专利名称：：扶正化瘀五味子、虫草菌丝粉中间体指纹图谱质量检测方法
技术领域：
：本发明属五味子、发酵虫草菌粉中间体质量检测领域，特别是涉及一种扶正化瘀五味子、发酵虫草菌粉中间体指纹图谱质量检测方法。
背景技术：
：扶正化瘀药物组合物是由丹参、发酵虫草菌粉、桃仁、松花粉、绞股蓝、五味子六味药组成。目前上市有两种剂型(l)扶正化瘀胶囊2002年获得中国国家新药证书(国药证字Z20020053)，并批准国家药品标准WS3-459(Z-79)-2005(Z);(2)扶正化瘀片2005年获得国家新药证书(国药证字Z20050564)，并批准国家药品标准YBZ19332005-2009Z。扶正化瘀具有舒肝活血、益精养肝、化瘀解毒、软坚散结、增强机体免疫功能等作用，主治慢性乙型肝炎肝纤维化、早期肝硬化。考虑到扶正化瘀制剂六味药材的有效成分性质差异较大，因此在生产过程中针对不同药味选用不同的提取方法。其中五味子和发酵虫草菌粉采用醇提工艺，具体如下以约lg:2g比例，取五味子和发酵虫草菌粉适量，用70X乙醇加热回流提取2次，第一次1.5h，第二次lh，合并提取液，浓縮至相对密度1.1-1.2(50°C_55°C)，得醇提中间体。根据该提取工艺，醇提中间体中主要含五味子木质素成分，以及发酵虫草菌粉中的核苷类成分。近年来，指纹图谱技术已经成为中药复方质量控制与评价的重要手段，查阅国内外发表的文献，到目前为止没有扶正化瘀制剂醇提中间体指纹图谱分析的报道。因此本发明将弥补扶正化瘀制剂醇提中间体指纹图谱研究的空白。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种扶正化瘀五味子、发酵虫草菌粉中间体指纹图谱质量检测方法，该方法能全面控制扶正化瘀五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体的质量，以确保产品的质量稳定。本发明的一种扶正化瘀五味子、发酵虫草菌粉中间体指纹图谱质量检测方法，包括(—)检测方法A(1)五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体供试品制备称取五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体1.00克，置10mL容量瓶中，加50%甲醇58ml，超声处理20min，加50%甲醇至刻度，摇匀，过0.45um微孔滤膜，取续滤液作为五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体的供试品溶液；(2)梯度洗脱流动相用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，梯度洗脱条件为<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>色谱柱C18柱，流动相A相为0.05%磷酸-水，B相为乙腈；梯度洗脱A相0-60-120min，95-60-10%、B相5-40-90%，流速0.8-1.2ml/min，检测波长254nm，柱温20-40。C，进样量10-20ul;(二)检测方法B(1)五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体供试品制备称取五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体0.50克，置10mL容量瓶中，加水58ml，超声处理20min，加水至刻度，摇匀，过0.45um微孔滤膜，取续滤液作为五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体的供试品溶液；[OO17](2)梯度洗脱流动相用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，梯度洗脱条件为<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>色谱柱C18柱，流动相A相为水，B相为乙腈；梯度洗脱A相0_30min，100-93%、B相0-7%，流速0.8-1.2ml/min，检测波长261nm，柱温20-40。C，进样量10_20ul;(三)标准指纹图谱的建立选取10批不同批次的扶正化瘀药物组合物五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体，根据上述两种检测方法进行高效液相色谱指纹图谱分析，每个批次的药品获得2张不同波长下的指纹图谱，对HPLC指纹图谱中所有峰进行比较，确定了8个共有峰，并按出峰时间先后次序进行编号(图1);其中，根据检测方法A于254nm波长下获取的指纹图谱a中，确定了4个共有峰(14号峰)；根据检测方法B于261nm波长下获取的指纹图谱b中，确定了4个共有峰(58号峰)；经对照品定性鉴定，确认共有峰中，2号峰五味子醇甲，3号峰为五味子醇乙，4号峰为五味子甲素，6号峰为尿苷，7号峰为鸟苷，8号峰为腺苷；(四)指纹图谱的质量控制根据检测方法A于254nm波长下获取指纹图谱a，采用中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件(国家药典委员会)，将样品的HPLC指纹图谱与标准指纹图谱(或共有模式指纹图谱)进行比较，以4个共有峰计算得到的相似度应不得小于0.8;根据检测方法B于261nm波长下获取指纹图谱b，采用中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件(国家药典委员会)，将样品的HPLC指纹图谱与标准指纹图谱(或共有模式指纹图谱)进行比较，以4个共有峰计算得到的相似度应不得小于0.8。本发明采用两种样品前处理方法和色谱条件，建立了2张HPLC指纹图谱。其中指纹图谱1着重表达了扶正化瘀制剂醇提中间体中五味子木质素类成分的分布，指纹图谱2着重表达了扶正化瘀制剂醇提中间体中虫草核苷类成分的分布。通过色谱条件的优化，确定了色谱柱、流动相种类、流动相梯度、检测波长、柱温等色谱条件。有益效果1、用色谱的指纹特征，通过指纹图谱得到的量化参数，更有效地控制产品中间体的质量；2、考察了供试品溶液的稳定性，结果表明，在室温下，24小时之内，扶正化瘀药物组合物五味子、发酵虫草菌粉提中间体供试品溶液保持稳定，精密度和重复性试验，都表明相似度在0.8以上；3、经过对10批扶正化瘀制剂五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体的指纹图谱相似度进行计算，发现五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体的相似度在0.8-1.O之间。说明建立的扶正化瘀制剂五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体指纹图谱质控方法，重复性好，专属性强，操作简便，方法可靠，可以对扶正化瘀五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体质量进行科学、有效地评价，并且证实能够运用于实际生产中质量控制，满足企业对产品质量控制的需求。4、为扶正化瘀制剂进行指纹图谱质量控制提供了条件，同时也保证了扶正化瘀制剂的质量稳定。图1为扶正化瘀制剂五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体标准HPLC指纹图谱；其中，a为254nm，b为261nm;其中，2号峰五味子醇甲，3号峰为五味子醇乙，4号峰为五味子甲素，6号峰为尿苷，7号峰为鸟苷，8号峰为腺苷；图2为扶正化瘀五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体样品HPLC指纹图谱图；其中，a为254nm，b为261nm。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1成品、试剂及仪器的准备成品扶正化瘀醇提中间体来源上海黄海制药有限责任公司提取工艺以约lg:2g比例，取五味子和发酵虫草菌粉适量，用70X乙醇加热回流提取2次，第一次1.5h，第二次lh，合并提取液，浓縮至相对密度1.1-1.2(50°C_55°C)，得醇提中间体。根据该提取工艺，醇提中间体中主要含五味子木质素成分，以及发酵虫草菌粉中的核苷类成分；试剂甲醇(分析纯)来源上海振兴化工一厂；磷酸(分析纯)来源上海联合化工厂；乙腈(色谱纯)来源TediacompanyInc^水为纯净水。标准3]n:五味子酯甲来源成都思科华生物技术有限公司五味子醇乙来源成都思科华生物技术有限公司五味子醇甲来源中国药品生物制品检定所；腺苷来源中国药品生物制品鉴定所；尿苷来源中国药品生物制品鉴定所；鸟苷来源新乡拓新生化科技有限公司。仪器<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>[OO57](—)指纹图谱(254nm)的检测方法称取五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体1.00克，置10mL容量瓶中，加50%甲醇58ml，超声处理20min，加50%甲醇至刻度，摇匀，过0.45um微孔滤膜，取续滤液作为五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体的供试品溶液；色谱条件柱温30。C，检测波长254nm，进样量10ii1，色谱柱Alltima(250mmX4.6mm，洗脱条件见表l，表1指纹图谱1的洗脱条件5iim)c<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(二)指纹图谱(261nm)的检测方法称取五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体0.50克，置10mL容量瓶中，加水58ml，超声处理20min，加水至刻度，摇匀，过0.45um微孔滤膜，取续滤液作为五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体的供试品溶液；色谱条件柱温30。C，检测波长261nm，进样量:10ii1，色谱柱Alltima(250mmX4.6mm，5ym)。洗脱条件见表2，表2指纹图谱2的洗脱条件<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>在指纹图谱1测定条件确定后，通过对至少三批样品进行测定，计算相关参数，并在此基础上提出高效液相色谱系统的适用参数条件。即五味子醇甲对照品溶液(100yg/ml)的色谱峰面积重现性(RSD)不高于3%，保留时间重现性(RSD)不高于2%;色谱柱柱效以五味子醇甲计不少于15，000块理论塔板数。在指纹图谱测定条件2确定后，通过对至少三批样品进行测定，计算相关参数，并在此基础上提出高效液相色谱系统的适用参数条件。即腺苷对照品溶液(100iig/ml)的色谱峰面积重现性(RSD)不高于3%，保留时间重现性(RSD)不高于2%;色谱柱柱效以腺苷计不少于15，000块理论塔板数。扶正化瘀药物组合物五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体样品指纹图谱图见图2。对10个批次的扶正化瘀醇提中间体进行指纹图谱分析，每个中间体获得2张HPLC指纹图谱。采用中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件(2004A版，中国药典委员会)分别对2种指纹图谱的相似度进行计算。采用共有峰模式，设定时间窗宽度为0.lmin，以平均数法生成对照指纹图谱，分别将样品的2张HPLC指纹图谱与相应的标准指纹图谱进行比较，结果表明，10批扶正化瘀醇提中间体的2张指纹图谱与相应的标准指纹图谱的相似度均在O.8-1.0之间。说明建立的扶正化瘀醇提中间体指纹图谱质控方法，操作简便，方法可靠，证实能够运用于实际生产中质量控制，满足企业对产品质量控制的需求。权利要求一种扶正化瘀五味子、发酵虫草菌粉中间体指纹图谱质量检测方法，包括(一)检测方法A(1)五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体供试品制备称取五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体1.00克，置10mL容量瓶中，加50％甲醇5～8ml，超声处理20min，加50％甲醇至刻度，摇匀，过0.45um微孔滤膜，取续滤液作为五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体的供试品溶液；(2)梯度洗脱流动相用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，梯度洗脱条件为流动相A相为0.05％磷酸-水，B相为乙腈；梯度洗脱A相0-60-120min，95-60-10％、B相5-40-90％，流速0.8-1.2ml/min，检测波长254nm，柱温20-40℃，进样量10-20ul；(二)检测方法B(1)五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体供试品制备称取五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体0.50克，置10mL容量瓶中，加水5～8ml，超声处理20min，加水至刻度，摇匀，过0.45um微孔滤膜，取续滤液作为五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体的供试品溶液；(2)梯度洗脱流动相用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，梯度洗脱条件为流动相A相为水，B相为乙腈；梯度洗脱A相0-30min，100-93％、B相0-7％，流速0.8-1.2ml/min，检测波长261nm，柱温20-40℃，进样量10-20ul；(三)标准指纹图谱的建立选取10批不同批次的扶正化瘀药物组合物五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体，根据上述两种检测方法进行高效液相色谱指纹图谱分析，每个批次的药品获得2张不同波长下的指纹图谱，对HPLC指纹图谱中所有峰进行比较，确定了8个共有峰，并按出峰时间先后次序进行编号；其中，根据检测方法A于254nm波长下获取的指纹图谱a中，确定了4个共有峰(1～4号峰)；根据检测方法B于261nm波长下获取的指纹图谱b中，确定了4个共有峰(5～8号峰)；确认共有峰中，2号峰五味子醇甲，3号峰为五味子醇乙，4号峰为五味子甲素，6号峰为尿苷，7号峰为鸟苷，8号峰为腺苷；(四)指纹图谱的质量控制根据检测方法A于254nm波长下获取指纹图谱a，，将样品的HPLC指纹图谱与标准指纹图谱进行比较，以4个共有峰计算得到的相似度应不得小于0.8；根据检测方法B于261nm波长下获取指纹图谱b，，将样品的HPLC指纹图谱与标准指纹图谱进行比较，以4个共有峰计算得到的相似度应不得小于0.8。全文摘要本发明涉及一种扶正化瘀五味子、发酵虫草菌粉中间体指纹图谱质量检测方法，包括将制备的五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体供试品分别于254nm和261nm下进行流动相的梯度洗脱；选取10批不同批次的扶正化瘀药物组合物五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体，根据上述两种检测方法进行高效液相色谱指纹图谱分析，每个批次的药品获得2张不同波长下的指纹图谱，确定了8个共有峰；将样品的HPLC指纹图谱分别与254nm和261nm下的标准指纹图谱进行比较，以8个共有峰计算得到的相似度应不得小于0.8。本发明的检测方法能全面控制扶正化瘀五味子、发酵虫草菌粉醇提中间体的质量，以确保产品的质量稳定。文档编号G01N30/36GK101708234SQ20091020148公开日2010年5月19日申请日期2009年12月18日优先权日2009年12月18日发明者潘一峰,胡坪申请人:上海现代中医药技术发展有限公司