专利名称：痛风遗传检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体痛风遗传易感性的试剂盒， 通过同时检测与痛风密切相关的载脂蛋白E基因(AP0E) 、 5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)上. 的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体痛风遗传易感性。 '
背景技术：
痛风(gout)是体内慢性嘌呤代谢障碍引起的疾病。主要是由于尿酸生成增加和/或尿酸排泄减少，尿 酸在体内沉积，引起的病理生理改变。表现为高尿酸血症，反复发作痛风性急性关>节炎、痛风石、尿酸性 肾病，常伴尿路结石，严重者呈关节畸形及功能障碍。
然而，不同的人遗传状况不同，导致其痛风的发病风险也存在着个体差异。携带风险基因型的人群， 其痛风的发病风险会明显高于正常基因型的人群。如果不釆取积极的预防措施，将会显著影响其健康状况。
APOE基因编码的载脂蛋白E，该蛋白参与体内脂质代谢，主要功能是清除乳糜微粒和极低密度脂蛋白。 如果该基因发生变异，将导致高脂血症、痛风的发生风险增加。当携带风险基因型时，ApoE与受体结合能 力下降，乳糜微粒和极低密度脂蛋白无法被正常清除，引发血清胆固醇和甘油三酯在体内积累，并最终导 致发生高脂血症的风险增加。而高脂血症是痛风主要的合并症之一，研究表明痛风患者75%-80%伴有高 甘油三酯血症，而高甘油三酯血症患者中80%伴有高尿酸血症。
MTHFR编码5， 10-亚甲基四氢叶酸还原酶，参与叶酸代谢通路。该酶参与甲基化过程和嘌呤合成代谢 通路，影响体内尿酸的生成。如果该基因发生变异，将导致痛风发病风险上升。近年通过对代谢综合征相 关基因多态性研究发现N5， N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T突变与高尿酸血症相关。MTHFR 蛋白是一种重要的一碳单位代谢酶。其基因位于lp36. 3区，全长17kb， mRNA长212kb,包含11个外显子。 C677T位于MTHFR基因的催化区域，该突变直接影响MTHFR蛋白的活性和耐热性，表现为不同程度的酶活 性降低并伴有酶的耐热性降低。当携带风险基因型时，直接影响MTHFR基因的活性和耐热性，表现为不同 程度的5， 10-亚甲基四氢叶酸还原酶活性降低并伴有酶的耐热性降低，并进一步引发致叶酸代谢障碍，影 响到嘌呤的合成，引起尿酸的增多，最终增加痛风的发病风险。
发明内容
基于载脂蛋白E基因(AP0E)、 5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)上的3个SNP位点多态性 可用来评估个体痛风遗传易感性的基础上，本发明提供一种检测个体痛风遗传易感性的试剂盒。 该试剂盒包括
检测APOE基因上rs429358号与rs7412号SNP多态性基因型的特异性引物对及DNA测序引物； 检测MTHFR基因上C677T SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对 PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离子水等)； PCR产物纯化组件(包括SAP酶、Exo I酶、去离子水等)；
DNA测序反应组件(包括BigDye mix, EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、去离子 水等)。
荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、 应缓冲液;'去离子水等)。 本试剂盒中所述的引物对是本领域技术人员能够轻易完成设计的，并可用常规的合成技术进行合成。 本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是能够轻易完成设计的，特异性荧光探针对可用常规的探针合成 技术进行合成。
本发明试剂盒的组分和含量包括-1. P'CR反应套装
10X PCR反应缓冲液2.5^1，
25raM dNTP混合液0.2^1,
25raM MgCl2溶液1.5^1，5units/(jl Taq DNA聚合酶0.125^1， 20nM特异性引物对每条引物各0.25nl， 去离子水19. 175^1。
2. PCR产物纯化套装 lunits/nl SAP酶0.75^1， lOunits/pl Exol酶0.375^1, 去离子水3: 875^1。
3. 测序反应套装 25% BigDye mix 3.2nM DNA测序引物 125rnM EDTA溶液lpl， 100%乙醇溶液15^1， 70%乙醇溶液30nl， HIDI溶液8^1， 去离子水2nl。
4. 荧光定量PCR反应套装 IO'X荧光定量PCR反应缓冲液lnl， 25rnM dNTP混合液O.l^il,
25mM MgC12溶液0. 6pl, 5units/Vl Taq DNA聚合酶0. 025pl, 2(Ml特异性引物对每条引物各0.225nl， IO幽特异性荧光探针对每条探针各0.25nl， 去离子水5.325[il。 本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20'C 。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例l.检测试剂盒的使用 步骤'l: DNA模板的抽取
用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。
步骤2: PCR扩增反应 使用检测试剂盒中的PCR反应套装。
反应的体系为总体积25pl，包含浓度为12.5ng/nl的DNA模板lnl、10XPCR反应缓冲液2.5^1,25mM dNTP混合液0.2^1， 25mMMgC12溶液1.5^1， 5units/nl Taq DNA聚合酶0.125^1, 20pM特异性引物对每 条引物各0.25^1，去离子水19.175nl。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为94°C、 12分钟，进行30个循环的94°C、 30秒，60 °C、 30秒，72°C、 30秒，然后进行72。C、 10分钟。
步骤3: PCR产物纯化
使用检测试剂盒中的PCR产物纯化套装，反应体系为总体积25^1，包含PCR产物2(^1， lunits/^il SAP 酶0.75nl， lOunitsAil Exol酶0.375jil，去离子水3.875^1。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，'反应条件为37'C、 15分钟，72'C、 20分钟。步骤4: DNA测序反应 使用检测试剂盒中的测序反应套装。
反应的体系为总体积5ial，包含PCR纯化产物1(^1, 25%BigDye mix lpl， 3.2nMDNA测序引物1^1， 去离子水2nl。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98°C、2分钟，进行25个循环的96'C 、30秒，55'C、 30秒，60°C、 4分钟。
反应结束后加入125mM EDTA溶液1^1和100%乙醇溶液15^1，于室温下沉淀15分钟；在4'C以3650 转/分的转速离心30分钟，轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30^1，以3650转/分的转速离心15分钟， 轻轻倒去上清液；'室温放置20分钟后加入HIDI溶液8^1，放入测序仪中。
步骤5:荧光定量PCR反应
使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，进行1次独立的荧光定量PCR反应，每个反应的体系为总体 积10^1,包含浓度为20ng/pl的DNA模板2^1、 10 X荧光定量PCR反应缓，液、0. 1^1 25rnM dNTP 混合液、0.6^1 25mM MgCl2溶液、0.025" (5unitsAd) Taq DNA聚合酶、20一:的有义引物和反义引物 各0.225^1、 10nM的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25nl，去离子水5.325pl。
在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50'C、 2分钟，95°C、 IO分钟，进行60个循环的95°C、 30秒， 60°C、 l分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。
步骤6:基因型分析
根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。
熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。 熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根 据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。
实施例2.应用检测试剂盒进行个体痛风遗传易感性检测的服务 步骤l: DNA提取
由医院检验科医师指导被检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，釆用哮胶吸附法进行口腔上皮 细胞的DNA抽提。
步骤2:基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对被检测者基因组DNA的APOE基因上rs429358号SNP位点和rs7412号 SNP位点雄行DNA测序检测，对MTHFR基因上C677T SNP位点进行荧光定量PCR检测，确定这3个SNP位 点的基因型。
步骤3:个体痛风遗传易感性的分析
通过对被检测者SNP基因型的分析，出具个体痛风遗传易感性的分析报告单。报告中详细说明了被检 测者痛风遗传风险的高低，并由医师向被检者详细说明和解读个体痛风遗传易感性分析报告单。
权利要求
1.一种检测个体痛风遗传易感性的试剂盒，其特征在于包括同时检测APOE基因上rs429358号SNP位点和rs7412号SNP位点的特异性引物与DNA测序引物、5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)上C677T SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、SAP酶、Exo I酶、BigDye mix，EDTA溶液、70％乙醇溶液、100％乙醇溶液、HIDI溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水等。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括1) PCR反应套装:IOX PCR反应缓冲液2. 5rt, 25mM d證混合液0.2P1, 25mM MgC12溶液1.5W， 5unitsM Taq DNA聚合酶0. 20PM特异性引物对每条引物各O. 去离子水19. 175^。2) PCR产物纯化套装:lunits/HlSAP酶0. 75W， 10units/Ml Exol酶0. 375W，去离子水3.875W。3) 测序反应套装25% BigDye mix 1W, 3. 2幽DNA测序引物1W， 125mM EDTA溶液1W， 100%乙 醇溶液70%乙醇溶液30Hl， HIDI溶液8W,去离子水2Hl。4) 荧光定量PCR反应套装10 X荧光定量PCR反应缓冲液1W, 25mM dNTP混合液0. lHl， 25mMMgC12 溶液0.6W， 5units/W Taq DNA聚合酶0.0025W, 2(Ml特异性引物对每条引物各0. 225Hl， IO幽特异 性荧光探针对每条探针各0.25W，去离子水5.325W。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C 。
全文摘要
本发明公开了一种检测痛风遗传风险的试剂盒。该试剂盒包括检测载脂蛋白E基因(APOE)、5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)的单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件、PCR反应组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过同时检测与痛风遗传风险密切相关的基因上的多态性位点基因型来评估个体痛风遗传风险。
文档编号C12Q1/68GK101608229SQ20081003927
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月20日 优先权日2008年6月20日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司