一种发酵过程中添加过氧化氢生产γ-聚谷氨酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种发酵过程中添加过氧化氢生产γ-聚谷氨酸的方法，该方法采用在发酵48h时添加一定浓度的氧载体过氧化氢（0.5-5%，v/v）到发酵液中，提高溶氧浓度，进而提高γ-聚谷氨酸的产量，同时也控制了γ-聚谷氨酸中L-谷氨酸和D-谷氨酸的比例。该方法使得γ-聚谷氨酸的产量得到了很大的提高，而且也控制了其构型的比例，使所制得的不同构型γ-聚谷氨酸按照各自不同特点分别应用到化妆品、环境保护、食品、医药、农业、沙漠治理等领域。
【专利说明】一种发酵过程中添加过氧化氢生产Y-聚谷氨酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种Y-聚谷氨酸的生产方法，特别涉及一种发酵过程中添加过氧化氢生产Y-聚谷氨酸的方法 。
【背景技术】
[0002]y -聚谷氨酸是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通过α -氨基和、-羧基间的酰胺键结合而成的一种多功能生物可降解高分子材料。
[0003]分子量分布在IOOkDa到1000OkDa之间。Y -聚谷氨酸具有优良的水溶性、超强的吸附性和生物可降解性，降解产物为无公害的谷氨酸，是一种优良的环保型高分子材料，可作为保水剂、重金属离子吸附剂、絮凝剂、缓释剂以及药物载体等，在化妆品、环境保护、食品、医药、农业、沙漠治理等产业均具有很高的商业价值和社会价值。
[0004]从聚谷氨酸的发现至今仅有几十年的历史，聚谷氨酸的研究主要还是处于实验室阶段，主要包括对其性质的研究，产生菌的改良和基因研究，发酵过程研究和提取纯化过程研究，以及衍生物的生产和性质的研究。近几年来，由于人们环境意识的增强和国家可持续发展战略的要求，发展对环境友好的材料和开发改善环境问题的产品成为一种产业上的趋势，它也推动了聚谷氨酸产业化研究和探索的进程。进入本世纪，个别国际知名公司开始进行聚谷氨酸的生产和应用的研究，国内部分大学和研究所也积极开展了相关的研究，国内更有数家企业开始计划聚谷氨酸的大规模生产。由于这些产业化研究的跟进，使得聚谷氨酸成为现阶段最受人关注的生物制品之一。
[0005]不同构型组成的Y-聚谷氨酸有不同的应用，例如，含有较高含量L-谷氨酸的Y-聚谷氨酸因其对皮肤的兼容性在化妆品行业应用广泛，在一些其他的领域，含有较高D-谷氨酸的Y-聚谷氨酸因其降解较慢而被广泛应用。这使得在Y-聚谷氨酸生产过程中控制其构型组成以满足不同的应用需求变得很重要。
[0006]Y-聚谷氨酸的构型以及组成随着菌株和培养条件的不同而不同。炭疽芽孢杆菌特异性可以生产出D-Glu构型的Y-聚谷氨酸；采用地衣芽孢杆菌生产Y-聚谷氨酸，其会随着锰离子浓度的不同而得到D-Glu含量10~100%的不同Y -聚谷氨酸；采用枯草芽孢杆菌也可以生产不同类型的Y-聚谷氨酸。
[0007]利用添加氧载体过氧化氢来提高Y -聚谷氨酸的产量，同时控制其构型的比例尚未见报道。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种Y -聚谷氨酸的生产方法，特别是提供一种发酵过程中添加过氧化氢生产Y-聚谷氨酸的方法。采用本发明所述生产方法生产Y-聚谷氨酸，不但Y-聚谷氨酸的产量有所提高，Y-聚谷氨酸聚合物中L型谷氨酸和D型谷氨酸的比例也能得到控制。
[0009]本发明的技术方案如下:[0010]本发明采用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)生产Y -聚谷氨酸。菌种来源:发明所用菌种见天津北洋百川生物技术有限公司申请专利名称为惰性载体固态发酵法生产Y-聚谷氨酸的方法专利，申请号=200910228297。该菌种为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis),现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC3336。
[0011]—种发酵过程中添加过氧化氢生产Y -聚谷氨酸的方法，在发酵48h时,将一定体积百分浓度的过氧化氢(0.5%_5%)添加到发酵液中，提高了溶氧浓度，进而提高了 Y-聚谷氨酸的产量，并控制了 Y-聚谷氨酸的构型。
[0012]D-谷氨酸与L-谷氨酸浓度的测定:高效液相色谱(HPLC)
[0013]仪器:Agilentl200高效液相色谱仪(配紫外可见检测器和工作站)。
[0014]色谱柱:大赛璐CR (+) / (CR-)手性柱；
[0015]流动相:pH2.0高氯酸水溶液；
[0016]流速:0.4mL/min ；
[0017]柱温:25O;
[0018]检测波长:UV200nm
[0019]样品制备:发酵液经二次醇沉复溶后，与等体积6mol/L盐酸在110°C进行水解，水解前样品用流动相稀释适当倍数，水解后样品用流动相稀释适当倍数，经0.22 μ m滤膜过滤，滤液供液相色谱分析。
[0020]有益效果:
[0021]利用本发明所述的Y-聚谷氨酸生产方法来生产Y-聚谷氨酸，其Y-聚谷氨酸的产量得到显著提高，该方法可以同时控制Y-聚谷氨酸中L/D谷氨酸的比例，因此可以得到不同用途的Y-聚谷氨酸。
【具体实施方式】
[0022]下面通过具体的实施方案叙述本发明中Y-聚谷氨酸的生产方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
[0023]对照实验:
[0024]1.CGMCC3336菌种的活化:在富含营养的固体培养基斜面上于37°C培养16小时，制备得到成熟的斜面种子，固体培养基的成分包含:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCllOg/L，琼脂 20g/L, ρΗ7.2 ；
[0025]2.种子液的制备:
[0026]将一环上述种子转入装有液体种子培养基的三角瓶中，37°C，220rpm培养16小时至对数生长期；
[0027]种子液培养基组成(g/L):葡萄糖30 ;酵母膏7 ;胰蛋白胨10 ；Κ2ΗΡ040.5 ；MgSO4.6Η200.5，ρΗ7.2 ； 500ml的三角瓶中分装50ml培养基；
[0028]3.发酵罐发酵:[0029]发酵罐培养基成分为(g/L):葡萄糖80，谷氨酸钠80，硝酸铵18，NaCllO,MgSO4.6Η200.5，CaCl2.6Η201.0, FeSO4.6Η200.01，精氨酸 0.44，组氨酸 0.26，苏氨酸 0.5，蛋氨酸0.4，胆碱0.1，谷氨酰胺0.5，吡哆醇0.001,ρΗ7.2 ；
[0030]发酵条件:5L发酵罐装液量为3L,种子液的接种量为10%,发酵温度37°C,发酵时间72小时，
[0031]通风量1.0vvm，转速400rpm，初始pH为7.2 ;发酵结束后经检测Y聚谷氨酸的产量为18g/L。Y-聚谷氨酸中L-谷氨酸与D-谷氨酸含量比例为1:1。
[0032]实施例1
[0033]发酵罐发酵采用氧载体添加策略，其余条件同对照实施例。发酵48h时添加过氧化氢 0.5% (v/v)0
[0034]结果:Y -聚谷氨酸产量由对照组的18g/L提高到25g/L。L/D构型比例为1:2。
[0035]实施例2
[0036]发酵罐发酵采用氧载体添加策略，其余条件同对照实施例。发酵48h时添加过氧化氢 1% (v/v)0
[0037]结果:Y -聚谷氨酸产量由对照组的18g/L提高到28g/L。L/D构型比例为4:5。
[0038]实施例3
[0039]发酵罐发酵采用氧载体添加策略，其余条件同对照实施例。发酵48h时添加过氧化氢 2% (v/v)0
[0040]结果:Y -聚谷氨酸产量由对照组的18g/L提高到30g/L。L/D构型比例为6:5。
[0041]实施例4
[0042]发酵罐发酵采用氧载体添加策略，其余条件同对照实施例。发酵48h时添加过氧化氢 5% (v/v)0
[0043]结果:Y -聚谷氨酸产量由对照组的18g/L提高到20g/L。L/D构型比例为1:3。
【权利要求】
1.一种发酵过程中添加过氧化氢生产Y-聚谷氨酸的方法，包括如下步骤: (1)地衣芽孢杆菌CGMCC3336菌种的活化: 在富含营养的固体培养基斜面上于37°C培养16小时，制备得到成熟的斜面种子，固体培养基的成分包含:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaC110g/L，琼脂20g/L，pH7.2 ； (2)种子液的制备: 将一环上述种子转入装有液体种子培养基的三角瓶中，37°C，220rpm培养16小时至对数生长期； 所述种子液培养基组成为:葡萄糖30g/L ;酵母膏7g/L ;胰蛋白胨10g/L ；K2HP040.5g/L ；MgS04.6Η200.5g/L，ρΗ7.2 ；500ml 的三角瓶中分装 50ml 培养基； (3)发酵罐发酵: 发酵罐培养基成分为:葡萄糖80g/L，谷氨酸钠80g/L，硝酸铵18g/L，NaC110g/L,MgSO4.6Η200.5g/L，CaCl2.6Η201.0g/L，FeSO4.6Η200.01g/L，精氨酸 0.44g/L，组氨酸 0.26g/L,苏氨酸0.5g/L，蛋氨酸0.4g/L，胆碱0.lg/L，谷氨酰胺0.5g/L，吡哆醇0.001g/L, pH7.2 ； 发酵条件:5L发酵罐装液量为3L,种子液的接种量为10%,发酵温度37°C,发酵时间72小时，在发酵48h时，将体积百分浓度为0.5%-5%的过氧化氢添加到发酵液中，通风量1.0vvm，转速 400rpm，初始 pH 为 7.2。
2.根据权利要求1所述的一种发酵过程中添加过氧化氢生产Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于，在发酵罐发酵至48h时，添加过氧化氢，添加量为0.5%体积百分浓度。
3.根据权利要求1所述的一种发酵过程中添加过氧化氢生产Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于，在发酵罐发酵至48h时，添加过氧化氢的体积百分浓度为1%。
4.根据权利要求1所述的一种发酵过程中添加过氧化氢生产Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于，在发酵罐发酵至48h时，添加过氧化氢的体积百分浓度为2%。
5.根据权利要求1所述的一种发酵过程中添加过氧化氢生产Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于，在发酵罐发酵至48h时，添加过氧化氢的体积百分浓度为5%。
【文档编号】C12R1/10GK103525879SQ201310499326
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月22日 优先权日:2013年10月22日
【发明者】乔长晟, 张帅, 高明昊, 李雪 申请人:天津北洋百川生物技术有限公司