一株莎车芽孢杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种莎车芽孢杆菌BacillusshacheensisHNA-14T（=KCTC33145=DSM26902=CICC10559）。通过从新疆莎车县盐碱土分离、筛选、生理生化鉴定等工作，确定该菌株为短杆状革兰氏阳性菌，严格好氧，产芽孢，具有运动性，细胞大小为0.5-0.8×1.0-1.5μm，菌落呈黄色。NaCl耐受范围为3%-20%（最佳盐浓度为7%-15%），pH生长范围为6.5-10.0（最佳pH范围为7.5-8.0），温度生长范围为5-40℃（最佳生长温度为25-30℃）。本发明的新疆莎车嗜盐菌BacillusshacheensisHNA-14T（=KCTC33145=DSM26902=CICC10559）能有效分解明胶和淀粉，具有Esterase（C4）、Esteraselipase（C8）、Valinearylamidase、Acidphosphatase和Naphthol-AS-B1-phosphohydrolase酶活性，同时该菌株具有较高的盐浓度适应性，能在较高的盐浓度下生存，该中度嗜盐菌可广泛地应用在次级代谢产物高盐浓度下的生产。
KCTC 33145
2013.03.26
CICC 10559
2012.11.28
【专利说明】一株莎车芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物菌种及其应用领域，具体地说本发明涉及一种芽孢杆菌及其应 用的【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 中度嗜盐菌并非分类学上的专业名词，而是对一类最佳耐盐浓度在3%_15%的极 端微生物的统称。它广泛分布在各类高盐环境中，如海洋、盐湖、盐碱地、盐池这些自然环境 及很多发酵食品中都能被发现。
[0003] 中度嗜盐菌因其独特的生长环境与耐盐机制，从而具有很多显著的特点：（1)可 在较高的盐浓度下生长，降低发酵过程中染菌风险；(2)不需要较为复杂的营养条件，碳氮 源利用范围广泛；（3)生理生化特性多样，潜在应用价值巨大。
[0004] 近些年来，随着中度嗜盐菌研究的不断深入，越来越多的新种被发现，人们对它们 所表现出来的潜在应用价值兴奋不已。现今，中度嗜盐菌的应用研究主要集中在以下几个 方面： (1)食品工业上的应用。传统的食品发酵工业中，嗜盐微生物的应用由来已久，如食品 调味酱就是通过将小麦、谷子和大豆等农作物密封浸泡在19%左右的NaCl溶液中，经发酵 9-10个月而成。科学家们发现，在此过程中，有一蜗笔％ Tetragenococcus halophilus饱 中度嗜盐菌起到了主要的发酵推动与承担作用，其高达108 CFU/mL的培养基细胞浓度不仅 能抑制其他细菌生长，还能保证在混合氨基酸缺乏的环境下酱的风味浓郁不散而且美味可 口。在韩国，人们经常喜欢将海产品进行腌制，而这过程中起到主要作用的菌株也是一类中 度嗜盐菌，名为许多中度嗜盐菌的菌落也十分好看，多呈橙色或 粉红色，而其中的有益品种亦被用来生产天然食品添加剂。
[0005] (2)酶制剂生产上的应用。工业生产通常需要满足很多特殊的物化条件，然而却 常常难以与酶反应所需的最佳条件相匹配，这就对酶的适应条件提供了更高的要求。中度 嗜盐菌产生的酶恰恰具有广泛的盐度、温度耐受范围，还有容易纯化的优点，故而受到广泛 关注，有着良好的商业应用前景。
[0006] (3)基因工程和化妆品领域的应用。在高盐环境下，中度嗜盐菌常常可以积累许 多相容性物质，如海藻糖，四氢嘧啶，甜菜碱，脯氨酸，羟基四氢嘧啶等。因其具有良好的渗 透保护功能，受到分子基因工程与化妆品领域的广泛关注。其中，四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶 是一种被称为分子伴侣的稳定剂，它们具有在极端环境如高盐、高温、干燥或低温下稳定和 保护生物大分子酶、DNA的作用。同时它们还具有防止皮肤干燥，减缓皮肤衰老的作用，是 一种很好的化妆品保湿剂。
[0007] (4)多聚体生产方面的应用。石油沉积后往往会形成较高的盐浓度，一般的表面 活性剂与生物乳化剂常常难以适应，这为石油的回收利用增加了难度。中度嗜盐菌形成的 胞外多聚体无疑具有显著优势。
[0008] (5)环保方面上的应用。现代工业污水中含有很多难以处理的化学物质如高盐离 子和有毒有机物等，用传统生物方法常常收效甚微。而有些中度嗜盐菌由于其强大的适应 能力及独特的生理生化特性，在很高盐浓度中就能够完成对甲醛、有机磷、芳烃如苯酚等有 毒物质的降解且绿色环保，在处理环境污染方面日益受到人们关注。
[0009] (6)其他方面的应用。除了以上方面的应用，中度嗜盐菌在其他很多方面依然表 现出很好的应用前景。如抗生素等活性物质的生产，新型酶如限制性内切酶等的提取，以及 乳化剂的合成等方面都有广泛的用途。
【发明内容】
[0010] 针对国内外有关嗜盐芽孢杆菌的研究现状，本发明提供一种新的嗜盐芽孢杆菌及 其应用，所述的嗜盐芽孢杆菌碱性磷酸酶阴性、缬氨酸芳基酰胺酶阳性β-葡萄糖醛酸酶 阴性，同时与该属所有其他菌株16S rDNA最高相似度分布在95. 655%至96. 348% (NCBI)， 这些特征明显区别于已公开报道的嗜盐芽孢杆菌有效种。
[0011] 本发明具体提供一种莎车芽孢杆菌(ifeciBiAS )。
[0012] 本发明通过以不同的温度、PH值、盐浓度和培养基为富集条件，从新疆莎车 盐湖中取样，分离纯化培养到多株菌，经过多级筛选确定一株嗜盐芽孢杆菌 sAacAeeflsis HNA- 14τ)，命名为莎车芽孢杆菌该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微 生物国际保藏单位：韩国典型菌种保藏单位（KCTC)，保藏时间为2013年3月26日，保藏 号分别是KCTC 33145, KCTC地址为韩国大田市儒城区韩国生物科学和技术研究所，邮编 是305-806,经微生物多相分类鉴定为莎车芽孢杆菌(ifeci77i/5· 该菌为好 氧菌，革兰氏阳性，运动性，呈短杆状，大小范围为〇. 5 - 0. 8X 1. 0 - 1. 5 μ m，端生孢子，孢 子囊些微肿胀，菌落呈黄色，形状呈圆形规则，边缘光滑。NaCl耐受范围为3%-20%(最佳 盐浓度为7%-15%)，pH生长范围为6. 5-10. 0(最佳pH范围为7.5-8. 0)，温度生长范围为 5-40°C (最佳生长温度为25-30°C)。氧化酶和过氧化氢酶阳性，不具有硝酸还原能力，可 以水解淀粉和明胶，不能水解吐温-80和纤维素。其生长过程中不产生H2S和吲哚，M.R.和 V.P.实验阴性。能利用碳源：D-麦芽糖、D-海藻糖、D-纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖、D-松二 糖、水苏糖、四唑紫、D-蜜三糖、α-D-乳糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、D-水杨苷、D-山梨醇、 D-阿拉伯醇、肌醇、果胶、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸、葡罗酰胺、L-乳酸、D-苹果酸、L-苹 果酸、氧化锂、吐温-40、α-羟基丁酸、α-羟基丁酸、β-羟基丁酸、乙酰乙酸、丙酸、醋酸、 丁酸钠和溴酸钠；不能利用碳源：糊精、万古霉素、四唑蓝、D-蜜二糖、Ν-乙酰-D-氨基葡萄 糖、Ν-乙酰-β -D-甘露糖胺、Ν-乙酰-D-半乳糖胺、Ν-乙酰-神经氨酸、a -D-葡萄糖、 D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、3-甲基-匍萄糖、D-岩澡糖、L-岩澡糖、L-鼠李糖肌苷、 1%乳酸钠、梭链孢酸、D-丝氨酸、D-甘露醇、甘油、D-葡萄糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸、 D-天门冬氨酸、D-丝氨酸、醋竹桃霉素、利福霉素、二甲胺四环素、明胶、氨基乙酰-L-脯氨 酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天门冬氨酸、L-左旋谷氨酸、L-组氨酸、L-焦谷氨酸、L-丝氨 酸、林可霉素、盐酸胍、硫酸四癸钠、D-半乳糖醛酸L-半乳糖酸内酯、粘酸、奎尼酸、D-葡糖 二酸、Ρ-羟基-苯乙酸、丙酮酸甲酯、D-乳酸、甲酯、L-乳酸柠檬酸、α -氧代戊二酸、溴代 丁二酸、萘啶酮酸、亚碲酸钾、Υ -氨基丁酸、α -氧代丁酸、甲酸和氨曲南。细胞主要脂肪酸 为anteis〇-C15:0和is 〇-C15:0,主要醌类型为ΜΚ-7,细胞壁肽聚糖类型主要为内消旋二氨 基庚二酸（meso-DAP)，主要极性脂为双磷脂酰甘油（DPG)，磷脂酰乙醇胺（PE)，磷脂酰肌醇 (PI)。DNA(G+C)含量为 48. 6 mol%。
[0013] 该莎车芽孢杆菌你 ciBws sAacAeeesis HNA-14T(=KCTC 33145 =DSM 26902=CICC 10559)的酶学特性采用API ZYM系统检测，碳源利用情况采用Biolog全自动细菌鉴定系 统，主要脂肪酸类型及含量参考《放线菌系统学》，并采用气质联用分析，极性脂类型分析参 考《放线菌系统学》，呼吸醌组分以及G+Cmol%均采用高效液相（HPLC)来分析。
[0014] 本发明通过提取总得DNA、16S rDNA基因的扩增和测序，根据测序结果，在NCBI上 用Blast进行比对分析，整理出相似度较高的相关菌株的16S rDNA序列，Clustal XI. 83 进行多序列匹配排列后，通过MEGA5. 0程序中的邻接法（Neighbor-Joining)和最大似然法 (Maximum-Likelihood)构建系统发育树。
[0015] 经测定莎车芽孢杆菌sAacAeeesis HNA-14T (=KCTC 33145 =DSM 26902=CICC 10559)的 16S rRNA 序列长 1570bp，如下：TCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACG CTGGCGGCATGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAACCAAAGGGAGCTTGCTCCCGGAGGTTAGCGGCGGACGGGTGA GTACCACGTGGGCAACCTGCCCCATGGACAGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAAGACCGACCTT CGCCTGGAGGTTGGTTGAAAGATGGCCTTTAAGGCTATCACCAAGGGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTA AGGTAAAGGCTTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCC CAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAATGCCGCGTGAGTGA GGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCTCTGTTGCGAGGGAAGAAGCAAGTACCGGTGGATAACGCCGGTACCCTGACGGT ACCTCGCCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTA TTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTTCTTAAGTCTGATGTGAAATCTTGGGGCTCAACCCCGAGCGGCCATTGGA AACTGGGGAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAAC ACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGTTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATA CCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATGCCCGTAGTGCCGAAGTCAACACAT TAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAG CATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACCCTGGAGACAGGGCTT CCCCTTCGGGGGCAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCA ACGAGCGCAACCCTTAATCTTAGTTGCCAGCATTGAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGA AGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGGGT AGCGAAGCCGTGAGGTGAAGCCAATCCCAGAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAA GCCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACA CCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTGGG GTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTAAGCTTGGTACCCGGGAATCTCTA 从基于16S rDNA基因构建的系统发育树可以明显地看出莎车芽孢杆菌 HNA-14T (=KCTC 33145 =DSM 26902=CICC 10559)与三株芽孢杆菌属的 模式菌株聚为一支，与最亲近的三个模式菌株你 ciBm chmii KSM-K16T、 DSM 8716τ、Α<3α7ΛΛ5 SC-N012M3相似度分别为96·348%、95·951% 和95. 883%，均低于常用来划定新种的相似度阈值97%。基于对莎车芽孢杆菌 HNA-14T (=KCTC 33145 =DSM 26902=CICC 10559)的表型、生理生化、基因 型的分析，初步确定莎车芽孢杆菌sAacAeeesis HNA-14T (=KCTC 33145 =DSM 26902=CICC 10559)为芽孢杆菌属的一个新种。
[0016] 基于新疆莎车嗜盐菌能有效分解淀粉，具有 Esterase (C4)、Esterase lipase (C8)、Valinearylamidase、Acid phosphatase 和 Naphthol-AS-Bl-phosphohydrolase酶活性，有较高的盐浓度适应性，能使明胶液化和牛奶 胨化等特性，本发明提供的莎车芽孢杆菌iacAeeasis HNA-14T (=KCTC 33145 =DSM 26902=CICC 10559)能广泛的应用于食品工业、酶制剂和基因工程等领域。
[0017] 将该菌种的种子液以5%的接种量接种到15%盐浓度TSB培养基中，37°C、200rpm 条件下发酵培养3天，12000rpm离心去除杂质和菌体，1°C下65%硫酸铵盐析，12000rpm离 心后收集沉淀，1°C 25mM Tris-HCl重新溶解后，在含有5mM Ca2+、mM Tris-HCl中1°C条件 下透析10小时，结束后12000rpm离心去杂质，上清液即为淀粉酶。
[0018] 通过实施本发明具体的技术指标，可达到以下效果。
[0019] 本发明的莎车芽孢杆菌feci/AAS· 能用于高盐浓度条件下发酵生产 淀粉酶、明胶酶，同时能应用在 Esterase (C4)、Esterase lipase (C8)、Valinearylamidase、 Acid phosphatase 和 Naphthol-AS-Bl-phosphohydrolase 相关领域。
【专利附图】
【附图说明】 图1是扫描电子显微镜10000倍下观察到的菌株HNA-14的形貌。图2是采用邻接法 构建菌株HNA-14与相关分类的16S rRNA基因序列系统发育树；Bar表示每单位核苷酸替 换数为〇. 01。
【具体实施方式】
[0020] 实施例一：莎车芽孢杆菌的筛选与分离 样品采集与菌株筛选分离 样品采集于新疆维吾尔族自治区莎车县。样品来自多个区域，分布于东经 76° Γ 57"至77° 46' 30"、北纬37° 27' 30"至39° 15"之间。用无菌玻璃瓶收 取距表层5-lOcm 土壤，经风干，研磨，过筛，置于4°C保存，用于后续分离。筛选培养基选用 苯酚富集培养基（PT)，腐殖酸富集培养基（HVA)，钥酸钠富集培养基（HNA)和高盐富集培养 基（YCSS)，纯化培养基选用胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB+10% NaCl)，通过接种不同的富 集培养基对菌株进行筛选。将lg 土样加入装有25ml液体培养基的摇瓶中，在28°C下振荡 培养7天。然后用移液枪吸取富集液，作10倍梯度稀释，取200 μ 1 ΚΓ^ΚΓ4倍数稀释液分 别涂布到对应培养基平板上，置于28°C下继续培养一周。观察生长状况与形态特征，将长出 的菌落转接至TSB固体培养基，经多次划线，再挑取单菌落转接至TSB斜面培养基，置于4°C 作短期保藏。同时取新鲜菌液混合25%浓度甘油，置于-80°C作长期保藏。（所有培养基配 方见下表） 苯酚富集培养基（PT):酪蛋白胨7. 5g，氯化钠100g，酵母浸出物10g，苯酚690μ1，MS 混合液 1 unit，无菌水 1000ml，ρΗ8· 2-8. 5。
[0021] 腐殖酸富集培养基（HVA):腐殖酸lg，氯化钠150g，MS混合液1 unit，无菌水 1000ml，pH8. 2-8. 5。
[0022] 钼酸钠富集培养基（HNA):酪蛋白胨7.5g，氯化钠150g，酵母浸出物10g，MS混合 液 1 unit，无菌水 1000ml，pH8. 2-8. 5。
[0023] 高盐富集培养基（YCSS):酪蛋白胨7. 5g，氯化钠250g，酵母浸出物10g，MS混合 液 1 unit，无菌水 1000ml，ρΗ8· 2-8. 5。
[0024] MS混合液：浓度为0. 05g/L相容性物质（甜菜碱，脯氨酸，甘氨酸，D-山梨醇，谷氨 酸盐）混合液1. 5ml ;浓度为0. 05g/L氨基酸(天冬氨酸，组氨酸，赖氨酸，蛋氨酸，缬氨酸， 亮氨酸，酪氨酸，谷氨酸）混合液15ml ;浓度为0. 025mg/L维生素（VB1，VB2, VB12, VB6, VH， VM，VPP)混合液 0. 25ml。
[0025] 胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB+10% NaCl):胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g， NaCllOOg，琼脂粉 18g，蒸馏水 1000ml，ρΗ8· 0-8. 2。
[0026] 菌种描述： 本发明所述的莎车芽孢杆菌为好氧菌，革兰氏阳性，运动性，呈短杆状，大小范围为 0. 5 - 0. 8Χ 1. 0 - 1. 5 μ m，端生孢子，孢子囊些微肿胀，菌落呈黄色，形状呈圆形规则，边 缘光滑。NaCl耐受范围为3%-20%(最佳盐浓度为7%-15%)，pH生长范围为6. 5-10. 0 (最 佳pH范围为7. 5-8.0)，温度生长范围为5-40°C (最佳生长温度为25-30°C)。氧化酶 和过氧化氢酶阳性，不具有硝酸还原能力，可以水解淀粉和明胶，不能水解吐温-80和 纤维素。其生长过程中不产生H2S和吲哚，M.R.和V.P.实验阴性。细胞主要脂肪酸为 anteis〇-C15:0和is〇-C15:0,主要醌类型为MK-7,细胞壁肽聚糖类型主要为内消旋二氨基 庚二酸（meso-DAP)，主要极性脂为双磷脂酰甘油（DPG)，磷脂酰乙醇胺（PE)，磷脂酰肌醇 (PI)。
[0027] 实施例二：莎车芽孢杆菌HNA-14T=CICC 10559表性特征 通过BI0L0G GEN皿MicroStation自动微生物鉴定系统，得到HNA-14碳源利用情况 如下表所示。其中HNA-14的参比菌株为chMii DSM 8716τ 能利用碳源：D-麦芽糖、D-海藻糖、D-纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖、D-松二糖、水苏糖、 四唑紫、D-蜜三糖、a -D-乳糖、β -甲基-D-葡萄糖苷、D-水杨苷、D-山梨醇、D-阿拉伯 醇、肌醇、果胶、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸、葡罗酰胺、L-乳酸、D-苹果酸、L-苹果酸、氧化 锂、吐温-40、α-羟基丁酸、α-羟基丁酸、β-羟基丁酸、乙酰乙酸、丙酸、醋酸、丁酸钠和 溴酸钠；不能利用碳源：糊精、万古霉素、四唑蓝、D-蜜二糖、Ν-乙酰-D-氨基葡萄糖、Ν-乙 酰-β -D-甘露糖胺、Ν-乙酰-D-半乳糖胺、Ν-乙酰-神经氨酸、a -D-葡萄糖、D-甘露糖、 D-果糖、D-半乳糖、3-甲基-葡萄糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、L-鼠李糖肌苷、1%乳酸钠、梭 链孢酸、D-丝氨酸、D-甘露醇、甘油、D-葡萄糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸、D-天门冬氨 酸、D-丝氨酸、醋竹桃霉素、利福霉素、二甲胺四环素、明胶、氨基乙酰-L-脯氨酸、L-丙氨 酸、L-精氨酸、L-天门冬氨酸、L-左旋谷氨酸、L-组氨酸、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、林可霉 素、盐酸胍、硫酸四癸钠、D-半乳糖醛酸L-半乳糖酸内酯、粘酸、奎尼酸、D-葡糖二酸、ρ-羟 基-苯乙酸、丙酮酸甲酯、D-乳酸、甲酯、L-乳酸柠檬酸、α -氧代戊二酸、溴代丁二酸、萘啶 酮酸、亚碲酸钾、氨基丁酸、α-氧代丁酸、甲酸和氨曲南。
[0028] 实施例三：莎车芽孢杆菌HNA-14T=CICC 10559基因组的提取以及16S rDNA测序 采用SDS法提取细菌总DNA，通过PCR法扩增菌株16S rRNA基因序列，DNA测序由上 海生工生物工程技术服务有限公司完成。到GenBank(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)数 据库将各菌株测得的16S rRNA基因部分序列提交注册获得序列号。再在NCBI (National Center for Biotechnology Information)上进行BLAST比对，找到亲缘关系最近的菌 株。通过BioEdit将亲缘性最近的相应菌株进行序列比对，然后在软件MEGA 5. 0上分别使 用Neighbor-Joinin(N-J)法，最大似然法（ML法）构建系统进化树，进化树bootstrap为 1000。PCR相应引物、反应体系、条件如下：PCR 引物：PA8: 5'-CCGTCGACGAGCTCAGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3'，ΡΒ^ 5'-CCCGGGTACCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3' ；反应体系（25μ 1 体 系）：Mg2+ S.SyLPAJ.SyLPBJ.SyLdNTP 0·75μ1，Η20 14yl，Taq 酶 0·25μ1，反应 条件95°C预变性5min，94°C变性45s，50°C退火45s，延伸lmin，重复35个循环，72°C保温 lOmin。构建的进化树见图2。
[0029] 实施例四：莎车芽孢杆菌HNA-14T=CICC 10559的应用 用试管配制明胶液化培养基，121°C灭菌20min，将菌株穿刺接种，在30°C恒温箱 中静置培养30天，分别在5,10,20,30天观察记录明胶液化程度。观察前将试管冷却 20-30min或用自来水冲洗30min，可以更清晰的观察到液化程度。结果分析莎车芽孢杆菌 HNA-14T=CICC 10559可使明胶液化。
[0030] 实施例五：莎车芽孢杆菌HNA-14T=CICC 10559的应用 用试管配制牛奶凝固与胨化培养基，煮沸30min，然后置于高速离心机中3000r/min离 心30min，去除上清液，112°C，间歇灭菌30min 2-3次。接种待测菌株，在30°C恒温箱中静 置培养30天，分别在5, 10. 20, 30天观察记录牛奶凝固与胨化程度。结果分析，莎车芽孢杆 菌HNA-14T=CICC 10559使牛奶出现凝块即为凝固，凝固后凝块水解为液体，证明其可以使 牛奶胨化。
[0031] 实施例六：莎车芽孢杆菌HNA-14T=CICC 10559的应用 配制淀粉水解平板培养基，121°C下，灭菌20min，用点接法接种待测菌株，接种直径不 宜超过5mm ;在30°C恒温箱中静置培养48h，观察生长情况，待生长良好时，向菌落周围滴加 碘液进行检测，结果分析莎车芽孢杆菌HNA-14T=CICC 10559周围出现透明晕圈且不变色， 证明其有水解淀粉的能力。
【权利要求】
1. 一株莎车芽孢杆菌（Bacillus shacheensis)HNA-14T (=KCTC 33145=DSM 26902=CICC 10559)。
2. 如权利要求1所述的莎车腰包杆菌（Bacillus shacheensis)HNA_14T (=KCTC 33145=DSM 26902=CICC 10559)，其特征在于细胞好氧，革兰氏阳性，运动性，呈短杆状， 大小范围为0. 5 - 0. 8X 1. 0 - 1. 5 μ m，端生孢子，孢子囊些微肿胀，菌落呈黄色，形状呈 圆形规则，边缘光滑，NaCl耐受范围为3%-20%(最佳盐浓度为7%-15%)，pH生长范围为 6. 5-10. 0 (最佳pH范围为7. 5-8. 0)，温度生长范围为5-40°C (最佳生长温度为25-30°C )， 氧化酶和过氧化氢酶阳性，不具有硝酸还原能力，可以水解淀粉和明胶，不能水解吐温-80 和纤维素，其生长过程中不产生H 2S和吲哚，M.R.和V.P.实验阴性，能利用碳源：D-麦芽糖、 D-海藻糖、D-纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖、D-松二糖、水苏糖、四唑紫、D-蜜三糖、α-D-乳 糖、β -甲基-D-葡萄糖苷、D-水杨苷、D-山梨醇、D-阿拉伯醇、肌醇、果胶、D-葡萄糖酸、 D-葡萄糖醛酸、葡罗酰胺、L-乳酸、D-苹果酸、L-苹果酸、氧化锂、吐温-40、α -羟基丁酸、 α -羟基丁酸、β -羟基丁酸、乙酰乙酸、丙酸、醋酸、丁酸钠和溴酸钠；不能利用碳源：糊精、 万古霉素、四唑蓝、D-蜜二糖、Ν-乙酰-D-氨基葡萄糖、Ν-乙酰-β -D-甘露糖胺、Ν-乙 酰-D-半乳糖胺、Ν-乙酰-神经氨酸、a -D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、3-甲 基-葡萄糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、L-鼠李糖肌苷、1%乳酸钠、梭链孢酸、D-丝氨酸、D-甘露 醇、甘油、D-葡萄糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸、D-天门冬氨酸、D-丝氨酸、醋竹桃霉素、利 福霉素、二甲胺四环素、明胶、氨基乙酰-L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天门冬氨酸、 L-左旋谷氨酸、L-组氨酸、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、林可霉素、盐酸胍、硫酸四癸钠、D-半乳 糖醛酸L-半乳糖酸内酯、粘酸、奎尼酸、D-葡糖二酸、ρ-羟基-苯乙酸、丙酮酸甲酯、D-乳 酸、甲酯、L-乳酸柠檬酸、α -氧代戊二酸、溴代丁二酸、萘啶酮酸、亚碲酸钾、γ -氨基丁酸、 α -氧代丁酸、甲酸和氨曲南，细胞主要脂肪酸为anteiS〇-C15:(l和is〇-C 15:(l，主要醌类型为 MK-7,细胞壁肽聚糖类型主要为内消旋二氨基庚二酸（meso-DAP)，主要极性脂为双磷脂酰 甘油（DPG)，磷脂酰乙醇胺（PE)，磷脂酰肌醇（PI)，DNA(G+C)含量为48. 6 mol%。
【文档编号】C12N1/20GK104232503SQ201410160307
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年4月22日 优先权日:2014年4月22日
【发明者】田永强, 刘波, 雷祖超 申请人:四川大学