一种具有促进骨骼生长功能的蛋白粉及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有促进骨骼生长功能的蛋白粉及其制备方法，所述蛋白粉由乳铁蛋白粉、乳清分离蛋白粉、维生素E和碳酸钙按照如下比例混合而成：乳铁蛋白粉30-60wt.％，乳清分离蛋白粉39-69wt.％，维生素E0.01-0.Swt.％，CaCO30.01-0.Swt.％。所述方法步骤如下：(1)阳离子交换层析纯化；(2)体积排阻层析纯化；(3)配料混合；(4)产品干燥。本发明所得到的具有促进成骨细胞增殖活性的蛋白粉在促进成骨功能方面具有良好效果。
【专利说明】一种具有促进骨骼生长功能的蛋白粉及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品【技术领域】，涉及一种蛋白粉及其制备方法，尤其涉及一种具有促进骨骼生长功能的蛋白粉及其制备方法。
【背景技术】
[0002]乳铁蛋白是一种多功能的活性糖蛋白，一直备受人们的关注。乳铁蛋白又称乳铁传递蛋白，主要存在于哺乳动物的各种外分泌物中，如乳汁、泪液或唾液等。它最初于1939年由Sorensen等人在从动物乳中分离乳清蛋白时首次发现,1953年Polis等在制各乳过氧化物酶时得到了它的粗制品，1960年由Groves用色谱法首次从人乳和牛乳中分离获得了乳铁蛋白的纯品。多年以来，乳铁蛋白都作为一种铁强化剂调控铁的生物利用率。此外，乳铁蛋白还具有多种其他生物功能，例如抗菌、抗病毒和抗氧化作用，参与机体免疫调节，增强机体抗病能力等。与这些功能相对应，人们针对乳铁蛋白的研究与开发也聚焦在这些功能上。
[0003]近年来，乳铁蛋白被发现具有促骨生长的功效。诸多研究表明，乳铁蛋白既能刺激成骨细胞增殖，促进成骨细胞增殖与分化、也能抑制破骨细胞生长与活性、诱导破骨细胞凋亡。体内研究表明，乳铁蛋白在骨生长和代谢中起到一定的生理作用，能促进骨骼生长。乳铁蛋白的这种功能逐渐引起人们的关注，但相关产品开发进程非常缓慢。
[0004]现有的乳铁蛋白产品多来源于不同的原料乳如牛乳、人乳、山羊乳和骆驼乳等原料乳中，尤其在各种初乳中含量丰富。通常采用各种方法如超滤、盐析和色谱法等方法分离乳铁蛋白。目前乳铁蛋白大部分是从常乳和初乳中分离纯化得到的，也可以利用加工奶酪时的副产物乳清分离乳铁蛋白。但产品得率也相对偏低，纯化效率较低。另外，由于乳铁蛋白的活性受到多种因素的影响，在纯化过程中若不进行良好的控制，其活性将损失严重。影响乳铁蛋白活性的因素主要有温度、pH、铁饱和度、盐离子、乳清蛋白等。Ruegg等研究发现乳铁蛋白在PH值为6.6时，温度为65?69°C时开始失活。Abe等研究发现牛脱铁乳铁蛋白在PH值为4.0，温度90°C加热5min，乳铁蛋白的铁结合能力、抗原活性、抑菌性能几乎无变化，可对其进行大批量灭菌；70°C预热3min，然后UHT杀菌(130°C /2s)，铁结合能力只损失了 3% ;还发现在酸性条件下乳铁蛋白较耐热，在中性和碱性条件下则发生浑浊和凝胶化。而Kussendrager和Paulsson等人研究发现乳铁蛋白在酸性条件下更敏感,Sreedhara等研究发现PH2.0-8.0乳铁蛋白变性温度随pH减小而降低，在pH2.0-3.0乳铁蛋白更容易变性，且乳铁蛋白的变性是不可逆的。巴氏杀菌对乳铁蛋白结构及抗菌活性基本上没影响，而UHT杀菌会使乳铁蛋白失去抗菌活性，但137°C /8s处理的乳铁蛋白对单核细胞增殖作用几乎没发生变化。Sui和Brisson在中性pH下研究发现乳铁蛋白热稳定性:脱铁乳铁蛋白< 天然乳铁蛋白 < 饱和乳铁蛋白，主要是由于铁饱和有助于乳铁蛋白二硫化物结合在一起，防止蛋白聚合。所以对于在乳铁蛋白的纯化过程中，必须采用良好的技术，抑制或减少其活性降低，实际应用中的工序和工艺参数仍需确定。
[0005]人的骨骼的正常生长发育依赖于成骨细胞和破骨细胞功能的动态平衡，如果这种平衡被打破，成骨减少，而破骨细胞活性增强，骨骼正常发育就会被破坏，进而造成骨质疏松等病变。多个研究小组先后报导了乳铁蛋白、维生素E、以及微量元素钙等对骨健康的有益作用。
[0006]如前所述:乳铁蛋白既能刺激成骨细胞增殖，也能抑制破骨细胞生长与活性、诱导破骨细胞凋亡。体内研究表明，乳铁蛋白在骨生长和代谢中起到一定的生理作用，能促进骨骼生长。
[0007]维生素E(Vitamin E)是一种脂溶性维生素，又称生育酚，是最主要的抗氧化剂之一，氧化应激与导致骨折风险增加的骨质疏松症密切相关，天然强抗氧化剂维生素E利用其抗氧化特性帮助内在抗氧化防护体系抵御自由基的侵害及清除脂质过氧化自由基，刺激骨形成及促进骨骼健康。而且生育酚能促进性激素分泌，因此摄入维生素E补充剂有益于骨质疏松症的预防和治疗。
[0008]钙是人体中含量最多的矿质元素，含量约为成人体重的1.5-2%，其中90%以上是以羟磷灰石的形式构成骨盐，存在于骨骼和牙齿中。钙对于人体骨骼的生长发育具有重要作用。
[0009]从促进骨骼生长发育的角度来看，将乳铁蛋白、维生素E以及钙复配，将从成骨细胞和破骨细胞信号转导通路调控、雌激素分泌调控、免疫调节、骨盐形成等多个角度全方位地促进骨骼健康生长发育。
[0010]目前乳铁蛋白产品多针对它的铁转运活性、抗菌活性、免疫调节活性等进行开发生产，对于它的促进成骨细胞增殖活性这方面的产品开发处于空白状态。而且，目前市场上促进骨骼生长发育的食品或者保健品主要聚焦在钙吸收和钙固定两个方面，也有些产品聚焦在雌激素分泌的调控上。然而促进骨骼生长发育是一个成骨细胞和破骨细胞动态平衡得复杂过程，针对此复杂的生物过程而开发的产品制备技术国内外处于空白状态。
【发明内容】
[0011]本发明的目的是提供一种具有促进骨骼生长功能的蛋白粉及其制备方法，该产品将从成骨细胞和破骨细胞信号转导通路调控、雌激素分泌调控、免疫调节、骨盐形成等多个角度全方位地促进骨骼健康生长发育。
[0012]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0013]一种具有促进骨骼生长功能的蛋白粉，由乳铁蛋白、乳清分离蛋白与维生素E按照如下比例混合而成:乳铁蛋白粉30-60wt.%，乳清分离蛋白粉39-69wt.%，维生素E0.01-0.5wt.%, CaCO30.01-0.5wt.%。
[0014]新鲜牛乳经过脱脂、除酪蛋白后得到乳清蛋白液，或者直接应用乳清蛋白粉为原料；然后通过SP Sepharose Big Bead离子交换层析和Superdex200凝胶过滤层析,超滤浓缩；添加其他功能型辅料，混合溶解均匀后，经真空冷冻干燥或低喷雾干燥等方法制备得到具有促进骨骼生长活性的蛋白粉。具体步骤如下:
[0015](I)阳离子交换层析纯化:将乳清蛋白液首先经强阳离子交换层析SP SepharoseBig Bead进行纯化，纯化过程中，预先用缓冲溶液A平衡2_4倍柱体积直至基线平衡，然后采用两段式分步洗脱，首先采用含有15-30vol.%缓冲溶液B的混合溶液洗脱2-6倍柱体积，再用100%缓冲溶液B洗脱1-4倍柱体积，洗脱流速l_5mL/min ；[0016](2)体积排阻层析纯化:将步骤(1)得到的洗脱液进行超滤浓缩，经0.22μπι膜过滤并采用SuperdeX200进一步纯化，得到纯化乳铁蛋白；所述的纯化过程为:凝胶柱先用缓冲液10-20mmol/L、pH值为7.0-8.的磷酸盐缓冲溶液进行平衡至基线稳定后进行洗脱，流速为0.l_2mL/min, 280nm下检测蛋白；
[0017](3)配料混合:将步骤(2)制备的乳铁蛋白、乳清分离蛋白、维生素E和CaCO3进行混合；
[0018](4)产品干燥:将上述混合进行干燥，得到具有促进成骨细胞增殖活性的蛋白粉，所述蛋白粉中含有乳铁蛋白粉30-60wt.%、乳清分离蛋白粉39-69wt.%、维生素E0.01-0.5wt.%、CaCO30.01-0.5wt.%。
[0019]本发明所得到的具有促进成骨细胞增殖活性的蛋白粉在促进成骨功能方面具有良好效果，以乳清蛋白为对照组的实验方法和实验结果如下:
[0020]实验方法(I):MTT法测定成骨细胞增殖情况
[0021]MTT是一种黄色染料。外源性MTT可被活细胞线粒体内膜上的琥珀酸脱氢酶还原成水不溶性蓝紫色结晶甲臌，然而死细胞却无此功能。加入能溶解细胞中的甲臌的DMS0，用酶标仪在490nm下测定吸光值，可检测细胞增殖率、间接反映活细胞数量。
[0022]本实验采用MTT法，步骤如下:
[0023](I)用0.25%胰蛋白酶消化细胞后，用a-MEM培养液(含10%胎牛血清、I %青链霉素)制成单细胞悬液，并稀释到一定细胞浓度接种于96孔培养板。每孔含细胞悬液95 μ L，置于含5% CO2的37°C细胞培养箱中培养。
[0024](2)待细胞贴壁后,每孔加入5 μ L样品溶液。
[0025](3)测定前 4h，每孔加入 10 μ L0.5mg/mLMTT (ρΗ7.20.01mol/LPBS 配制)，置于细胞
培养箱中孵育4h。
[0026](4)孵育后，小心弃去培养液，每孔加入150 μ L DMS0,振荡lOmin，使结晶溶解。于酶标仪中490nm下测定吸光度。
[0027]对应的实验结果见表1。
[0028]表1不同样品对成骨细胞增殖活性的影响
【权利要求】
1.一种具有促进骨骼生长功能的蛋白粉，其特征在于所述蛋白粉由乳铁蛋白粉、乳清分离蛋白粉、维生素E和碳酸钙按照如下比例混合而成:乳铁蛋白粉30-60wt.%，乳清分离蛋白粉 39-69wt.%，维生素 E0.01-0.5wt.%, CaCO30.01-0.5wt.V0o
2.根据权利要求1所述的具有促进骨骼生长功能的蛋白粉，其特征在于所述蛋白粉中含有乳铁蛋白粉40wt.%、乳清分离蛋白粉59.9wt.%、维生素E0.05wt.%、CaCO30.05wt.%。
3.根据权利要求1所述的具有促进骨骼生长功能的蛋白粉，其特征在于所述蛋白粉中含有乳铁蛋白粉50wt.%、乳清分离蛋白粉49.8wt.%、维生素E0.01wt.%、CaCO30.01wt.%。
4.根据权利要求1所述的具有促进骨骼生长功能的蛋白粉，其特征在于所述蛋白粉中含有乳铁蛋白粉58.96wt.%、乳清分离蛋白粉41wt.%、维生素E0.02wt.CaCO30.02wt.%。
5.一种权利要求1-4任一权利要求所述的具有促进骨骼生长功能的蛋白粉的制备方法，其特征在于所述方法步骤如下: (1)阳离子交换层析纯化:将乳清蛋白液首先经强阳离子交换层析SPSepharose BigBead进行纯化，纯化过程中，预先用缓冲溶液A平衡2_4倍柱体积直至基线平衡，然后采用两段式分步洗脱，首先采用含有15-30vol.%缓冲溶液B的混合溶液洗脱2-6倍柱体积，再用100%缓冲溶液B洗脱1-4倍柱体积，洗脱流速l_5mL/min ； (2)体积排阻层析纯化:将步骤(1)得到的洗脱液进行超滤浓缩，经0.22 μ m膜过滤并采用Superdex200进一步纯化,所述的纯化过程为:凝胶柱先用缓冲液10_20mmol/L、pH值为7.0-8.的磷酸盐缓冲溶液进行平衡至基线稳定后进行洗脱，流速为0.l-2mL/min，得到纯化乳铁蛋白； (3)配料混合:将步骤(2)制备的乳铁蛋白、乳清分离蛋白、维生素E和CaCO3进行混合； (4)产品干燥:将上述混合进行干燥，得到权利要求1-4任一权利要求所述的具有促进骨骼生长功能的蛋白粉。
6.根据权利要求5所述的具有促进骨骼生长功能的蛋白粉的制备方法，其特征在于所述乳清蛋白液按照如下方法获得:将新鲜牛乳于5000-1OOOOrpm离心15_30min脱脂，将脱脂乳用酸调PH值至4.3-4.8，静置10-30min后4000_8000r/min离心l_30min，收集离心后的上清液进行过滤，得到乳清蛋白液。
7.根据权利要求5所述的具有促进骨骼生长功能的蛋白粉的制备方法，其特征在于所述乳清蛋白液以乳清蛋白粉为原料，使用前将其配置成蛋白浓度为5-10g/L的溶液。
8.根据权利要求5所述的具有促进骨骼生长功能的蛋白粉的制备方法，其特征在于所述缓冲溶液A为30-50mmol/L、pH值为6.5-7.5的磷酸盐缓冲溶液，所述缓冲溶液B为含有0.1-lmol/L NaCl 的缓冲溶液 A。
9.根据权利要求5所述的具有促进骨骼生长功能的蛋白粉的制备方法，其特征在于纯化后乳铁蛋白纯度为85-95%。
10.根据权利要求5所述的具有促进骨骼生长功能的蛋白粉的制备方法，其特征在于干燥前固形物含量为10-40wt.%。
【文档编号】A23L1/302GK103892282SQ201410160964
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月21日 优先权日:2014年4月21日
【发明者】杜明, 王聪, 刘猛, 樊凤娇, 宋微, 徐伟丽, 韩冰 申请人:哈尔滨工业大学