用于发酵的酶掺和物的制作方法

专利名称：：用于发酵的酶掺和物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及包括葡糖淀粉酶、酸稳定的α淀粉酶以及酸性真菌蛋白酶的酶掺和物。本发明也涉及在淀粉转化工艺中利用该酶掺和物的方法，例如用于生产终产物如乙醇。
背景技术：
：工业发酵主要使用葡萄糖作为生产诸如酶、蛋白质、氨基酸、有机酸、糖醇、药物和其它生物化学品的大量终产物的原料。在许多应用中，从包括淀粉和纤维素的底物(例如全研磨谷类谷粒)的酶促转化来生产葡萄糖。淀粉包括两种多糖部分，直链淀粉和支链淀粉，该淀粉作为粒状颗粒储藏在植物细胞中。这些颗粒的部分结晶结构在冷水中引起不溶性，并且导致淀粉颗粒在水中的溶解通常需要热能以破坏该颗粒的结晶结构。已经将多种工艺用于淀粉溶解并且这些包括直接和间接加热包括颗粒淀粉的底物(参见例如，STARCHCHEMISTRYANDTECHNOLOGY，R.L.Whistler等人编，第二版，1984AcademicPressInc.，OrlandoFLandSTARCHCONVERSIONTECHNOLOGY,G.M.A.VanBeynum等人编，FoodScienceandTechnologySeries1985MarcelDekkerInc.NY)。淀粉向葡萄糖的加工通常由两步组成并且这些步骤包括淀粉的液化和对液化后的淀粉的糖化作用。进一步的步骤可以包括(a)当想要的终产物是纯化的葡萄糖或果糖时的纯化和异构化或者(b)当想要的底物是例如醇(如乙醇)时的发酵和蒸馏。淀粉液化工艺的一个目的是将淀粉聚合物颗粒的浆液转化成低粘度的较短链长度糊精溶液。这对于方便地操作用于淀粉转化工艺的工业设备是重要的步骤。通常，通过使用高温和酶促生物转化来液化淀粉。例如，通常的酶促液化工艺包括向包括底物(包括淀粉)的浆液中加入耐热细菌α淀粉酶(例如SPEZYMEPRIME和SPEZYMEFRED,SPEZYMEETHYL(DaniscoU.S.,Inc,GenencorDivision)或TERMAMYLSC,TERMAMYLSUPRA或TERMANYL120L(Novozymes))并将pH调至5.5至6.5之间以及温度大于90°C。淀粉被液化然后经历糖化酶的作用。通常，糖化作用在葡糖淀粉酶如来自黑曲霉(Aspergillusniger)(例如，OPTIDEXL-400(GenencorInternationalInc.))的葡糖淀粉酶存在下，在比液化步骤的PH更加酸性的pH下发生。存在对于淀粉底物的液化和糖化的多种变化。然而，需要用于淀粉液化、糖化和发酵的更有效的方法。发明概述本发明涉及包括葡糖淀粉酶(GA)、酸性真菌蛋白酶(AFP)以及酸稳定的α淀粉酶(AA)的酶掺和物组合物。优选地，葡糖淀粉酶、酸稳定的α淀粉酶以及酸性真菌蛋白酶的比率为约11.50.1至约181，或120.2至150.6，如由GAUSSUSAPU所测。该酶掺和物组合物用于从可发酵的糖生产终产物，尤其是用于由液化物(Iiquefact)生产乙醇。该酶掺和物组合物的一个优点在于相对于单独由葡糖淀粉酶在基本相同的条件下生产的乙醇量，该组合物产生更大量的乙醇。在一个方面，相对于单独的GA，该增加大于0.5%，包括大于1.O0AA.5%、2%和2.5%。在一个方面，GA获自选自由木霉属(Trichodermaspp·)、篮状菌属(Taleromycesspp.)、青霉菌属(Penicilliumspp.)、曲霉菌属(Aspergillusspp.)禾口腐质霉属(Humicolaspp)组成组的丝状真菌。在再一方面，葡糖淀粉酶与具有SEQIDN0:1序列的葡糖淀粉酶有至少90%的序列同一性，和/或AFP与具有SEQIDNO14序列的AFP有至少90%的序列同一性，和/或α淀粉酶与具有SEQIDNO5序列的AA有至少90%的序列同一性，和/或α淀粉酶与具有SEQIDNO:5序列的AA有至少95%的序列同一性。酶掺和物组合物任选地包括一种或多种其他的酶，例如第二种葡糖淀粉酶、第二种α淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、第二种蛋白酶、植酸酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶、脂肪酶、角质酶、果胶酶、β“葡聚糖酶、半乳糖苷酶、酯酶、环糊精转糖基转移酶、和它们的组合。本发明还涉及从可发酵的糖生产诸如醇的终产物的方法。该方法包括步骤(a)将包括含淀粉的研磨谷粒的浆液与α淀粉酶接触以生产液化物；(b)将该液化物与葡糖淀粉酶、酸稳定的α淀粉酶以及酸性真菌蛋白酶相接触以生产可发酵的糖；和(C)在发酵生物存在下，将可发酵的糖发酵以生产终产物。该方法中，步骤(b)的糖化作用和步骤(C)发酵可以顺序发生或者同时发生。可以将葡糖淀粉酶、酸稳定的α淀粉酶以及酸性真菌蛋白酶分别加入液化物。或者，将包括葡糖淀粉酶、酸稳定的α淀粉酶以及酸性真菌蛋白酶的酶掺和物组合物加入液化物。任选地，在工艺期间使用至少一种其他酶，例如α淀粉酶、葡糖淀粉酶、植酸酶、纤维素酶、支链淀粉酶、蛋白酶或漆酶。附图简要说明图1示出在使用按实施例2中进一步描述所液化的完全磨过的玉米进行同时糖化/发酵期间，使用不同的酶掺和物获得的最终醇浓度。Y轴是乙醇％作八)，乂轴如下1.TrGA,0.25GAU/gds玉米，2.#1+0.05SAPUAFP/gds玉米，3.#1+2.OSSUa淀粉酶/gds玉米，4.No.1+0.05SAPU,AFP+2.0SSUα淀粉酶/gds玉米。发明详细说明定义除非本文另有说明，否则本文使用的所有科技术语都具有与本发明所属领域技术人员的普通理解相同的含义。Singleton等人，DICTI0NARY0FMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY，第二版，JohnffileyandSons,NewYork(1994)，和Hale&Markham，THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY,HarperPerennial,N.Y.(1991)向本领域技术人员提供了本文所用的许多术语的一般含义。另外，出于清楚和易于参考的目的，下面定义了一些术语。"α淀粉酶”是α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(Ε.C.3.2.1.1)并且是切割或水解淀粉(例如支链淀粉或直链淀粉聚合物)中内部α-1，4_糖苷键的酶。术语“低于凝胶化温度”指小于凝胶化温度的温度。术语“DE”或“葡萄糖当量”是以基于干重的D-葡萄糖所计算，用于测量总还原糖的浓度的工业标准。未水解的颗粒淀粉具有基本上为0的DE并且D-葡萄糖具有DE为100。“糊精”是葡萄糖的短链聚合物(例如2至10个单元)。术语“干物质(ds)”指基于干重，以％表示的浆液的总固体。术语“终产物”指任何从可发酵底物酶促转化的源自碳源的产物。在一些优选的实施方式中，终产物是醇(例如乙醇)。如本文所使用，术语“乙醇生产者”或“生产乙醇的微生物”指能够从单糖或寡糖生产乙醇的发酵生物。术语“可发酵的糖”指任何能够被发酵生物所发酵的糖。可发酵的糖包括寡糖和糊精。“可发酵的糖”指可在发酵工艺中，通过微生物与该可发酵的糖接触来生产终产物而被转化的单糖或二糖。在一些实施方式中，可发酵的糖被微生物代谢并且在其他实施方式中，通过微生物来表达和/或分泌酶实现了可发酵的糖的期望转化。术语“发酵”指由微生物对有机物质的酶促和厌氧分解以生产更简单的有机化合物。当在厌氧条件下发生发酵时，该术语并不旨在仅仅局限于严格的厌氧条件，因为在氧存在下也发生发酵。如本文使用，术语“发酵生物”指任何适合用于发酵来直接或间接生产终产物的微生物或细胞。术语“功能等同物”意指酶具有与野生型酶相同的酶促功能特征并且源于该野生型酶。术语“凝胶化”意指通常通过烹调使淀粉分子溶化以形成有粘性的悬浮物。术语“凝胶化温度”指含有淀粉的底物开始凝胶化的最低温度。凝胶化的准确温度取决于特定淀粉并且可以根据诸如植物种类以及环境和生长条件的因素来改变。术语“颗粒淀粉”意指粗淀粉，它是没有经历凝胶化温度的淀粉。术语“颗粒淀粉水解(GSH)酶”和“具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酶”指具有水解颗粒形式的淀粉的能力的酶。术语“同源性％”在此与术语“同一性％”互换使用。可以用于测定两序列间同一性的示例性计算机程序包括但不限于BLAST程序组，例如BLASTN、BLASTX、和TBLASTX、BLASTP和TBLASTN，并且公众可自网络获得(参见例如，NationalCenterforBiotechnologyInformation网站的BLAST页面)。也参见Altschul等人，1990和Altschul等人，1997。当相对于GenBankDNASequences和其他公共数据库中的核酸序列来评估给定核酸序列时，通常使用BLASTN程序进行序列检索。优选BLASTX程序来检索核酸序列，将该核酸序列针对于GenBankProteinSequences和其他公共数据库的氨基酸序列在所有的读码框中翻译。使用开放空位罚分为11.0以及延伸空位罚分为1.0的默认参数并且利用BL0SUM-62矩阵来进行BLASTN和BLASTX(参见例如Altschul等人，1997)。“液化物”也称作可溶淀粉底物或液化底物，它是含有热稳定的α淀粉酶的完全磨过的谷粒浆液，其经历了高温液化而产生用于糖化和发酵或SSF的可溶底物。高温是高于谷粒凝胶化温度的温度。“液化”或“使液化”意指将淀粉转化成较短链以及较小粘性的糊精的工艺。术语“研磨的”在此用于指例如通过碾磨、压碎、分级分离或任何其他使颗粒尺寸减小的手段，而使尺寸减小的植物材料。研磨包括干磨或湿磨。“干磨”指整个干谷粒的研磨。“湿磨”指谷粒首先浸泡(浸)在水中以使谷粒软化的工艺。术语“寡糖”指任何具有以糖苷键连接在一起的2至10个单糖单元的化合物。简单糖类的这些短链多聚物包括糊精。如在此使用，对于在此鉴定的氨基酸或核苷酸序列的“序列同一性百分数(％)”，将其定义为在序列比对并引入空位后(如需要，以实现最大序列同一性百分数，并且不将任何保守取代当做序列同一性的部分)，候选序列中与一序列的氨基酸残基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸的百分数。进行序列比对以及测定序列同一性的方法是技术人员已知的，可以不经过多实验来进行，并且可以明确获得同一性数值的计算。参见例如，Ausubel等人编(1995)CurrentProtocolsinMolecularBiology,第19章(GreenePublishingandffiley-Interscience,NewYork)；和ALIGN程序(Dayhoff(1978),见AtlasofProteinSequenceandStructure5:Suppl.3(NationalBiomedicalResearchFoundation,Washington,D.C.)。可获得许多用于比对序列和测定序列同一性的算法，包括例如Needleman等人的同源性比对算法(1970)J.Mol.Biol.48443；Smith等人的局部同源性算法(1981)Adv.Appl.Math.2482；Pearson等人的相似性检索方法(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.852444；Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70173-187(1997)；以及BLASTP、BLASTN和BLASTX算法(参见Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215403-410)。也可获得使用这些算法的计算机化程序，其包括但不限于=ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，或WU-BLAST-2(Altschul等人，Meth.Enzym.，266460-480(1996))；或GAP、BESTFIT、BLASTAltschul等人，上文，获自GeneticsComputingGroup(GCG)包，第8版，Madison,Wis.，USA的FASTA和TFASTA；以及Intelligenetics，MountainView,Calif的PC/Gene程序中的CLUSTAL。本领域技术人员可以确定用来测量比对的适当参数，包括在被比较的序列长度上实现最大比对所需的算法。优选地，使用由该程序所确定的默认参数来测定序列同一性。具体地，可以通过以下述检索参数空位开放罚分12，以及空位延伸罚分1，使用仿射空位检索，在MSPRCH程序(OxfordMolecular)中实施Smith-Waterman同源性检索算法来测定序列同一性。优选地,可以使用GeneticsComputerGroup，Inc.,Madison,Wis.的GCG序列分析软件包的GAP程序，利用bloSum62氨基酸取代矩阵，空位权重为12以及长度权重为2来进行成对氨基酸比较。对于两氨基酸序列的最佳比对，变体氨基酸序列的相邻节段相对于参考氨基酸序列可以具有额外的氨基酸残基或者缺失的氨基酸残基。用于与参考氨基酸序列进行比较的相邻节段将包括至少20个连续的氨基酸残基并且可以是30、40、50或更多个氨基酸残基。可以通过指定空位罚分而在推导的氨基酸序列中进行对与包括空位相关的序列同一性增加的校正。术语“蛋白质”和“多肽”在此互换使用。在本公开内容和权利要求中，使用编码氨基酸残基的常规单字母和三字母密码子。按照IUPAC-IUBJointCommissiononBiochemicalNomenclature(JCBN)来定义氨基酸的3字母密码子。也应理解由于遗传密码子的简并性，可以由一种以上的核苷酸序列来编码一种多肽。通过下面的命名法[原始氨基酸残基/位置/取代的氨基酸残基]来描述本发明的变体。例如，在第89位用苏氨酸(T)对丙氨酸(A)的取代表示为A89T。当在给定位置有一个以上的氨基酸被取代时，该取代表示为例如1)A89C，A89D或A89T；2)A89C，D，或T或c)A89C/D/T。当在此鉴定出适于取代的位置而没有提出特定的氨基酸时，应理解任何氨基酸残基可以取代该位置中存在的氨基酸残基。术语“糖化酶”和“葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)”在此互换使用并且指任何能够催化从淀粉的非还原端释放D-葡萄糖以及相关的寡糖和多糖的酶。短语“同时糖化和发酵(SSF)”指在终产物的生产中，诸如生产乙醇的微生物的发酵生物以及诸如糖化酶的至少一种酶在相同容器中，于相同工艺步骤中组合的工艺。术语“浆液”指包括不溶固体(例如颗粒淀粉)的水性混合物。如在此使用，术语“淀粉”指任何由植物的复合多糖碳水化合物组成的物质，即具有通式(C6H1(I05)X的直链淀粉和支链淀粉，其中x可以是任何数字。术语“稀酒糟”意指自含有悬浮细颗粒和溶解物质的固体分离(例如通过筛选或离心)的酒糟的液体部分。术语“回流物(backset)”通常用于意指回收的稀酒糟。术语“总糖含量”指存在于淀粉组合物中的总糖含量。术语“变体”在用来指酶(例如，a淀粉酶、葡糖淀粉酶、酸性真菌蛋白酶、植酸酶等)时，意指这样的酶，其源自天然发生(野生型)的酶，但相比于该天然发生的酶具有一个或多个氨基酸的取代、插入或缺失。该术语包括杂合形式的酶，其中例如，该酶可以具有源自一种芽孢杆菌属(Bacillusp.)(例如地衣芽孢杆菌(B.licheniformis))的C-端和源自不同的芽孢杆菌属(例如嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus))的N_端。变体相对于野生型可以具有一种或多种改变的特性，例如但不限于在一PH范围上增加的热稳定性，增加的蛋白水解稳定性，增加的比活性，更宽的底物特异性，更宽的活性或它们的组合。如本文所使用，术语“野生型”指在宿主细胞中天然发生(天生的)酶。示例性实施方式本发明人发现了包括a淀粉酶、葡糖淀粉酶和酸性真菌蛋白酶的酶掺和物。此种组合物在糖化和/或糖化/发酵期间用于淀粉转化工艺。在淀粉转化工艺中使用此种组合物比单独使用葡糖淀粉酶提供优势。本发明涉及包括葡糖淀粉酶、酸性真菌蛋白酶和酸稳定的a淀粉酶的组合物。本发明也涉及该组合物的使用来从可发酵的糖生产想要的终产物，例如从液化物生产乙醇。该组合物的一个优点是其相对于由葡糖淀粉酶单独在基本上相同的条件下生产的乙醇的量，产生更大量的乙醇。在一个方面，相对于单独使用葡糖淀粉酶，该增加大于0.5%，优选大于1.0%、1.5%、2%禾口2.5%。葡糖淀粉酶葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3.)是将淀粉和糊精分解成葡萄糖的酶。葡糖淀粉酶是外切作用酶；它水解淀粉中的a1-4和a1-6糖苷键并释放葡萄糖。根据本发明有用的葡糖淀粉酶可以是野生型葡糖淀粉酶，其变体或片段或者杂合葡糖淀粉酶，该杂合葡糖淀粉酶源于例如一种微生物源的催化结构域和另一种微生物源的淀粉结合结构域。下面的葡糖淀粉酶是可以用于本发明所包含的工艺中的葡糖淀粉酶的非限制性实例。葡糖淀粉酶可以获自黑曲霉(Aspergillusniger)Gl和G2葡糖淀粉酶(Boel等人，(1984)EMBOJ.31097-1102；W092/00381,W000/04136和USP6,352,851)；泡盛曲霉(Aspergillusawamori)葡糖淀粉酶(W084/02921)；米曲霉(Aspergillusoryzae)葡糖淀粉酶(Hata等人，(1991)Agric.Biol.Chem.55941-949)和曲霉菌(Aspergillusshirousami)(参见Chen等人，(1996)Prot.Eng.9499-505；Chen等人，(1995)Prot.Eng.8575-582；和Chen等人，(1994)BiochemJ.302:275_281)的菌株。篮状菌(Talaromyces)如源自T.emersonii、T.leycettanus、T.duponti和嗜热篮状菌(T.thermophilus)的那些(W099/28488；USPNo.RE:32，153；USPNo.4，587，215)；木霉菌菌株，如里氏木霉(T.reesei)并且尤其是与USPat.Pub.No.2006-0094080公开的SEQIDNO:4具有至少80%、85%、90%和95%的序列同一性的葡糖淀粉酶；根霉菌菌株，如雪白根霉(R.niVeuS)和米根霉(R.oryzae)；毛霉菌(Mucor)菌株和腐质霉菌菌株，如灰腐质霉(H.grisea)(参见Boel等人，(1984)EMB0J.31097-1102；W092/00381；W000/04136;Chen等人，(1996)Prot.Eng.9499-505；Taylor等人，(1978)CarbohydrateRes.61:301_308；USP.4，514，496；USP4，092，434；USP4，618，579Jensen等人，(1988)Can.J.Microbiol.34:218_223和W02005/052148的SEQIDNO:3)。在一些实施方式中，葡糖淀粉酶将与W005/052148的SEQIDNO3的氨基酸序列具有至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%和99%序列同一性。其他用于本发明的葡糖淀粉酶包括获自罗氏阿太菌(Atheliarolfsii)及其变体的那些(W004/111218)。商品化使用的具有葡糖淀粉酶活性的酶生产自例如黑曲霉(来自GeneneorInternationalInc.的商品名DISTILLASE，0PTIDEXL-400和GZYMEG9904X)或根霉菌种类(来自ShinNihonChemicals,Japan的商品名CU.C0NC)。还有来自AmanoPharmaceuticals,Japan(Takahashi等人’(1985)J.Biochem.98663-671)白勺商品名为GLUCZYME的商品化消化酶。其他酶包括根霉菌属的三种形式的葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)，即“Glucl”(MW74，000)、“Gluc2”(MW58，600)禾口“Gluc3”(MW61，400)。酶制剂GC480(GenencorInternationalInc.)也用于本发明。上面提及的葡糖淀粉酶和商品化酶并不旨在限制本发明而只是作为实例提供。葡糖淀粉酶可以源自细菌、植物和真菌源的异源或内源蛋白表达。通过丝状真菌和酵母的若干菌株来生产用于本发明的优选的葡糖淀粉酶，特别是由木霉菌菌株分泌的葡糖淀粉酶。表1示出具有599个氨基酸的里氏木霉葡糖淀粉酶的推导的氨基酸序列(SEQIDNO:1)，催化结构域(SEQIDNO2)没有下划线并由第1-453位残基所表示；接头区域(SEQIDNO3)加下划线并由第454-491位残基所表示；而淀粉结合结构域SEQIDNO:4为黑体并由第492-599位残基所表示。表1里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)的成熟蛋白质序列(SEQIDNO1)1SVDDFISTETPIALNNLLCNVGPDGCRAFGTSAGAVIASPSTIDPDYYYM51WTRDSALVFKNLIDRFTETYDAGLQRRIEQYITAQVTLQGLSNPSGSLAD101GSGLGEPKFELTLKPFTGNWGRPQRDGPALRAIALIGYSKWLINNNYQST151VSNVIWPIVRNDLNYVAQYffNQTGFDLWEEVNGSSFFTVANQHRALVEGA201TLAATLGQSGSAYSSVAPQVLCFLQRFWVSSGGYVDSNINTNEGRTGKDV251NSVLTSIHTFDPNLGCDAGTFQPCSDKALSNLKVVVDSFRSIYGVNKGIP301AGAAVAIGRYAEDVYYNGNPWYLATFAAAEQLYDAIYVWKKTGSITVTAT351SLAFFQELVPGVTAGTYSSSSSTFTNIINAVSTYADGFLSEAAKYVPADG401SLAEQFDRNSGTPLSALHLTWSYASFLTATARRAGIVPPSWANSSASTIP451STCSGASVVGSYSRPTATSFPPSQTPKPGVPSGTPYTPLPCKTPTSVXVT8501FHELVSTQFGQTVKVAGSOiAALGNt/STSAAVRLBAVNTADNHPLWXGTm551LEHGDWSmYINVGQDGSVTWESDPUHTYTVBAVACVTQWKBDTWQS本发明人鉴定出负责葡糖淀粉酶活性的两个结构域，即结合结构域和催化结构域。这些结构域的保守突变可能产生具有葡糖淀粉酶活性的蛋白质。尽管这些结构域中的保守氨基酸取代不是所有都必然产生具有葡糖淀粉酶活性的蛋白质，但是本领域普通技术人员将预期这些保守取代中的许多将产生具有葡糖淀粉酶活性的蛋白质。此外，在该两个鉴定出的功能结构域以外的氨基酸取代不可能大大影响葡糖淀粉酶活性。在一些实施方式中，用于本发明的葡糖淀粉酶与SEQIDNO:1或2的氨基酸序列具有至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性。a淀粉酶根据本发明有用的a淀粉酶可以是野生型a淀粉酶，其变体或片段或者杂合a淀粉酶，该杂合a淀粉酶源于例如一种微生物源的催化结构域和另一种微生物源的淀粉结合结构域。或者，a淀粉酶可以是经遗传改造而酸稳定的变体。a淀粉酶也可以是具有颗粒淀粉水解活性(GSHE)的a淀粉酶，因为该酶用于将液化物中的更多的淀粉分解。真菌a淀粉酶的实例包括获自丝状真菌菌株的那些，包括但不限于曲霉菌(例如，黑曲霉、A.kawachi和米曲霉)；木霉菌属、根霉菌属、毛霉菌属和青霉菌属的菌株。在一些实施方式中，a淀粉酶获自曲霉菌(Aspergilluskawachi)的菌株或者里氏木霉的菌株。考虑用于本发明所包括的组合物和方法中的商业可得的a淀粉酶包括GZYME997；禾PCLARASEL(GenencorInternationalInc.)；TERMAMYL120-L，LC和SC以及SUPRA(NovozymesBiotech)；SANSUPER(NovozymesA/S)和FUELZYMEFL(Diversa/ValleyResearch)。在一些优选的实施方式中，根据本发明有用的a淀粉酶是酸稳定的a淀粉酶，其以有效量加入时，在pH范围为3.0至7.0，并且优选在pH范围3.5至6.5时具有活性，包括在pH约4.0、4.5、5.0、5.5和6.0时具有活性。根据本发明有用的酸稳定的a淀粉酶可以是真菌a淀粉酶或细菌a淀粉酶。优选的酸稳定的a淀粉酶包括获自曲霉菌(Aspergilluskawachi)(例如AkAA)、黑曲霉(例如AnAA)和里氏木霉(例如TrAA)的那些。表2示出曲霉菌(Aspergilluskawachi)a淀粉酶(AkAA)的成熟蛋白质序列(SEQIDNO5)o推定的接头是TTTTTTAATSTSKATTSSSSSSAAATTSSSCTATSTT(SEQIDN0:6)，加下划线。接头上游氨基酸包括催化结构域(SEQIDNO:7)，未加下划线。接头下游氨基酸包括淀粉结合结构域(SBD)(SEQIDNO:8)，粗体。SBD包括该多肽的最后102个氨基酸。表2Aspergilluskawachia淀粉酶的成熟蛋白质序列(AkAA)(SEQIDNO5)LSAAEWRTQSIYFLLTDRFGRTDNSTTATCNTGDQIYCGGSWQGIINHLDYIQGMGFTAIWISPITEQLPQDTSDGEAYHGYWQQKIYNVNSNFGTADDLKSLSDALHARGMYLMVDVVPNHMGYAGNGNDVDYSVEDPFDSSSYFHPYCLITDWDNLTMVQDCWEGDTIVSLPDLNTTETAVRTIWYDWVADLVSNYSVDGLRIDSVEEVEPDFFPGYQEAAGVYCVGEVDNGNPALDCPYQKYLDGVLNYPIYWQLLYAFESSSGSISNLY匪IKSVASDCSDPTLLGNFIENHDNPRFASYTSDYSQAKNVLSYIFLSDGIPIVYAGEEQHYSG⑶VPYNREATWLSGYDTSAELYTWIATTNAIRKLAISADSDYITYANDPIYTDSNTIAMRKGTSGSQIITVLSNKGSSGSSYTLTLSGSGYTSGTKLIEAYTCTSVTVDSNGDIPVPMASGLPRVLLPASVVDSSSLCGGSGNTTTTTTAATSTSKATTSSSSSSAAATTSSSCTATSTTLPITFEELVOTTYGERVYLSGSISQLGEWOTSDAVKLSADD<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>本发明人鉴定出负责a淀粉酶活性的两个结构域，即结合结构域和催化结构域。这些结构域的保守突变可能产生具有a淀粉酶活性的蛋白质。尽管这些结构域中的保守氨基酸取代不是所有都必然产生具有a淀粉酶活性的蛋白质，但是本领域普通技术人员将预期这些保守取代中的许多将产生具有a淀粉酶活性的蛋白质。此外，在该两个鉴定出的功能结构域以外的氨基酸取代不可能大大影响a淀粉酶活性。在一些实施方式中，a淀粉酶与SEQIDNO:5或7的氨基酸序列具有至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性。表3示出黑曲霉a淀粉酶(AnAA)的成熟蛋白质序列(SEQIDNO:9)。在表中，以第1-478位氨基酸(SEQIDNO:10)表示催化结构域，未加下划线。接头区域加下划线(SEQIDN0:11)。淀粉结合结构域为粗体(SEQIDN0:12)。表3黑曲霉a淀粉酶(AnAA)的成熟蛋白质序列(SEQIDNO9)LSAAEWRTQSIYFLLTDRFGRTDNSTTATCNTCDQIYCGGSWQGIINHLDYIQGMGFTAIWISPITEQLPQDTADGEAYHGYWQQKIYDVNSNFGTADDLKSLSDALHARGMYLMVDVVPNHMGYAGNGNDVDYSVFDPFDSSSYFHPYCLITDWDNLTMVQDCWEGDTIVSLPDLNTTETAVRTIWYDWVADLVSNYSVDGLRIDSVLEVEPDFFPGYQEAAGVYCVGEVDNGNPALDCPYQEYLDGVLNYPIYWQLLYAFESSSGSISDLY匪IKSVASDCSDPTLLGNFIENHDNPRFASYTSDYSQAKNVLSYIFLSDGIPIVYAGEEQHYSGGKVPYNREATWLSGYDTSAELYTWIATTNAIRKLAISADSAYITYANDAFYTDSNTIAMRKGTSGSQVITVLSNKGSSGSSYTLTLSGSGYTSGTKLIEAYTCTSVTVDSSGDIPVPMASGLPRVLLPASVVDSSSLCGGSGSNSSTTTTTTATSSSTATSKSASTSSTSTACmTSTSIAVTPEELVTOTYgBEIYLSGSISQLGDWiyrSDAVKMSAPPYTSSNPEWSVTVTLPVGTTPBTKFIKVESDGTVTWESDPNREYTVPECGSGETVVOTWR在一些实施方式中，a淀粉酶与SEQIDNO:9或10的氨基酸序列具有至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性。表4给出具有443个氨基酸的木霉菌a淀粉酶(TrAA)的成熟蛋白质序列(SEQIDN0:13)。这一a淀粉酶不含有SBD或接头。表4里氏木霉a淀粉酶(TrAA)(443个氨基酸)的成熟蛋白质序列(SEQIDNO13)DTAAWRSRTIYFALTDRIARGSGDTGGSACGNL⑶YCGGTFQGLESKLDYIKGMGFDAIffITPVVTSDDGGYHGYWAEDIDSINSHYGSADDLKSLVNAAHSKGFYMMVDVVANHMGYANISDDSPSPLNQASSYHPECDIDYNNQTSVENCWISGLPDLNTQSSTIRSLYQDWVSNLVSTYGFDGVRIDTVKHVEQDYWPGFVNATGVYCIGEVFD⑶PNYLLPYASLMPGLLNYAIYYPMTRFFLQQGSSQDMVNMHDQIGSMFPDPTALGTFVDNHDNPRFLSIKNDTALLKNALTYTILSRGIPIVYYGTEQAFSGGNDPANREDLWRSGFNAQSDMYDAISKLTYAKHAVGGLADNDHKHLYVADTAYAFSRAGGNMVALTTNSGSGSSAQHCFGTQVPNGRWQNVFDEGNGPTYSADGNGQLCLNVSNGQPIVLLSS在一些实施方式中，用于本发明的a淀粉酶与SEQIDNO13的氨基酸序列具有至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性。酸性真菌蛋白酶根据本发明有用的酸性真菌蛋白酶(AFP)可以是野生型酸性真菌蛋白酶，其变体或片段，或者遗传改造的突变AFP。酸性真菌蛋白酶包括例如，获自曲霉菌、木霉菌、毛霉菌和根霉菌，例如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉和米黑毛霉(M.miehei)的那些。AFP可以源自细菌、植物和真菌源的异源或内源蛋白表达。特别地，优选木霉菌的菌株分泌的AFP。表5示出来自里氏木霉的优选AFP的成熟蛋白质序列(355个氨基酸)(SEQIDNO14)。表5里氏木霉酸性真菌蛋白酶(AFP)的成熟蛋白质序列(SEQIDN014)KYGAPISDNLKSLVAARQAKQALAKRQTGSAPNHPSDSADSEYITSVSIGTPAQVLPLDFDTGSSDLWVFSSETPKSSATGHAIYTPSKSSTSKKVSGASWSISY⑶GSSSSGDVYTDKVTIGGFSVNTQGVESATRVSTEFVQDTVISGLVGLAFDSGNQVRPHPQKTWFSNAASSLAEPLFTADLRHGQNGSYNFGYIDTSVAKGPVAYTPVDNSQGFWEFTASGYSVGGGKLNRNSIDGIADTGTTLLLLDDNVVDAYYANVQSAQYDNQQEGVVFDCDEDLPSFSFGVGSSTITIPGDLLNLTPLEEGSSTCFGGLQSSSGIGINIF⑶VALKAALVVFDLGNERLGWAQK在一些实施方式中，用于本发明的酸性真菌蛋白酶与SEQIDN0:14的氨基酸序列具有至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性。二级酶虽然本发明的一些实施方式包括含至少一种酸稳定的a淀粉酶、至少一种葡糖淀粉酶和至少一种酸性真菌蛋白酶的组合物，但是该组合物可以任选地包括其它酶。例如，当该组合物用于不同应用时(例如淀粉加工应用)，可以进一步包括二级酶。根据本发明的掺和物组合物可以与发酵微生物以及其它组分和其它二级酶一起用于糖化步骤和/或发酵步骤。其它酶包括但不限于其它葡糖淀粉酶、其它a淀粉酶、其它蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、植酸酶、支链淀粉酶、脂肪酶、角质酶、果胶酶、3“葡聚糖酶、半乳糖苷酶、酯酶、环糊精转糖基转移酶(CGTase)，淀粉酶和它们的组合。在一些实施方式中，其他酶是二级酸稳定的a淀粉酶，例如真菌a淀粉酶。在一些实施方式中，二级a淀粉酶是GSHE，例如AkAA，TrAA或AsAA。其他可以与该掺和物组合使用的a淀粉酶的非限制性实例是源于芽孢杆菌、曲霉菌、木霉菌、根霉菌、镰孢(Fusarium)、青霉菌、脉孢菌(Neurospora)和腐质霉菌的那些。这些淀粉酶中的一些是商品化可得的，例如获自NovoNordiskA/S的TERMAMYL和SUPRA，获自Diversa的FUELZYMEFL,获自NovoNordiskA/S的LIQUEZYMESC以及获自GenencorInternational,Inc.的SPEZYMEFRED、SPEZYMEETHYL和GZYMEG997。在另一实施方式中，本发明可以包括植酸酶的添加。植酸酶是能够从肌醇六磷酸释放至少一种无机磷酸的酶。根据植酸酶对植酸分子上磷酸酯基团的特定位置(在11此处开始水解)的偏好将它们分类(例如，分类为3-植酸酶(EC3.1.3.8)或为6-植酸酶(EC3.1.3.26))。植酸酶的典型实例是肌醇六磷酸酯-3-磷酸水解酶。植酸酶可以获自微生物如真菌和细菌生物。这些微生物的一些包括例如曲霉菌(如，黑曲霉，土曲霉(A.terreus)和烟曲霉(A.fumigatus))、毁丝霉(Myceliophthora)(嗜热毁丝霉(M.thermophila))、篮状菌(Talaromyces)(嗜热篮状菌(T.thermophilus))、木霉菌属(里氏木霉)和嗜热丝孢菌(Thermomyces)(W099/49740)。植酸酶也可获自青霉菌种类，例如大麦青霉(P.hordei，ATCCNo.22053)，桧状青霉(P.piceum)(ATCCNo.10519)或短密青霉(P.brevi-compactum)(ATCCNo.48944)。参见例如USP6,475,762。此外，植酸酶获自隔孢伏革菌(Peniophora)，大肠杆菌、柠檬酸杆菌(Citrobacter)，产氢菌(Enterbacter)和布丘氏菌(Buttiauxella)(参见2005年10月17日递交的W02006/043178)。商品化植酸酶可获自例如NATUPHOS(BASF)、R0N0ZYMEP(NovozymesA/S)、PHZYME(DaniscoA/S,Diversa)和FINASE(ABEnzymes)0在一些优选的实施方式中，本发明有用的植酸酶是源自细菌布丘氏菌属的酶。布丘氏菌属包括乡间布丘氏菌(B.agrestis)，布里纳氏布丘氏菌(B.brennerae),费拉格布丘氏菌(B.ferragutiase),伽瓦尼布丘氏菌(B.gaviniae),伊查德氏布丘氏菌(B.izardii)，诺基亚布丘氏菌(B.noackiae)，和瓦姆波德布丘氏菌(B.warmboldiEie)。胃禾中g的胃自DSMZ，GermanNationalResourceCenterforBiologicalMaterial(Inhoffenstrabe7B,38124Braunschweig,Germany)。以登录号NCIMB41248保藏的布丘氏菌属菌株Pl-29是尤其有用的菌株，从该菌株可以获得植酸酶并按照本发明来使用。纤维素酶也可以与本发明的掺和物和/或组合物一起使用。纤维素酶是水解纤维素(3-l，4-D-葡聚糖键)和/或其衍生物例如磷酸溶胀纤维素的酶组合物。纤维素酶包括外切纤维二糖水解酶(CBH)、内切葡聚糖酶(EG)和葡糖苷酶(BG)的分类(EC3.2.191，EC3.2.1.4和EC3.2.1.21)。纤维素酶的实例包括来自青霉菌、木霉菌、腐质霉菌、镰孢(Fusarium)、嗜热单孢霉(Thermomonospora)、纤维单胞菌(Cellulomonas)、梭菌(Clostridium)和曲霉菌的纤维素酶。以饲料用途出售的商品化可获得的纤维素酶是3_葡聚糖酶，例如ROVABIO(Adisseo)、NATUGRAIN(BASF)、MULTIFECTBGL(DaniscoGenencor)禾口EC0NASE(ABEnzymes)。木聚糖酶也可以与本发明的掺和物和/或组合物一起使用。水解木聚糖主链的木聚糖酶(例如，内切_木聚糖酶(E.C.3.2.1.8)，可以获自细菌源，例如芽孢杆、II#(Streptomyces)、W.M(Clostridium)、fl；胃(Acidothermus)、/]、0？&胃(Microtetrapsora)或嗜热单孢霉(Thermonospora)。此外，木聚糖酶可以来自真菌源，例如曲霉菌、木霉菌、脉孢菌、腐质霉菌、青霉菌或镰孢(Fusarium)。(参见例如，EP473545；USP5,612,055；W092/06209;和W097/20920)。商品化制剂包括MULTIFECT和FEEDTREATY5(DaniscoGenencor),R0N0ZYMEWX(NovozymesA/S)以及NATUGRAINWHEAT(BASF)。其它蛋白酶也可以与本发明的掺和物和/或组合物一起使用。蛋白酶可以源自细菌或真菌源。细菌源蛋白酶包括来自芽孢杆菌，如解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、缓慢芽孢杆菌(B.lentus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的蛋白酶。这些来源包括枯草杆菌蛋白酶，例如获自解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶和它的突变体(USP4，760，025)。适合的商品化蛋白酶包括12MULTIFECTP3000(DaniscoGenencor)和SUMIZYMEFP(ShinNihon)。真菌蛋白酶源包括例如，木霉菌(例如NSP-24)、曲霉菌、腐质霉菌和青霉菌。酶掺和物组合物本发明的酶掺和物组合物包括葡糖淀粉酶、a淀粉酶和酸性真菌蛋白酶。三种酶组分可以以包括三种酶组分混合在一起的掺和物制剂来使用，或者可以在工艺步骤期间单独加入酶组分以产生本发明所包含的组合物。优选地，在淀粉转化步骤期间使用本发明的组合物以便维持下面定义的活性率。这可包括以按时间的方式加入组合物的单独组分以便维持该比率，例如同时加入该组分。在一些实施方式中，酶掺和物组合物包括a)与SEQIDNO1具有至少95%或至少97%的序列同一性的GA，与SEQIDNO5具有至少97%的序列同一性的AkAA以及AFP；b)与SEQIDNO1具有至少95%或至少97%的序列同一性的GA，酸稳定的AA，以及AFP；c)与SEQIDNO1具有至少95%或至少97%的序列同一性的GA，GSHEAA，以及与SEQIDNO:14具有至少90%、95%或99%序列同一性的AFP；d)GA,AkAA或TrAA，以及与SEQIDNO14具有至少95%或至少97%的序列同一性的酸性真菌蛋白酶；e)GA，AkAA，以及与SEQIDNO14具有至少95%或至少97%的序列同一性的酸性真菌蛋白酶；f)与SEQIDNO1具有至少95%或至少97%的序列同一性的GA，AkAA,以及与SEQIDNO14具有至少95%或至少97%的序列同一性的AFP；g)与SEQIDNO1具有至少95%或至少97%的序列同一性的GA，TrAA,以及与SEQIDNO14具有至少95%或至少97%的序列同一性的酸性真菌蛋白酶；h)与SEQIDNO1的序列具有至少95%的序列同一性的GA，与SEQIDN014的序列具有至少95%的序列同一性的AFP，以及与SEQIDN05的序列具有至少95%序列同一性的AA;i)与SEQIDNO1的序列具有至少98%序列同一性的GA，与SEQIDN014序列具有至少98%序列同一性的AFP，以及与SEQIDNO5的序列具有至少98%序列同一性的AA;以及j)STARGEN001，它是酸稳定Aspergilluskawachia淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶(商品化获自GenencorInternational,Inc)，和酸性真菌蛋白酶的掺和物。通常以用于葡糖淀粉酶的GAU，用于a淀粉酶的SSU，以及用于酸性真菌蛋白酶的SAPU来测量酶活性。在一些实施方式中，酶活性比率如下面所定义，其中每种酶的比率参考葡糖淀粉酶(GA)来显示。例如，GA(GAU)与AA(SSU)的比率从约11至约115，包括但不限于12、13、14、15、16、17、18、19禾P110。该比率可以低至11和高达115。在优选的实施方式中，GA(GAU)与AA(SSU)的比率从约11.5至约18，或从约12至约15。在一种优选的实施方式中，GA(GAU)与AA(SSU)的比率为14。在一些实施方式中，GA(GAU)与AFP(SAPU)的比率从约10.1至约15，包括但不限于10.2、10.3,10.4,10.5,10.6,10.7,10.8,10.9,11或高达15，包括12、13禾Pl4。优选地，GA(GAU)与AFP(SAPU)的比率在约10.1至11之间，或10.2至10.8，或10.2至10.6。在一种优选的实施方式中，GA(GAU)与AFP(SAPU)的比率为约10.4。在一种优选的组合物中，按GAUSSUSAPU来测量，葡糖淀粉酶、酸稳定的α淀粉酶和酸性真菌蛋白酶的比率为约11.50.1至约181。在另一种优选的组合物中，按GAUSSUSAPU来测量，葡糖淀粉酶、酸稳定的α淀粉酶和酸性真菌蛋白酶的比率为约120.2至约150.6。在一种优选的组合物中，GAAAAFP的比率为约140.4。如本文关于活性比率所使用，“约”意味着包括所述数值士15%。使用方法本发明还涉及从可发酵的糖生产终产物的方法。该方法包括步骤(a)将包括含有淀粉的研磨谷粒的浆液与α淀粉酶接触以生产液化物；(b)将该液化物与葡糖淀粉酶、酸稳定的α淀粉酶、和酸性真菌蛋白酶接触以生产可发酵的糖；和(C)在发酵微生物存在下，使该可发酵的糖发酵以生产终产物。在该方法中，步骤(b)糖化和步骤(C)发酵可以顺序发生或同时发生。葡糖淀粉酶、酸稳定的α淀粉酶、和酸性真菌蛋白酶可以分别地加入该液化物。或者，可以将包括葡糖淀粉酶、酸稳定的α淀粉酶、和酸性真菌蛋白酶的酶掺和物组合物加入该液化物。每一步都在下面详细说明。淀粉转化通过本领域已知的方法使包括植物材料的底物减小或研磨。植物材料可以获自小麦、玉米、黑麦、高粱(蜀黍)、稻、小米、燕麦、黑小麦、木薯(木薯粉)、马铃薯、甘薯、甜菜、甘蔗、以及豆类如大豆和豌豆。优选的植物材料包括玉米、燕麦、小麦、稻、蜀黍和它们的组合。植物材料可以包括杂交品种和遗传修饰的品种(例如包括异源基因的转基因玉米、大麦或大豆)。植物任何含有淀粉的部分可以用于生产液化物，包括但不限于植物部分如叶、茎、壳、外壳、块茎、穗轴、谷粒等。优选的全谷粒包括玉米、小麦、黑麦、大麦、高粱和它们的组合。在其它实施方式中，淀粉可以获自分级分离的谷物谷粒，包括纤维、胚乳和/或胚芽组分。分级分离的植物材料如玉米和小麦的方法是本领域已知的。在一些实施方式中，可以将获自不同来源的植物材料(例如玉米和蜀黍或玉米和大麦)混合在一起。研磨方法是本领域公知的并且参考THEALCOHOLTEXTBOOKAREFERENCEFORTHEBEVERAGE,FUELANDINDUSTRIALALCOHOLINDUSTRIES，第三版，K.A.Jacques等人编，(1999)NottinghamUniversityPress。参见第二禾口第四章。在一些实施方式中，通过研磨或其他手段减小的植物材料将与一溶液组合以产生包含淀粉底物的浆液。在一些实施方式中，该浆液可以包括来自淀粉工艺的侧流，例如回流物。在一些实施方式中，该浆液将包括15-55%ds(例如20-50%，25-45%，25-40%，和20-35%)0包括减小的植物材料的浆液可以进行液化工艺，其中可以在液化步骤期间加入α淀粉酶。这产生液化物。为了产生液化物，可以向该浆液中加入单一或分次剂量的α淀粉酶。本领域技术人员可以容易地确定用于液化处理中的α淀粉酶的有效剂量。在一些实施方式中，用于液化的α淀粉酶的量是对于造成大部分淀粉液化有效的量。在其它实施方式中，该量是使得大于40%，包括50%，60%，70%，80%，90%，和100%的淀粉液化的量。在一些实施方式中，该范围将是0.05至50AAU/gds，还有0.1至20AAU/gds以及还有1.0至lOAAU/gds。在进一步的实施方式中，α淀粉酶的剂量将在0.01至10.Okg/公吨(MT)ds；还有0.05至5.Okg/MTds；以及还有0.1至4.Okg/MTds的范围。在一些实施方式中，在比减小的植物材料的颗粒淀粉的淀粉凝胶化温度低0至30°C的温度下加入α淀粉酶。这一温度可以比淀粉凝胶化温度低0至25°C，0至20°C，0至15°C和0至10°C。这一特定值将变化并取决于包括该浆液的谷粒类型。例如，玉米的淀粉凝胶化温度通常高于黑麦或小麦的淀粉凝胶化温度。在一些实施方式中，温度将在45至80°C之间，还有在50至75°C之间，还有在50至72°C之间，以及在一些实施方式中，温度将低于68°C；低于65°C，低于62°C，低于60°C以及还有低于55°C。在其它实施方式中，温度将高于40°C，高于45°C，高于50°C，和高于55°C。在一些优选的实施方式中，孵育温度将在58至72°C之间以及还有在60至68°C之间。在一些实施方式中，浆液将维持在pH范围为约3.0至小于6.5，还有在pH范围为4.0至小于6.2，还有在pH范围为约4.5至小于6.0以及优选pH范围为约5.0至6.0(例如约5.4至5.8)，并且浆液中的研磨谷粒将与酶组合物接触2分钟至8小时的一段时间(例如5mins至3hrs；15mins至2.5hrs和30min至2hrs)。在进一步的步骤中，通过使孵育底物在PH为约4.0至6.5时暴露于在淀粉凝胶温度之上如0至55°C(例如至65°C到120°C，70VIlJIlO0C,70V到90V)的温度增加2分钟至8小时的一段时间(例如2分钟至6hrs,5分钟至4小时和优选Ihr至2hrs)而液化该孵育底物。在一些实施方式中，温度可以升至在约85-90°C之间的温度并且可以使用单剂量的α淀粉酶。如果温度升至高于90_105°C，那么可以在温度返回至正常后加入第二剂量的α淀粉酶。在进一步的实施方式中，温度可以升高至约105和140°C之间并且可以使用分次剂量的α淀粉酶，其一部分在升温前加入而另一部分在温度降至至少低于105°C加入，包括低于104、103、102、101、100、99、98、97、96、95、94、93、92、和91°C，但优选低于90°C。在一些实施方式中，生成的液化物在糖化之前冷却。糖化作用和发酵上面获得的液化物可以以单一剂量或分次剂量与葡糖淀粉酶、酸稳定的α淀粉酶以及酸性真菌蛋白酶接触，只要维持想要的酶比率。因此，分次剂量意味着以一部分以上，包括两部分或三部分加入想要比率的总剂量。在一个实施方式中，在开始时加入总剂量的一部分而在工艺中的指定时间加入第二部分。在一个实施方式中，在糖化(或SSF)开始时加入该剂量的至少一部分以开始糖化工艺。在一个实施方式中，可以分别而不是同时或在时间上足够近地将酶组合物中的每种酶加入液化物以便维持活性率。或者，可以在糖化和发酵中的一种或两种期间加入包含葡糖淀粉酶、酸稳定的α淀粉酶、和酸性真菌蛋白酶的酶掺和物组合物。葡糖淀粉酶、酸稳定的α淀粉酶、和酸性真菌蛋白酶的比率优选约11.50.1至约181，并且更优选约120.2至150.6，如按GAUSSUSAPU所测量。糖化工艺可以持续12至120小时。然而，通常进行糖化30分钟至2小时并且然后在发酵期间完成糖化。有时，这被称作同时糖化和发酵(SSF)。糖化通常在30至65°C的温度并且通常在pH为3.0至5.0，包括4.0至5.0进行。糖化可以导致可发酵糖的生成。在一些实施方式中，用发酵微生物对可发酵糖进行发酵。接触步骤和发酵步骤可以在相同的反应容器中同时进行或顺序进行。总体上，发酵工艺描述于AlcoholTextbook,第三片反，AReferencefortheBeverage,FuelandIndustrialAlcoholIndustries，Jacques等人编，(1999)NottinghamUniversityPress，UK。在一些实施方式中，该方法还包括使用可发酵糖(糊精，例如葡萄糖)作为发酵原料在适当的发酵条件下进行微生物发酵以获得终产物，例如醇类(例如，乙醇)、有机酸(例如，琥珀酸，乳酸)、糖醇(例如，丙三醇)、抗坏血酸中间产物(例如，葡糖酸、DKG，KLG)、氨基酸(例如，赖氨酸)、蛋白质(例如，抗体及其片段)。在一些优选的实施方式中，可发酵的糖与酵母在15至40°C，20至38°C，以及还有25至35°C的温度范围，在pH范围为pH3.O至6.5；还有pH3.O至6.O;pH3.O至5.5，pH3.5至5.O以及还有pH3.5至4.5下进行发酵5hrs至120小时，优选12至120和更优选24至90小时的一段时间以生产醇产物，优选乙醇。通常以每ml发酵培养液IO4至1012，并且优选IO7至IOltl个可见酵母计数的量来供应酵母细胞。发酵除了发酵微生物(例如酵母)养分外将包括任选地酸和其它酶。在一些实施方式中，除了上述原材料，发酵培养基将含有补充物，该补充物包括但不限于维生素(例如，生物素、叶酸、烟酸、核黄素)、辅因子和大量及微量养分和盐(例如(NH4)2SO4;K2HPO4；NaCl；MgSO4；H3BO3；ZnCl2；和CaCl2)。在一些优选的实施方式中，研磨的植物材料包括大麦、蜀黍、玉米和它们的组合，并且接触和发酵步骤在pH范围为3.5至5.5，温度范围为30-45°C下同时进行48至90hrs的一段时间，其中至少50%的淀粉溶解。终产物目前发酵工艺的一种优选的终产物是醇产物，例如乙醇。在进一步的实施方式中，终产物是发酵副产物，例如干酒糟(DDG)以及干酒糟及可溶物(DDGS)，它们可以用作动物饲料。在进一步的实施方式中，通过使用本领域已知的适当的发酵微生物，发酵终产物可以包括但不限于丙三醇、1，3-丙二醇、葡糖酸、2-酮基-D-葡糖酸、2，5-二酮基-D-葡糖酸、2-酮基-L-古洛糖酸、琥珀酸、乳酸、氨基酸和它们的衍生物。发酵生物发酵生物的实例是产乙醇微生物或生产乙醇的微生物，例如产乙醇细菌，该细菌表达乙醇脱氢酶和丙酮酸脱氢酶并且可以获自运动发酵单孢菌(Zymomonasmoblis)(参见例如，USP5，000，000；USP5，028，539，USP5,424，202；USP5，514，583和USP5，554，520)。在其它实施方式中，产乙醇微生物表达木糖还原酶和木糖醇脱氢酶(将木糖转化成木酮糖的酶)。在进一步的实施方式中，使用木糖异构酶将木糖转化成木酮糖。在具体优选的实施方式中，利用能够将戊糖和己糖发酵成乙醇的微生物。例如，在一些实施方式中，微生物可以是天然的或非遗传改造的微生物或者在其它实施方式中，微生物可以是重组微生物。发酵微生物包括但不限于来自芽孢杆菌、乳杆菌(LactoBacillus)、大肠杆菌、欧文氏菌(Erwinia)、泛菌(Pantoea)(例如柠檬泛菌(P.citrea))、假单胞菌(Pseudomonas)和克雷伯氏菌(Klebsiella)(例如产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca))的细菌。(参见例如USP5，028，539，USP5，424，202和WO95/13362)。芽孢杆菌是优选的发酵微生物。用于发酵步骤的发酵微生物将取决于待生产的终产物。在另一优选的实施方式中，产乙醇微生物是真菌微生物，例如木霉菌、酵母并且特别是酵母属(Saccharomyces)，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)(USP4,316,956)的菌株。多种酿酒酵母是商品化可获得的并且这些包括但不限于FALI(Fleischmarm’sYeast),SUPERSTART(Alltech)，FERMIOL(DSMSpecialties)，REDSTAR(Lesaffre)和安琪乙醇酵母(AngelYeastCompany,China)。例如，当乳酸是想要的终产物时，可以使用乳杆菌属(LactoBacillussp.)(干酪乳杆菌(Lcasei))；当丙三醇或1，3_丙二醇是想要的产物时，可以使用大肠杆菌；以及当2-酮基-D-葡糖酸，2，5-二酮基-D-葡糖酸，和2-酮基-L-古洛糖酸是想要的产物时，可以使用柠檬泛菌(Pantoeacitrea)作为发酵微生物。上面枚举的列表仅仅是实例并且本领域技术人员将知晓可以被适当地使用以获得想要的终产物的许多发酵微生物。终产物回收可以从发酵培养基中分离和/或纯化根据本发明工艺生产的终产物。分离和纯化的方法是已知的，例如，通过对培养基进行提取、蒸馏和柱层析。在一些实施方式中，通过对培养基进行高压液相层析(HPLC)分析来直接鉴定终产物。在进一步的实施方式中，糊状物可以通过例如离心而分离成液相和固相，并且回收终产物如醇和固体。可以通过诸如蒸馏和分子筛脱水或超滤的方法来回收醇。在一些实施方式中，在乙醇生产方法中使用本发明的酶掺和物或组合物将产生大于8%、10%、12%、14%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、和22%(ν/ν)的乙醇产量。任选地，在发酵后，可以通过例如蒸馏来提取醇(例如乙醇)。乙醇可以用于燃料，便携式或工业乙醇。实施例在下面的实施例中将更详细地描述本发明，该实施例不旨在以任何方式限制本发明主张的范围。附图意在和本发明的说明一起当做说明书的整体部分。所有引用的参考文献在此具体引用作为参考。下面的实施例提供对所主张发明的说明，但不限制它。在下面的公开内容和实验部分，应用下面的缩写(重量百分数)；°C(摄氏度);H20(水)；dH20(去离子水)；dIH20(去离子水，Milli-Q过滤)；g或gm(克)；yg(微克)；mg(毫克)；kg(千克)；μ(微升)；mL和ml(毫升)；mm(毫米)；tm(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩)；μΜ(微摩)；U(单位)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分钟)；hr(s)(小时)；D0(溶氧)；W/V(重量/体积)；W/W(重量/重量)；V/V(体积/体积)；IKA(IKAWorksInc.2635NorthChaseParkwaySE,Wilmington,NC)；Genencor(GenencorInternational,Inc.，PaloAlto,CA)；Ncm(牛顿厘米)和ETOH(乙醇)·eq(当量)；N(正常)；ds或DS(干物质含量)，SAPU(分光光度计测量的酸性蛋白酶单位，其中1SAPU是在检测条件下每分钟从酪蛋白底物释放1微摩尔酪氨酸的蛋白酶酶活性的量)和GAU(葡糖淀粉酶单位，其定义为按照每小时葡萄糖来计算，在PH4.2和60°C下，从可溶淀粉底物生产Ig还原糖的酶量)O材料和方法粘度测量使用玻璃烹饪器-粘度计，LR-2.ST系统IKA来测量粘度。简言之，该粘度计由具有锚定混合器的2000ml的双层玻璃容器组成，该混合器通过EurostarLabortechnik功率控制粘度计来搅拌(Viscoklick粘度计的粘度范围为0-600Ncm)。通常，对于在此描述的实施例，将包括淀粉底物的浆液和适量酶倒入粘度计容器中。在加热至85°C期间记录温度和粘度并继续孵育另外60至120mins。不时记录以Ncm测量的粘度。塵使用的葡糖淀粉酶是表1中SEQIDNO=I所示的里氏木霉GA(TrGA)(也参见US2006/0003408，公开于1/5/2006和US2006/0094080,公开于5/4/2006，它们都通过引用作为参考)。实施例中使用的酸性真菌蛋白酶是具有SEQIDNO:14的序列的里氏木霉蛋白质(也参见US2006/015342，公开于7/13Λ006，SEQIDNO10，其通过引用作为参考)，使用的α淀粉酶是在此SEQIDNO:5所示的Aspergilluskawachiα淀粉酶(AkAA)(美国专利7，205，138)。所有的专利申请在此通过整体引用作为参考。通过高压液相层析(HPLC)讲行碳水化合物分析通过维持在50°C并装有折射率(RI)检测器(ERC-7515A,RIDetector(AnspecCompanyInc.)的HPLC(BeckmanSystemGold32KaratFullerton，CA，配有HPLC柱(Rezex8u8%H,Monosaccharides)来测量寡糖的反应产物组分。根据分子量将糖分开。指定DPl为单糖，如葡萄糖；指定DP2为二糖，如麦芽糖；指定DP3为三糖，如麦芽三糖和指定“DP4+〃为具有4个或更多的聚合程度(DP)的寡糖。α淀粉酶活件(AAU)通过淀粉水解谏率来测定,其反映在由分光光度计测量的碘染色能力的减小速率。α淀粉酶活性的1个AAU是在标准化条件下每分钟水解IOmg淀粉所需的酶量。α淀粉酶活性按可溶淀粉单位(SSU)来测定并且基于在ρΗ4.5，50°C下，可溶马铃薯淀粉底物(4%DS)被等分的酶样品水解的程度。使用如Miller，G.L.(1959)Anal.Chem.31:426_428所述的DNS方法来测量还原糖含量。根据USP5，958，739公开的方法来测量用于SPEZYMEFRED的LiquifonUnits(LU)中的α淀粉酶活性。简言之，该检测方法使用对_硝基苯基麦芽庚糖苷作为底物，其非还原末端糖被化学封闭。对_硝基苯基释放速率与α淀粉酶活性成比例并且在410nm处监测释放。针对标准对照计算活性。葡糖淀粉酶活件单元(GAU)=使用PNPG检测来测量葡糖淀粉酶的活性。酸性真菌蛋白酶活性(SAPU)=酸性真菌蛋白酶活性是基于在ρΗ3.0和37°C下从30分钟蛋白水解的纯化的高氮酪蛋白底物释放的可溶的酪蛋白肽。未水解的底物与三氯乙酸一起沉淀并通过过滤而被移除。溶解的酪蛋白随后通过分光光度计测量。一个分光光度计酸性蛋白酶单位(SAPU)是在本方法的条件下，每克酶每分钟释放1微摩尔酪氨酸当量的活性。实施例1、TrGA、AkAA和AFP掺和物或组合物对乙醇发酵的影响这一实施例示出了葡糖淀粉酶、α淀粉酶和酸性真菌蛋白酶的掺和物在乙醇发酵中的出人意料的用处。分析了在酵母发酵期间；酸性真菌蛋白酶(来自Genencor-Danisco的FERMGEN)和酸稳定的α淀粉酶(具有SEQIDNO:5的AkAA)以及葡糖淀粉酶(里氏木霉或黑曲霉)对于碳转化效率(醇产量)的影响。研究了含有液化的完全磨过的玉米的培养基。通过用稀酒糟(获自NewEnergy,SouthBendIN的9·8%DS)将NewEnergy(SouthBendIN)液化物(39.8%DSff/ff)稀释到32%DS来制造糊状物。这一糊状物含有29.3%玉米DS。用6N硫酸将糊状物的pH调至4.2，加入600ppm尿素以及RedStarEthanol酵母接种物。在含有300gm的糊状物的500ml烧瓶中进行发酵。稀释酶以便将0.2ml加入烧瓶中。所有酶剂量为每gm的玉米DS。将烧瓶放在32°C水浴中并且不时混合。使用表6中示出的酶浓度。发酵期间，取出近2ml啤酒样品(培养液)用于HPLC分析。在螺口试管中向4.45ml水和0.05ml的IN硫酸中加入0.5ml的样品上清液。盖上试管并在75°C水中放置15分钟以使酶活性失活。加热后，通过0.2-微米过滤膜来过滤稀释后的样品用于HPLC分析。在600C，使用20-ul样品注射，以每分钟0.6ml的0.OlN硫酸移动相在Phenominex酸性柱上进行HPLC分离。71小时后，终止发酵并丢弃啤酒。表6中的HPLC结果显示了在酵母发酵期间酸稳定的α淀粉酶(AkAA)和酸性真菌蛋白酶(FERMGEN/AFP)的作用(0.25GAU的Tr-GA/gds玉米，32%ds，pH4.3，32°C)。聚合程度或DP是在聚合反应中于时间t时平均聚合物链的重复单元数。长度是单体单元。聚合程度是分子量的度量。DP-I的实例是单糖，如葡萄糖和果糖。DP-2的实例是二糖，如麦芽糖和蔗糖。DP-3指麦芽三糖。DP>3表示聚合程度大于3的聚合物。表6中的DP-1、DP-2和DP-3是由淀粉水解产生的糖。乳酸是在碳水化合物发酵时由乳杆菌细菌产生的有机酸。乳酸的产生是在污染的乙醇发酵中产量损失的主要原因。如此，常规监测乳酸。丙三醇是乙醇发酵的副产物；它常规被监测而作为酵母健康的指标。表6的结果示出了当酶掺和物中的AkAA水平增加时，高级糖还原(>DP3)率和因此的乙醇生产率以及最终的乙醇产量增加。表6=HPLC结果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>和糖谱组成的影响的HPLC数据。表7在酵母发酵下，0.325GAU的TrGA/gds中AkAA和AFP浓度对最终醇产量的影响。表8中名为“说明”一栏所示出的比率是GAUSSUSAPU0<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表8中的数据显示了相比于对照，加入酸性真菌蛋白酶(AFP)导致醇生产速率的增加，但是加入α淀粉酶(AkAA)产生甚至更高的醇产量。表8中总结的质量平衡数据显示了含有TrGA、AFP和AkAA的三种酶掺和物导致比TrGA单独结合AFP或AkAA更高的碳转化效率(2,67%)0表8来自不同酶比率的酵母发酵的质量平衡数据<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>来自蒸馏的醇产量显示出与CO2数值相同的趋势，其表明就每蒲式耳玉米的乙醇加仑值而言，含有7300和5000SSU/g的α淀粉酶的掺和物彼此相当并且比对照更好(参见表8)。表8中的数据显示了增加AkAA的剂量使得发酵最后的乙醇水平增加。最终啤酒的HPLC分析充分地显示了相同的趋势，然而没有达到CO2和蒸馏数值的程度。在酵母发酵条件下，使用液化的完全磨过的玉米，用不同的酶组合物获得的最终醇浓度与TrGA相比较并显示于图1。图1示出了在液化的完全磨过的玉米的酵母发酵期间，酸性真菌蛋白酶(SAPU)和酸稳定的α淀粉酶(SSU)加上TrGA对最终醇产量的影响。附图中按编号的不同酶混合物为1:TrGA,0.25GAU/gds玉米，2:No#l+0.05SAPUAFP/gds玉米，3:No#l+2.OSSU的α淀粉酶/gds.玉米，和4:No#l+0.05SAPU,AFP+2.OSSU的α淀粉酶/gds玉米。结果出人意料地显示了碳转化效率(每克玉米ds的醇产量)取决于酶掺和物组合物。含有AFP或AkAA的TrGA的醇产量的增加不是加性的，但是显示出出乎意料的协同效益。上面说明书中提及的所有出版物和专利都在此通过引用作为参考。本发明所述方法和系统的多种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的而不背离本发明的范围和精神。尽管本发明结合具体优选的实施方式进行了描述，但应理解不应将所主张的发明不恰当地局限于此些具体实施方式。事实上，旨在将对本领域技术人员显而易见的用于进行本发明所述模式的多种修改包括在下面的权利要求的范围内。权利要求一种组合物，包含葡糖淀粉酶、酸稳定的α淀粉酶和酸性真菌蛋白酶。2.根据权利要求1的组合物，其中按GAUSSUSAPU来测量，葡糖淀粉酶、酸稳定的α淀粉酶和酸性真菌蛋白酶的比率为约11.50.1至约181。3.根据权利要求2的组合物，其中按GAUSSUSAPU来测量，葡糖淀粉酶、酸稳定的α淀粉酶和酸性真菌蛋白酶的比率为约120.2至150.6。4.根据权利要求1的组合物，其中葡糖淀粉酶获自选自木霉菌、篮状菌、青霉菌、曲霉菌和腐质霉组成的组的真菌。5.根据权利要求1的组合物，其中葡糖淀粉酶包含与SEQIDNO1的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。6.根据权利要求5的组合物，其中葡糖淀粉酶包含SEQIDNO:1的氨基酸序列。7.根据权利要求1的组合物，其中酸稳定的α淀粉酶获自木霉菌或曲霉菌。8.根据权利要求1的组合物，其中酸稳定的α淀粉酶包含与SEQIDN0:5、7、9、10或13的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。9.根据权利要求8的组合物，其中葡糖淀粉酶包含SEQIDNO:5的氨基酸序列。10.根据权利要求1的组合物，其中酸性真菌蛋白酶获自木霉菌。11.根据权利要求1的组合物，其中酸性真菌蛋白酶包含与SEQIDNO14的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。12.根据权利要求11的组合物，其中酸性真菌蛋白酶包含SEQIDNO14的氨基酸序列。13.根据权利要求1的组合物，还包括其他酶，该其他酶选自第二种葡糖淀粉酶、第二种α淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、第二种蛋白酶、植酸酶、支链淀粉酶、β淀粉酶、脂肪酶、角质酶、果胶酶、β“葡聚糖酶、半乳糖苷酶、酯酶、环糊精转糖基转移酶和它们的组合。14.一种从可发酵的糖生产终产物的方法，包括步骤a.将包括含淀粉的研磨谷粒的浆液与α淀粉酶接触以生产液化物；b.将该液化物与葡糖淀粉酶、酸稳定的α淀粉酶以及酸性真菌蛋白酶相接触以生产可发酵的糖；以及c.在发酵生物存在下，将可发酵的糖发酵以生产终产物。15.根据权利要求14的方法，其中所述终产物是醇。16.根据权利要求14的方法，其中按GAUSSUSAPU来测量，葡糖淀粉酶、酸稳定的α淀粉酶和酸性真菌蛋白酶的比率为约11.50.1至约181。17.根据权利要求14的方法，其中步骤(b)和(c)顺序地发生。18.根据权利要求14的方法，其中步骤(b)和(c)同时发生。19.根据权利要求14的方法，其中步骤(b)在30-65°C和pH3.0-5.0下进行。20.根据权利要求14的方法，其中步骤(c)在15-40°C和pH3.0-6.5下进行。全文摘要本发明涉及包含葡糖淀粉酶、酸稳定的α淀粉酶和酸性真菌蛋白酶的酶掺和物组合物。本发明还涉及从可发酵的糖生产诸如醇的终产物的方法。该方法包括步骤(a)将包括含淀粉的研磨谷粒的浆液与α淀粉酶接触以生产液化物；(b)将该液化物与葡糖淀粉酶、酸稳定的α淀粉酶以及酸性真菌蛋白酶相接触以生产可发酵的糖；和(c)在发酵生物存在下，将可发酵的糖发酵以生产终产物。文档编号C12N9/62GK101827935SQ200880111682公开日2010年9月8日申请日期2008年10月14日优先权日2007年10月18日发明者J·K·舍蒂,O·J·兰特罗,S·布莱尼曼申请人:丹尼斯科美国公司