百分比同一性将为90%。在 另一个实例中，90个残基的受试序列与100个残基的查询序列进行比较。这时所述缺失为 内部缺失，因此在不与查询序列匹配/对齐的受试序列的N-末端或C-末端无残基。在这 种情况下，不对通过FASTDB计算出的百分比同一性进行人工修正。再次，如FASTDB比对所 示，仅有在受试序列N-末端和C-末端残基之外的残基位置不与查询序列匹配/对齐，它们 被人工修正。出于本发明的目的，不进行其他的人工修正。
[0111] 适用于本发明的多肽和其他酶及其片段由多核苷酸编码。术语"多核苷酸"旨在 涵盖单个核酸以及多个核酸，并且指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA (mRNA)、病毒 来源的RNA、或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规的磷酸二酯键或非常规的键（如酰 胺键，诸如存在于肽核酸（PNA)中的酰胺键）。多核苷酸可包含全长cDNA序列的核苷酸序 列，或其片段，包括非翻译的5'和3'序列以及编码序列。所述多核苷酸能够由任何多核 糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸组成，其可为非改性的RNA或DNA，或改性的RNA或DNA。例 如，多核苷酸可以由以下组成：单链和双链DNA、为单链和双链区的混合物的DNA、单链和双 链RNA、和为单链和双链区的混合物的RNA、包含DNA和RNA的杂合分子（其可为单链的或， 更典型地为双链的、或为单链和双链区的混合物）。"多核苷酸"涵盖了化学地、酶促地、或 代谢地改性的形式。
[0112] 术语"核酸"指任何一个或多个核酸片段，例如DNA或RNA片段，它们存在于多核 苷酸中。如本发明所述的多核苷酸还包括合成产生的此类分子。本发明的多核苷酸可为宿 主细胞天然具有的或异源的。此外，多核苷酸或核酸可为或可包含调控因子诸如启动子、核 糖体结合位点、或转录终止子。
[0113] 在某些实施例中，所述多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况下，包括编码多肽的 核酸的多核苷酸通常可包括启动子和/或其他转录或翻译调控因子，它们可操作地结合一 个或多个编码区。可操作地结合是基因产物例如多肽的编码区与一个或多个调控序列以将 基因产物的表达置于调控序列的影响或控制下的方式结合。两个DNA片段（诸如多肽编 码区和与其相关的启动子），如果启动子功能的诱导导致编码期望基因产物的mRNA转录并 且如果两个DNA片段间的键本质不干扰表达调控序列引导基因产物表达的能力或干扰DNA 模板被转录的能力，它们是"可操作地结合的"。因此，如果启动子能够影响核酸的转录，该 启动子区将与编码多肽的核酸可操作地结合。除启动子之外的其他转录调控因子例如增强 子、操纵子、阻遏蛋白和转录终止信号也能够与所述多核苷酸可操作地结合。适合的启动子 和其他转录控制区描述于本文中，并且是本领域中为人们所熟知的。
[0114]多核苷酸序列能够被称为是"分离的"，它被从其天然的环境中移除出来。例如，出 于本发明的目的，包含在载体中的编码具有酶活性（例如将底物转化成木酮糖的能力）的 多肽或多肽片段的异源性多核苷酸被认为是分离的。分离的多核苷酸的另一个例子包括异 源宿主细胞拥有的重组多核苷酸或溶液中的纯化的（部分地或基本上）多核苷酸。根据本 发明分离的多核苷酸或核酸还包括此类人工合成生产的分子。DNA聚合物形式的分离的多 核苷酸片段可以由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。
[0115] 术语"基因"指能够被表达为特定蛋白质的核酸片段，其任选包括编码序列前的调 控序列（5'非编码序列）和编码序列后的调控序列（3'非编码序列）。
[0116] 如本文所用，"编码区"或"0RF"是核酸的一部分，其由翻译成氨基酸的密码子组 成。虽然"终止密码子"(TAG、TGA、或TAA)不翻译成氨基酸，如果存在的话，可认为它是编码 区的一部分，但是任何侧接序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和 3'非翻译区等，不是编码区的一部分。"合适的调控序列"是指位于编码序列上游"（5' 非编码序列）、中间、或下游（3'非编码序列）并影响相关的编码序列的转录、RNA加工或 稳定性、或翻译的核苷酸序列。调控序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸 化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。
[0117] 多种翻译调控因子是本领域的普通技术人员已知的。这些因子包括但不限于核糖 体结合位点、翻译起始和终止密码子、以及来源于病毒体系的因子（尤其是内部核糖体进 入位点或IRES)。在其它实施例中，本发明的多核苷酸是RNA，例如信使RNA (mRNA)形式的 RNA。本发明的RNA可以是单链的或双链的。
[0118] 本发明的多核苷酸和核酸编码区可与编码分泌肽或信号肽的附加编码区相关联， 它们引导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。
[0119] 如本文所用，术语"转化"指将核酸片段转移至宿主生物体的基因组内，导致基因 稳定遗传。含有转化核酸片段的宿主生物体被称为"重组"或"转化"生物体。
[0120] 如本文所用，术语"表达"指来源于本发明核酸片段的有义RNA(mRNA)或反义RNA 的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。
[0121] 如本文所用，术语"过表达"是指在宿主细胞中核酸或蛋白水平的增加。因此，可 通过增加宿主细胞中内源性的序列的转录或翻译水平、或在宿主细胞中导入异源的序列导 致过表达。也可通过增加核酸或蛋白序列的稳定性导致过表达。
[0122] 术语"质粒"、"载体"和"盒"指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的 染色体外因子，并且常常是环状双链DNA片段的形式。此类因子可以是线性或环状的、单链 或双链DNA或RNA的、来源于任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸 序列，其中许多核苷酸序列已被接合或重组为能够将针对所选择的基因产物的启动子片段 和DNA序列与适当的3'非翻译序列一起导入细胞中的独特构造。"转化盒"指含有外来基 因并且除了该外来基因外还具有有利于特定宿主细胞转化的因子的特定载体。"表达盒"指 包含外来基因并且除了该外来基因外还具有使得该基因在外来宿主中的表达增强的因子 的特定载体。
[0123] 术语"人工的"指合成的、或非宿主细胞来源的组合物，例如化学合成的寡核苷酸。
[0124] 术语"天然的"是指多核苷酸、基因或多肽的形式与天然存在的一样，带有其自身 的调控序列（如果存在调控序列）。
[0125] 术语"内源性的"当用于指多核苷酸、基因、或多肽时是指在生物体基因组中处于 其天然位置的天然多核苷酸或基因，或者对于天然多肽，从基因组中的该位置被转录和翻 译。
[0126] 术语"异源性的"当用于指多核苷酸、基因、或多肽时是指通常不存在于宿主生物 体中的多核苷酸、基因、或多肽。"异源性多核苷酸"包含天然编码区、或其部分，所述异源性 多核苷酸以不同于对应的天然多核苷酸的形式被重新导入源生物体中。"异源性基因"包括 天然编码区、或其部分，所述异源性基因以不同于对应的天然基因的形式被重新导入源生 物体中，例如，不在所述生物体基因组中的天然位置上。例如，异源性基因可包括天然编码 区，所述天然编码区为包括非天然的调控区的嵌合基因的一部分，所述异源性基因被重新 导入天然宿主中。"转基因"是已通过转化方法被引入基因组中的基因。"异源性多肽"包 括天然多肽，所述异源性多肽以不同于对应的天然多肽的形式被重新导入源生物体中。所 述异源性多核苷酸或基因可通过例如基因转移的方式被导入宿主生物体。
[0127] 如本文所用，术语"修饰"是指本文公开的导致所述多核苷酸编码的多肽活性改变 的多核苷酸的变化，以及本文公开的导致多肽活性改变的多肽的变化。此类改变能够通过 本领域熟知的方法实现，包括但不限于缺失、突变（例如，自发突变、随机诱变、由增变基因 导致的诱变、或转座子诱变）、取代、插入、改变细胞定位、改变多核苷酸或多肽的状态（例 如，甲基化、磷酸化或泛素化）、移除辅因子、化学修饰、共价修饰、用UV或X-射线照射、同源 重组、有丝分裂重组、启动子置换法、和/或它们的组合。通过将特定多核苷酸或多肽的序 列与同源的多核苷酸或多肽（例如酵母或细菌的）的序列进行比较，并使高度同源区（保 守区）或共有序列中进行的修饰的数量最大化，可发现用以确定哪些核苷酸或氨基酸残基 能够被修饰的指导。
[0128] 如本文所用，术语"变体"（关于多核苷酸）是指使用例如重组DNA技术诸如诱变 生成的，通过核苷酸的插入、缺失、突变、和取代而与本发明专门列举的多核苷酸不同的多 核苷酸。编码相同或相似的多肽的重组多核苷酸变体可以被合成，或通过利用遗传密码中 的"冗余"进行选择。可将各种密码子取代诸如产生各种限制性位点的沉默改变引入，以将 克隆优化到质粒或病毒载体中以供表达。多核苷酸序列的多种突变可体现在所述多肽或添 加到所述多肽的其它肽的结构域中以改变多肽中任意部分的性质。
[0129] 术语"重组基因表达因子"是指表达一种或多种特异性蛋白质的核酸片段，包括针 对所述蛋白质的编码序列前的调控序列（5'非编码序列）和针对所述蛋白质的编码序列 后的调控序列（3'终止序列）。嵌合基因是重组基因表达因子。操纵子的编码区可以与可 操作地连接的启动子和终止区一起形成重组基因表达因子。
[0130] "调控序列"是指位于编码序列上游（5'非编码序列）、内部、或下游（3'非编码 序列）的核苷酸序列，并且能影响相关的编码序列的转录、RNA加工或RNA稳定性、或翻译。 调控序列可包括启动子、增强子、操作子、抑制子、转录终止信号、翻译前导序列、内含子、聚 腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。
[0131] 术语"启动子"是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的核酸序列。一般来讲， 编码序列位于启动子序列的3'端。启动子可整个来源于天然基因、或者可由来源于天然 存在的不同启动子的不同因子组成、或者甚至包含合成的核酸片段。本领域的技术人员已 知，不同的启动子可指导基因在不同的组织或细胞类型中、在不同的发育阶段、或响应于不 同的环境或生理条件的表达。通常将在大多数细胞类型中、在大多数情况下引起基因被表 达的启动子称为"组成型启动子"。在另一方面，"诱导型启动子"导致基因在该启动子被诱 导或被启动子特异性的信号或分子开启时被表达。还应认识到因为在大多数情况下还不能 完全确定调控序列的确切范围，不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。例如，应 当理解，"FBA1启动子"能够被用于指来源于FBAl基因的启动子区的片段。
[0132] 如本文所用，术语"终止子"是指位于编码序列下游的DNA序列。这包括聚腺苷酸 化识别序列以及编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其他序列。聚腺苷酸化 信号的特征通常在于影响聚腺苷酸片段向mRNA前体的3'端的添加。所述3'区能够影响 相关的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。已经认识到，由于大多数情况下调控 序列的确切界限还未被彻底地界定，不同长度的DNA片段可具有相同的终止子活性。例如， 应当理解，"CYC1终止子"能够被用于指来源于CYCl基因的终止子区的片段。
[0133] 术语"可操作地连接"是指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸 序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达（即，该 编码序列受到该启动子的转录控制）时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序 列可以按有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。
[0134] 如本文所用，术语"转化"指将核酸片段转移至宿主生物体的基因组内，导致基因 稳定遗传。含有转化核酸片段的宿主生物体被称为"转基因"或"重组"或"转化"生物体。
[0135] 如术语"密码子优化的"是指用于各种宿主转化的核酸分子的基因或编码区，则它 是指在核酸分子的基因或编码区中的密码子改变，以反映在没有改变由DNA编码的多肽情 况下宿主生物体典型的密码子使用情况。此类优化包括将至少一个、或多于一个、或显著的 数目的密码子替换为在那种生物体中使用频率更高的一个或多个密码子。
[0136] 包含编码任何多肽链的氨基酸的密码子的核苷酸序列中的偏差，允许编码该基因 的序列中的变型。由于每一密码子由三个核苷酸组成，而构成DNA的核苷酸限于四种特异 性碱基，存在64种可能的核苷酸组合，其中的61种编码氨基酸（其余三种密码子编码结 束翻译的信号）。显示了哪些密码子编码哪些氨基酸的"遗传密码"在本文中被重制为表 1(即，标准遗传密码）。因此，许多氨基酸被分配了多于一种的密码子。例如，氨基酸，丙氨 酸和脯氨酸由四种三联体编码，丝氨酸和精氨酸由六种三联体编码，而色氨酸和甲硫氨酸 仅由一种三联体编码。这种简并性允许DNA碱基组成在宽范围内变化而不会改变由该DNA 编码的蛋白质的氨基酸序列。
[0137]魁

【权利要求】
1. 用于制备丁醇的方法，其包括： (a) 提供产丁醇菌， (b) 使所述产丁醇菌与一种或多种碳底物在其中丁醇以有效收率被生产的条件下接 触； (c) 收集所述产丁醇菌； (d) 以至少约6g/L的浓度回收丁醇； (e) 使（c)的所收集的产丁醇菌与一种或多种碳底物在其中丁醇以有效收率被生产的 条件下接触，并且其中所述有效收率为（b)的有效收率的至少约90% ; (f) 重复步骤（c)-(e);以及，任选地使（c)的所收集的产丁醇菌在至少约0.3%的丁 醇的存在下暴露于PH小于或等于约2. 0的条件下至少约1小时。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述产丁醇菌为产异丁醇菌。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所制备的丁醇选自：异丁醇、1-丁醇、2-丁醇、 2_ 丁酮、以及它们的混合物。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)-e)被重复至少十次。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述产丁醇菌包含工程化的丁醇生物合成途径。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述工程化的丁醇生物合成途径为工程化的异丁 醇生物合成途径。
7. 根据权利要求5所述的方法，其中所述工程化的丁醇途径包含至少一种多肽， 所述至少一种多肽选自具有下列酶学委员会编号的一组酶：EC2. 2. 1. 6、EC I. I. 1. 86、 EC 4. 2. 1.9、EC 4. 1.1. 72、EC 1.1. 1.1、EC1. 1.1. 265、EC 1.1. 1.2、EC 1.2. 4. 4、 EC 1.3. 99. 2、EC 1.2. 1.57、EC1. 2. 1.10、EC 2. 6. 1.66、EC 2. 6. 1.42、EC 1.4. 1.9、EC 1. 4. 1. 8、EC4. I. 1. 14、EC 2. 6. 1. 18、EC 2. 3. 1. 9、EC 2. 3. 1. 16、EC I. 1. 130、ECL I. 1. 35、 EC I. I. 1. 157、EC I. I. 1. 36、EC 4. 2. 1. 17、EC 4. 2. 1. 55、ECL 3. 1. 44、EC 1. 3. 1. 38、EC 5. 4. 99. 13、EC 4. I. 1. 5、EC 2. 7. 1. 29、ECL I. 1. 76、EC 1. 2. 1. 57、和 EC 4. 2. 1. 28。
8. 根据权利要求5所述的方法，其中所述工程化的丁醇途径包含至少一种选自下列一 组酶的多肽：乙酰乳酸合酶、乙酰羟酸异构还原酶、乙酰羟酸脱水酶、支链α -酮酸脱羧酶、 支链醇脱氢酶、酰化醛脱氢酶、支链酮酸脱氢酶、丁酰-CoA脱氢酶、丁醛脱氢酶、转氨酶、缬 氨酸脱氢酶、缬氨酸脱羧酶、ω -转氨酶、乙酰-CoA乙酰转移酶、3-羟丁酰-CoA脱氢酶、巴 豆酸酶、丁酰-CoA脱氢酶、异丁酰-CoA变位酶、乙酰乳酸脱羧酶、乙偶姻胺化酶、丁醇脱氢 酶、丁醛脱氢酶、乙偶姻激酶、磷酸乙偶姻胺化酶、磷酸氨基丁醇磷酸化酶、氨基丁醇激酶、 丁二醇脱氢酶、和丁二醇脱水酶。
9. 根据权利要求1所述的方法，其中所述产丁醇菌为酵母。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述酵母为酵母属（Saccharomyces)、裂殖酵母 属（Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属（Hansenula)、假丝酵母属（Candida)、克鲁维酵母 属（Kluyveromyces)、耶氏酵母属（Yarrowia)、伊萨酵母属（Issatchenkia)、或毕赤酵母属 (Pichia)的成员。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述酵母为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)〇
12. 根据权利要求1所述的方法，其中所述产丁醇菌为PNY860的衍生物。
13. 根据权利要求1所述的方法，其中所述产丁醇菌还不表达丙酮酸脱羧酶或具有降 低的所述丙酮酸脱羧酶的表达。
14. 根据权利要求1所述的方法，其中所述产丁醇菌还不表达3-磷酸甘油醛脱氢酶或 具有降低的所述3-磷酸甘油醛脱氢酶的表达。
15. 根据权利要求1所述的方法，其中所述产丁醇菌还不表达磷酸二酯酶或具有降低 的所述磷酸二酯酶的表达。
16. 根据权利要求15所述的方法，其中所述磷酸二酯酶为TOEl。
17. 根据权利要求1所述的方法，其中所述产丁醇菌还不表达BDHl或具有降低的所述 BDHl的表达。
18. 根据权利要求1所述的方法，其中丁醇以（b)的有效收率的至少约99%在步骤（e) 中被生产。
19. 根据权利要求1所述的方法，其中所述产丁醇菌在（b)的接触中以至少约2gdcw/L 的细胞密度存在。
20. 根据权利要求1所述的方法，其中（b)的产丁醇菌对重复的步骤（c)-(e)的至少十 个循环维持其特异性生产能力。
21. 根据权利要求1所述的方法，其中丁醇在（b)中以至少约0. lg/gdcw/h的有效速率 被生产。
22. 根据权利要求1所述的方法，其中（b)的接触在提取剂的存在下进行。
23. 根据权利要求1所述的方法，其中所述碳底物选自：低聚糖、多糖、单糖以及它们的 混合物。
24. 根据权利要求1所述的方法，其中所述碳底物选自：果糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、半 乳糖、蔗糖、淀粉、纤维素、原料、乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐、甘油、玉米醪、甘蔗、生物质、C5糖 诸如木糖和阿拉伯糖、以及它们的混合物。
25. 根据权利要求1所述的方法，其中（b)和（e)的接触在厌氧或微氧条件下进行。
26. 根据权利要求6所述的方法，其中所述工程化的异丁醇途径包括下列 底物至产物的转化： a. 丙酮酸至乙酰乳酸； b. 乙酰乳酸至2, 3-二羟基异戊酸； c. 2, 3-二羟基异戊酸至α -酮异戊酸； d. α-酮异戊酸至异丁醛；以及 e. 异丁醛至异丁醇。
27. 根据权利要求26所述的方法，其中所述底物至产物的转化中的一种或多种利用 NADH作为辅因子。
28. 组合物，其具有小于约2的pH并包含利用蔗糖的、包含工程化的异丁醇途径的产异 丁醇菌。
29. 根据权利要求28所述的组合物，其中所述利用蔗糖的产异丁醇菌为酵母属、裂殖 酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、伊萨酵母属、或毕赤酵母属 的成员。
30. 根据权利要求29所述的组合物，其中所述利用蔗糖的产异丁醇菌为酿酒酵母。
31. 根据权利要求28所述的组合物，其中所述利用蔗糖的产异丁醇菌为PNY860的衍生 物。
32. 根据权利要求28所述的组合物，其中所述利用蔗糖的产异丁醇菌包含工程化的 酶，所述工程化的酶催化乙酰乳酸至2, 3-二羟基异戊酸的底物至产物的转化。
33. 根据权利要求13所述的方法，其中所述表达的降低为编码丙酮酸脱羧酶的基因的 插入、突变、取代、和/或缺失的结果。
34. 根据权利要求14所述的方法，其中所述表达的降低为编码3-磷酸甘油醛脱氢酶的 基因的插入、突变、取代、和/或缺失的结果。
35. 根据权利要求15所述的方法，其中所述表达的降低为编码磷酸二酯酶的基因的插 入、突变、取代、和/或缺失的结果。
36. 根据权利要求35所述的方法，其中所述磷酸二酯酶为TOEl。
37. 根据权利要求17所述的方法，其中所述表达的降低为编码BDHl的基因的插入、突 变、取代、和/或缺失的结果。
38. 根据权利要求13、14、15、16、17、33、34、35、36或37所述的方法，其中所述产丁醇菌 还不表达编码乙酰乳酸还原酶的基因或具有降低的所述编码乙酰乳酸还原酶的基因的表 达。
39. 根据权利要求38所述的方法，其中所述表达的降低为编码YMR226C的基因的插入、 突变、取代、和/或缺失的结果。
40. 根据权利要求13所述的方法，其中所得的菌株的基因型为MATa ura3 Δ ： :IoxP his3A ： :loxP pdc6 Δ pdclA：：ilvD pdc5A ： :kivD(y) fra2 Δ ： :UAS(PGKl)-FBAlp-ilvD(y)gpd2 Δ ： ：I〇xP7 I /66-FBA Ip-a IsS bdhlΔ ：：UAS(PGKl)-EN02p-iIvD-IL V5p-adh ymr226cΔ/pffZ009, pffZOOl〇
41. 包含被降低的或被除去的磷酸二酯酶和/或磷酸二酯酶活性的微生物，其中所述 微生物产生丁醇。
42. 根据权利要求41所述的微生物，其中所述微生物在编码具有磷酸二酯酶活性的多 肽的内源性多核苷酸中包含插入、缺失、突变、和/或取代。
43. 根据权利要求41或42所述的微生物，其中所述具有磷酸二酯酶活性的多肽对应于 酶学委员会编号EC 3. 1.4. 17。
44. 根据权利要求41至43中任一项所述的微生物，其中具有磷酸二酯酶活性的所述多 肽为I3DEl。
45. 根据权利要求41所述的微生物，其中所述微生物还包含工程化的丁醇生物合成途 径。
46. 根据权利要求45所述的微生物，其中所述工程化的丁醇生物合成途径为工程化的 异丁醇生物合成途径。
47. 根据权利要求46所述的微生物，其中所述工程化的异丁醇生物合成途径包含编码 多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化： (a) 丙酮酸至乙酰乳酸； (b) 乙酰乳酸至2, 3-二羟基异戊酸； (c) 2, 3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸； (d) 2-酮异戊酸至异丁醛；以及 (e) 异丁醛至异丁醇。
48. 根据权利要求47所述的微生物，其中所述工程化的异丁醇生物合成途径包含编码 多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶活性、酮酸还原异构酶活性、二羟酸脱水酶活 性、酮异戊酸脱羧酶活性、和醇脱氢酶活性。
49. 根据权利要求45所述的微生物，其中所述微生物还不表达丙酮酸脱羧酶或具有降 低的所述丙酮酸脱羧酶的表达。
50. 根据权利要求49所述的微生物，其中所述表达的降低为编码丙酮酸脱羧酶的基因 的插入、突变、取代、和/或缺失的结果。
51. 根据权利要求50所述的微生物，其中所述丙酮酸脱羧酶选自：PDCl、H)C5、PDC6、以 及它们的组合。
52. 根据权利要求45所述的微生物，其中所述微生物还不表达3-磷酸甘油醛脱氢酶或 具有降低的所述3-磷酸甘油醛脱氢酶的表达。
53. 根据权利要求52所述的微生物，其中所述表达的降低为编码3-磷酸甘油醛脱氢酶 的基因的插入、突变、取代、和/或缺失的结果。
54. 根据权利要求45所述的微生物，其中所述微生物还不表达BDHl或具有降低的所述 BDHl的表达。
55. 根据权利要求54所述的微生物，其中所述表达的降低为编码BDHl的基因的插入、 突变、取代、和/或缺失的结果。
56. 根据权利要求45至55中任一项所述的微生物，其中所述微生物还不表达编码乙酰 乳酸还原酶的基因或具有降低的所述编码乙酰乳酸还原酶的基因的表达。
57. 根据权利要求56所述的微生物，其中所述表达的降低为编码YMR226C的基因的插 入、突变、取代、和/或缺失的结果。
58. 根据权利要求45至57中任一项所述的微生物，其中所述微生物为酵母细胞。
59. 根据权利要求58所述的微生物，其中所述酵母细胞为选自下列的酵母属的成员： 酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、伊萨酵母属、和 毕赤酵母属。
60. 用于改善细胞活力和生产能力的方法，其包括： (a) 收集来自醇发酵的微生物；以及 (b) 使所述微生物与富含营养物质的培养基接触。
61. 用于改善细胞活力和生产能力的方法，其包括： (a) 收集来自醇发酵的微生物； (b) 使所述微生物暴露于低pH条件下； (c) 收集来自步骤（b)的微生物；以及 (d) 使所述微生物与富含营养物质的培养基接触。
62. 用于生产醇的方法，其包括： (a) 提供根据权利要求45至59中任一项所述的微生物，其中所述微生物产生醇； (b) 使所述微生物与一种或多种碳底物在其中醇被生产的条件下接触； (c) 收集所述微生物； (d) 回收所述醇； (e) 使步骤（c)的微生物与富含营养物质的培养基接触； (f) 收集步骤（e)的微生物； (g) 使所述微生物与一种或多种碳底物在其中醇被生产的条件下接触；以及 (h) 任选地重复步骤（c)-(g)。
63. 用于生产醇的方法，其包括： (a) 提供根据权利要求45至59中任一项所述的微生物，其中所述微生物产生醇； (b) 使所述微生物与一种或多种碳底物在其中醇被生产的条件下接触； (c) 收集所述微生物； (d) 回收所述醇； (e) 使步骤（c)的微生物暴露于低pH条件下； (f) 收集来自步骤（e)的微生物； (g) 使步骤（f)的微生物与富含营养物质的培养基接触； (h) 收集步骤（g)的微生物； (i) 使步骤（i)的微生物与一种或多种碳底物在其中醇被生产的条件下接触；以及 (j) 任选地重复步骤（C)-(i)。
64. 根据权利要求62或63所述的方法，其中使所述微生物与富含营养物质的培养基接 触的步骤在有氧条件下进行。
65. 根据权利要求61所述的方法，其中所述pH小于或等于约2。
66. 根据权利要求63所述的方法，其中所述pH小于或等于约2。
67. 根据权利要求61所述的方法，其中所述pH为约2至约4。
68. 根据权利要求63所述的方法，其中所述pH为约2至约4。
69. 根据权利要求62或63所述的方法，其中所述醇选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、 和己醇。
70. 根据权利要求69所述的方法，其中丁醇选自1-丁醇、2-丁醇、2-丁酮、异丁醇、叔 丁醇、或它们的混合物。
71. 组合物，其包含富含营养物质的培养基和根据权利要求45至59中任一项所述的微 生物。
【文档编号】C12P7/16GK104321436SQ201280070977
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2012年12月28日 优先权日:2011年12月30日
【发明者】B.布哈德拉, R.布哈拉, A.L.克鲁科伯格, V.纳加拉詹, R.帕特奈克, W.苏 申请人:布特马斯先进生物燃料有限责任公司