一种与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法，经过虫草菌种的筛选、驯化，得到性状稳定的虫草菌株，通过液体逐级扩大培养、发酵培养和分离培养，采用一定的发酵培养基配方及分离培养基配方等，并在培养过程中经过一定的温差及光照刺激、分离培养方法等工艺，得到无需进行提纯和深加工的固体活性虫草菌丝体，远远超出现有人工制备虫草菌丝体的含量，更加适合大规模工业化生产，而且本发明所制备的虫草菌丝体可不经加工直接食用，最大限度的保留了虫草菌丝体的生物活性，且具有气味清香、口感好、食用便捷和药用保健功效高等优点。
【专利说明】一种与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及保健食品生产领域，尤其涉及一种与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法
【背景技术】
[0002]随着人们生活水平的日益提高，社会活动频率的不断加快，社会各界成功人士和广大中青年工作者负荷进一步加大，中老年人和部分少年儿童急需改善和增强体质，为此研制高级天然营养保健食品成为一个急待开发的重要领域。
[0003]冬虫夏草为我国具有悠久药用历史的滋补强壮名贵中药，近代药理药化研究表明其含有腺苷、甘露醇及人体必须的18种氨基酸和富含多种有益于身体健康的微量元素，具有降血脂、防治动脉硬化、扩张血管、保护心脑组织、镇静安神、增强巨噬细胞、提高免疫功能、抑制小鼠艾氏腹水癌、抗炎、抗菌、耐缺氧的良好作用。
[0004]由于天然虫草有其严格的寄生性及特殊的生长环境，加之近年来生态环境的严重破坏，天然虫草资源锐减，价格猛涨。随着人民生活水平的不断提高，对虫草的需求量正日益增大，因此，人工培养虫草菌丝体替代天然虫草成为当务之急。现代科学研究表明，虫草菌丝体中大部分有效成分的含量基本与天然冬虫夏草相同，虫草菌丝体同样具有提高人体免疫力、抗疲劳、预防心脑血管疾病及抗肿瘤等多种促进人体健康的功能，产品保健功效显著，是天然冬虫夏草理想的替代品，有广阔的发展前景。 [0005]但是，目前虫草菌丝体难以工业化大规模生产，目前所公开的人工虫草菌丝体的制备方法中一方面普遍具有菌丝体含量低的缺点，菌丝体与培养基的质量比约为1: 61，且含量不稳定；另一方面普遍存在虫草菌丝体与培养基不易完全分离，且分离的工艺方法非常复杂，一方面影响虫草菌丝体的生物活性，另一方面影响虫草菌丝体的纯度和口感，且大大增加虫草菌丝体的生产成本。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对一般虫草菌丝体制备方法的不足，提供一种与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法，本发明经过将含有虫草菌丝的发酵产物进行一定条件的分离培养，使虫草菌丝体在生长过程中自然与分离培养基分离，从而得到纯的固体活性虫草菌丝体，省略一般虫草菌丝体人工制备中的分离纯化工艺，降低生产成本，更加适合大规模工业化生产，而且最大可能的保留并提高虫草菌丝体的生物活性，提高产品的药用保健功效。
[0007]本发明的另一个目的是，通过在对虫草菌种的筛选、驯化过程中采取一定的温差及光照刺激培养，得到优良的，性状稳定的虫草菌种，有利于虫草菌种的后期培养。
[0008]本发明的又一个目的是，通过在虫草菌种进行液体培养的营养液中添加一定的微量元素，使虫草菌丝体的产量得到大幅度提高。
[0009]本发明的技术方案为:[0010]一种与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法，包括以下步骤:
[0011]将含有虫草菌丝的发酵产物低温出罐后分装到装有一定分离培养基的分装器皿中进行暗培养，培养至有虫草菌丝体长出并与所述分离培养基分离，其中所述分离培养基包含下列重量份的组分:葡萄糖8-12，豆柏1-3及无菌水800-1200 ；
[0012]此外，还包括以下步骤:
[0013]步骤一、虫草菌种的筛选，将虫草菌丝接种于蚕蛹，通过自然培育法进行培育，在经过一定条件的温差和光照刺激后，选取优良虫草菌株作为虫草菌种，并将虫草菌种继续培养至孢子成熟；
[0014]步骤二、虫草菌种的驯化，将孢子成熟的虫草菌种的子囊部位组织悬于装有一定浓度生理盐水的组织培养瓶顶部，进行一定条件的光照培养后将生理盐水转接液体培养基进行液体培养，得到性状稳定的虫草菌株；
[0015]步骤三、发酵培养，将所得到的性状稳定的虫草菌株逐级扩大培养后，接种发酵罐进行一定时间的变温好氧发酵，得到含有虫草菌丝的发酵产物。[0016]优选的是，所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法中，步骤三中发酵所用培养基包含下列重量份的组分:土豆粉8-12，蛋白胨2-4，葡萄糖20-30及无菌水800-1200 ；
[0017]所述变温好氧发酵的发酵条件为:充氧量8.5-9.0ppm, 15-17度培养2_3天后，继续于18-19度培养1-2天，然后于19-21度培养3_5天。
[0018]优选的是，所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法中，步骤四中所述发酵产物与分离培养基的重量比为1: 13-18，所述分装器皿的装量为总容积的16-18%，分装完成后于20-24度进行暗培养35-40天。
[0019]优选的是，所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法中，步骤一中所述虫草菌丝通过以下方法得到:切取虫草菌株子囊部位组织，将其进行外部消毒处理后，加入到装有少量无菌0.5-1%葡萄糖培养液的组织培养瓶中，于22-24度进行组织分离培养3-7天后，经过分离得到虫草菌丝。
[0020]优选的是，所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法中，步骤一中所述自然培育法包括以下步骤:
[0021]步骤一，将虫草菌丝接种于蚕蛹，将接种虫草菌丝的蚕蛹进行变温培养，所述变温培养的培养温度顺次为:12-14度培养2-3天，14-16度培养1_2天，18-19度培养1_2天，
19-21度培养至蚕蛹僵化且有菌丝长出蚕蛹；
[0022]步骤二、将长出菌丝的蚕蛹进行总温差为7-8度的梯度温度变化刺激培养2-7天，设定湿度为60-70度，温度变化率为1-2度/小时。
[0023]优选的是，所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法中，所述自然培育法的步骤二中，在进行温度刺激培养至菌丝呈一定的团球状时对培养物进行不低于200勒克斯的光照刺激。
[0024]优选的是，所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法中，步骤二中所述光照培养方法为26-30度光照培养30-40小时；所述液体培养方法为将所述生理盐水接种于含有全麦汁的试管中，于17-19度培养2-5天。
[0025]优选的是，所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法中，可将得到的性状稳定的菌株接种固体斜面进行保存，所述固体斜面采用全营养培养基制成，保存温度为3-4度。
[0026]优选的是，所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法中，所述性状稳定的菌株接种固体斜面进行保存后，在使用前需对菌株进行菌株活化，所述菌株活化的方法为:将接种有性状稳定的菌株的固体斜面于16-18度放置1-2小时后，将菌株转接至麦汁营养液中，于16-18度培养2-4天。
[0027]优选的是，所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法中，步骤三中所述逐级扩大培养方法为:将性状稳定的菌株逐级转接营养液进行液体摇床培养，每级转接扩培比例小于或等于40倍，其中所述营养液包括下列重量份的组分:土豆粉15-25，微量元素组合物，葡萄糖15-25及无菌水800-1200 ;其中所述微量元素组合物包括磷酸二氢钾1-3、硫酸亚铁0.5-2、硫酸镁0.3-1和碳酸钙1-3中的一种或几种。[0028]本发明具有以下有益效果:本发明所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法中，通过将含有虫草菌丝的发酵产物进行一定条件的分离培养，使虫草菌丝体在生长过程中自然与分离培养基分离，从而得到纯的固体活性虫草菌丝体，得到无需进行提纯和深加工的固体活性虫草菌丝体,节省了一般方法中对虫草菌丝体进行提纯和加工的生产成本，且其虫草菌丝体含量达95 %以上，远远超出现有人工制备虫草菌丝体的含量，避免了一般的人工培养虫草菌丝体含量低且不稳定的不足，而且最大可能的保留并提高虫草菌丝体的生物活性，提高了产品的药用保健功效，其生物活性比一般人工制备的虫草菌丝体的生物活性提高30%以上，且具有气味清香、口感好、食用便捷和药用保健功效高等优点，适合大规模工业化生产。
[0029]另外，通过在对虫草菌种的筛选、驯化过程中采取一定的温差及光照刺激培养，得到优良的，形态稳定的虫草菌种，有利于虫草菌种的后期培养，尤其是通过在虫草菌种进行液体培养的营养液中添加一定的微量元素组合物，使虫草菌丝体的产量得到大幅度提高，其产量比目前一般人工制备虫草菌丝体的方法提高20-30%。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为本发明所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法流程图。【具体实施方式】
[0031]下面结合附图1对本发明做详细说明，以令本领域普通技术人员参阅本说明书后能够据以实施。
[0032]如图1所示，一种与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法，包括以下步骤:
[0033]步骤一、虫草菌种的筛选。选取优良的新鲜冬虫夏草菌株，切取虫草菌株子囊部位组织，将其进行外部消毒处理后，加入到底部装有少量无菌0.5-1%葡萄糖培养液的组织培养瓶中，于22-24度进行组织分离培养3-7天后，经过离心等分离方法分离得到虫草菌丝。将虫草菌丝接种于蚕蛹，在生物培养箱中设定一定的培养条件，通过自然培育法进行培育，在经过一定的温差和光照刺激的培育后，选取优良虫草菌株作为虫草菌种，并将虫草菌种继续培养至孢子成熟。[0034]其中所述自然培育法具体为:将接种有虫草菌丝的蚕蛹在生物培养箱中进行变温培养，所述变温培养的培养温度顺次为:12-14度培养2-3天，14-16度培养1_2天，18-19度培养1-2天，19-21度培养至蚕蛹僵化且有菌丝长出蚕蛹，将长出菌丝的蚕蛹进行总温差为7-8度的梯度温度变化刺激培养2-7天，设定湿度为60-70度，温度变化率为1_2度/小时，既通过设定生化培养箱的参数，使培养箱内的温度从13度开始以每小时上升I度的速度升至20-21度后，按照该速度逐渐下落到13度，并按照此规律循环变动进行梯度温度变化刺激，当培养至菌丝呈一定的团球状时，肉眼辨别为接种虫草菌丝处出现直径约0.2-1毫米的凸起时，对培养物进行不低于200勒克斯的光照刺激，并继续培养至形成子实体，选择优良的菌株，待其孢子成熟后进行虫草菌种的驯化。
[0035]步骤二、虫草菌种的驯化，将孢子成熟的虫草菌种的子囊部位组织用解剖刀切下，悬于装有0.5-1%浓度生理盐水的组织培养瓶顶部，进行一定条件的光照培养后将生理盐水转接液体培养基进行液体培养，得到性状稳定虫草菌株，其中所述光照培养方法为26-30度光照培养30-40小时；所述液体培养方法为将所述生理盐水接种于含有全麦汁的试管中，于17-19度培养2-5天，全麦汁优选浓度为10-12%的全大麦麦汁。
[0036]步骤三、发酵培养，将所得到的性状稳定的虫草菌株逐级扩大培养后，接种发酵罐进行一定时间的变温好氧发酵，得到含有虫草菌丝的发酵产物。其中所述逐级扩大培养方法为:将性状稳定的菌株逐级转接营养液进行液体摇床培养，培养温度为16-19度，每级转接扩培比例小于或等于40倍，所述营养液包括下列重量份的组分:土豆粉15-25，微量元素组合物，葡萄糖15-25及无菌水800-1200 ;其中所述微量元素组合物包括磷酸二氢钾1_3、硫酸亚铁0.5-2、硫酸镁0.3-1和碳酸钙1-3中的一种或几种。
[0037]发酵所用的培养基 包含下列重量份的组分:土豆粉8-12，蛋白胨2-4，葡萄糖
20-30及无菌水800-1200。所述变温好氧发酵的发酵条件为:充氧量8.5-9.0ppm, 15-17度培养2-3天后，继续于18-19度培养1-2天，然后于19-21度培养3_5天，然后低温出罐。
[0038]步骤四、分离培养，将发酵产物低温出罐后分装到装有一定分离培养基的分装器皿中进行暗培养，待虫草菌丝体与所述分离培养基分离后进行采收，其中所述分离培养基包括下列重量份的组分:葡萄糖8-12，豆柏1-3及无菌水800-1200。所述发酵产物与分离培养基的重量比为1: 13-18，所述分装器皿的装量为总容积的16-18%，分装完成后于20-24度在无菌间进行暗培养35-40天，待虫草菌丝体与分离培养基有效分离后，将虫草菌丝体采收，并在无菌环境下自然低温晾干。
[0039]所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法中，也可将得到的性状稳定的菌株接种固体斜面进行保存，所述固体斜面采用全营养培养基加琼脂制作而成，保存温度为3-4度。在接种使用前需对固体斜面保存的菌株进行菌株活化，所述菌株活化的方法为:将接种有性状稳定的菌株的固体斜面于16-18度放置1-2小时后，将菌株转接至麦汁营养液中，于16-18度培养2-4天，得到活化复壮的虫草菌株。
[0040]实施例1
[0041]选取优良的新鲜冬虫夏草菌株，切取虫草菌株子囊部位组织，将其进行外部消毒处理后，加入到底部装有少量无菌1%葡萄糖培养液的组织培养瓶中，于22-24度进行组织分离培养3-7天后，经过离心等分离方法分离得到虫草菌丝。选取优质蚕蛹，将虫草菌丝接种于蚕蛹，在生物培养箱中设定一定的培养条件，通过自然培育法进行培育，培养温度顺次为13度2天，14度I天，19度一天，20度培养至蚕蛹僵化且有菌丝长出蚕蛹，将长出菌丝的蚕蛹进行总温差为7-8度的梯度温度变化刺激培养2-7天，设定湿度为60-70度，温度变化率为1-2度/小时，既通过设定生化培养箱的参数，使培养箱内的温度从13度开始以每小时上升I度的速度升至20-21度后，按照该速度逐渐下落到13度，并按照此规律循环变动进行梯度温度变化刺激，当培养至菌丝呈一定的团球状时，肉眼辨别为接种虫草菌丝处出现直径约0.2-1毫米的凸起时，对培养物进行不低于200勒克斯的光照刺激，并继续培养至形成子实体，选择优良的菌株，待其孢子成熟后进行虫草菌种的驯化。
[0042]虫草菌种的驯化方法为，将孢子成熟的虫草菌种的子囊部位组织用解剖刀切下，悬于装有0.75%浓度生理盐水的组织培养瓶顶部，28度光照培养36小时后将生理盐水转接含有10-12%的全大麦麦汁的试管中，于18度培养4-5几天,得到性状稳定的虫草菌株。将得到的性状稳定的菌株接种全营养培养基加琼脂制作的斜面，于3-4度进行保存。在接种使用前进行菌株活化和复壮，所述菌株活化的方法为:将接种有性状稳定的菌株的固体斜面于16-18度放置1-2小时后,将菌株转接至麦汁营养液中，于18度培养3天。
[0043]将性状稳定的菌株逐级转接营养液进行液体摇床培养，培养温度为18度，每级转接扩培比例小于或等于40倍，其中营养液包括下列重量份的组分:土豆粉20，磷酸二氢钾2，硫酸亚铁I，硫酸镁0.5，葡萄糖20及无菌水1000。经过逐级扩大培养后，接种发酵罐进行一定时间的变温好氧发酵，发酵所用的培养基包含下列重量份的组分:土豆粉10，蛋白胨3，葡萄糖25及无菌水1000，发酵罐充氧量8.5-9.0ppm,发酵温度和时间顺次为，16度培养2天，18度培养I天，20度培养4天得到含有虫草菌丝的发酵产物，然后低温出罐。将含有虫草菌丝的发酵产物分装到装有一定分离培养基的分装器皿中于22度在无菌间进行暗培养35-40天，所述分离培养基包括下列重量份的组分:葡萄糖10，黄豆柏2及无菌水1000，发酵产物与分离培 养基的重量比为1: 15，所述分装器皿的装量为总容积的16-18%。待虫草菌丝体与所述分离培养基分离后进行采收，并在无菌环境下自然低温晾干，得到本发明所述固体活性虫草菌丝体。
[0044]尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
【权利要求】
1.一种与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法，其特征在于， 将含有虫草菌丝的发酵产物低温出罐后分装到装有一定分离培养基的分装器皿中进行暗培养，培养至有虫草菌丝体长出并与所述分离培养基分离，其中所述分离培养基包含下列重量份的组分:葡萄糖8-12，豆柏1-3及无菌水800-1200 ； 此外，还包括以下步骤: 步骤一、虫草菌种的筛选，将虫草菌丝接种于蚕蛹，通过自然培育法进行培育，在经过一定条件的温差和光照刺激后，选取优良虫草菌株作为虫草菌种，并将虫草菌种继续培养至孢子成熟； 步骤二、虫草菌种的驯化，将孢子成熟的虫草菌种的子囊部位组织悬于装有一定浓度生理盐水的组织培养瓶顶部，进行一定条件的光照培养后将生理盐水转接液体培养基进行液体培养，得到性状稳定的虫草菌株； 步骤三、发酵培养，将所得到的性状稳定的虫草菌株逐级扩大培养后，接种发酵罐进行一定时间的变温好氧发酵，得到含有虫草菌丝的发酵产物。
2.如权利要求1所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法，其特征在于，步骤三中发酵所用培养基包含下列重量份的组分:土豆粉8-12，蛋白胨2-4，葡萄糖20-30 及无菌水 800-1200 ； 所述变温好氧发酵的发酵条件为:充氧量8.5-9.0ppm, 15-17度培养2_3天后，继续于18-19度培养1-2天，然后于19-21度培养3_5天。
3.如权利要求1所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法，其特征在于，步骤四中所述发酵产物与分离培养基的重量比为1: 13-18，所述分装器皿的装量为总容积的16-18%，分装完成后于20-24度进行暗培养35-40天。
4.如权利要求1所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法，其特征在于，步骤一中所述虫草菌丝通过以下方法得到: 切取虫草菌株子囊部位组织，将其进行外部消毒处理后，加入到装有少量无菌0.5-1%葡萄糖培养液的组织培养瓶中，于22-24度进行组织分离培养3-7天后，经过分离得到虫草菌丝。
5.如权利要求4所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法，其特征在于，步骤一中所述自然培育法包括以下步骤: 步骤一，将虫草菌丝接种于蚕蛹，将接种虫草菌丝的蚕蛹进行变温培养，所述变温培养的培养温度顺次为:12-14度培养2-3天，14-16度培养1_2天，18-19度培养1_2天，19-21度培养至蚕蛹僵化且有菌丝长出蚕蛹； 步骤二、将长出菌丝的蚕蛹进行总温差为7-8度的梯度温度变化刺激培养2-7天，设定湿度为60-70度，温度变化率为1-2度/小时。
6.如权利要求5所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法，其特征在于，所述自然培育法的步骤二中，在进行温度刺激培养至菌丝呈一定的团球状时对培养物进行不低于200勒克斯的光照刺激。
7.如权利要求1所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法，其特征在于，步骤二中所述光照培养方法为26-30度光照培养30-40小时；所述液体培养方法为将所述生理盐水接种于含有全麦汁的试管中，于17-19度培养2-5天。
8.如权利要求7所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法，其特征在于，可将得到的性状稳定的菌株接种固体斜面进行保存，所述固体斜面采用全营养培养基制成，保存温度为3-4度。
9.如权利要求8所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法，其特征在于，所述性状稳定的菌株接种固体斜面进行保存后，在使用前需对菌株进行菌株活化，所述菌株活化的方法为: 将接种有性状稳定的菌株的固体斜面于16-18度放置1-2小时后，将菌株转接至麦汁营养液中，于16-18度培养2-4天。
10.如权利要求1所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法，其特征在于，步骤三中所述逐级扩大培养方法为: 将性状稳定的菌株逐级转接营养液进行液体摇床培养，每级转接扩培比例不大于40倍，所述营养液包括下列重量份的组分:土豆粉15-25，微量元素组合物，葡萄糖15-25及无菌水800-1200 ;其中所述微量元素组合物包括磷酸二氢钾1-3、硫酸亚铁0.5-2、硫酸镁.0.3-1和碳酸钙1-3中的一种或几种。
【文档编号】C12R1/645GK103897991SQ201410161231
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月22日 优先权日:2014年4月22日
【发明者】杨秀芬 申请人:杨秀芬