专利名称：IFN-γ受体基因(B8R)缺失的天坛株重组痘苗病毒及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及IFN-γ受体基因(B8R)缺失的天坛株重组痘苗病毒减毒载体以及基于此载体构建的表达HIV-1各种抗原(单价及多价)的IFN-γ受体基因(B8R)缺失的天坛株重组痘苗病毒艾滋病疫苗。本发明的天坛株重组痘苗病毒减毒载体能够显著降低痘苗病毒载体的毒力，可以用于构建表达同一病原多种抗原、不同病原多种抗原的多价重组痘苗病毒。本发明的重组痘苗病毒艾滋病疫苗能够诱导高水平的抗人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)的体液和细胞免疫应答，并有效提高重组痘苗病毒艾滋病疫苗的安全性及免疫原性。
背景技术：
痘苗病毒天坛株(vaccine virus TianTan strain，VTT)为我国消灭天花作出巨大贡献，在活载体疫苗研究应用也十分活跃，重组痘苗病毒疫苗具有效果好、对热稳定性好，接种方便，不需佐剂等优点，然而痘苗病毒接种人体后产生较重的局部反应，特别是在一定比例的免疫缺陷患者中可引起严重的并发症。表达某些免疫原的重组痘苗病毒未能达到理想的免疫效果，如何能在增强重组痘苗病毒的免疫原性同时进一步提高痘苗病毒载体的安全性，学者们作出很多深入的研究。随着新的病毒疾病不断出现，对宿主抗病毒免疫机理的深入了解，构建表达同一病原多种抗原、不同病原多种抗原的多价重组痘苗病毒载体，寻找更多稳定有效的外源基因插入区意义重大。
痘苗病毒基因组编码一些特殊蛋白抑制宿主免疫系统，据文献报道和基因分析，可知痘苗病毒天坛株B8R基因与IFN-γ受体膜外区域具有高度同源性[1]。IFN-γ在抗病毒及免疫调节方面具有重要的作用。本发明构建缺失IFN-γ受体基因的天坛株重组痘苗病毒载体，研究其毒力改变及B8R缺失区插入外源基因表达的稳定性。进一步提高天坛株痘苗病毒载体安全性、研制表达多价抗原重组痘苗病毒载体。
HIV-1全球流行导致了极高的致病率和病死率，为防治HIV-1的感染，传统的化学药物治疗、免疫治疗以及新的方法得以不断研究、发展，对多数HIV感染者进行HAART，虽可有效抑制病毒血症，延缓病程，但不能清除潜伏的病毒。保护性的疫苗接种是解决防治HIV-1感染全球性问题的最佳途径。科学家们开展了减毒活疫苗、灭活疫苗、重组亚单位疫苗、各种活载体疫苗(腺病毒、金丝雀痘病毒、流感病毒、痘苗病毒、狂犬病毒、VSV、伤寒杆菌、链球菌等载体)的研究，传统的减毒活疫苗及灭活疫苗在HIV防治中存在一些问题。虽然减毒活疫苗在SIV模型证实有效，但在初免疫成年猕猴中存在一定致死率。被HIV-1感染的猩猩仍可被第二种不相关的HIV-1感染。由于活减毒株风险性以及有证据表明无广泛保护性，减毒活疫苗应用的争议尚待进一步研究。在猩猩模型有研究表明，灭活疫苗不能保护HIV-1攻击，不能诱导CTL反应。病毒活载体疫苗和DNA疫苗都既可以诱导细胞免疫，又可以诱导体液免疫反应，表达HIV-1抗原重组痘苗病毒和HIV-1DNA疫苗的联合免疫成为新的疫苗研究策略。
发明内容
为了进一步提高重组痘苗病毒疫苗的安全性及有效性，本发明目的在于提供一种同源重组构建B8R基因缺失区插入外源基因的的IFN-γ受体基因(B8R)缺失的天坛株重组痘苗病毒VTTΔB8RlacZ及其在制备重组痘苗病毒疫苗中的应用。
具体涉及一种B8R基因缺失、表达HIV-1抗原的VTKgpeΔB8R(B8R基因缺失不带lacZ选择标记，TK区插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpolenv基因)的天坛株重组痘苗病毒recombinant vaccinia virius VTKgpe的艾滋病疫苗，该重组痘苗病毒recombinant vaccinia virius VTKgpe于2004年2月24日在北京保藏，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.1099；涉及一种B8R基因缺失表达HIV-1抗原的VTKgpeΔB8RlacZ(B8R基因缺失为lacZ所取代，TK区插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpol env基因)的天坛株重组痘苗病毒的艾滋病疫苗；还涉及一种B8R基因缺失、表达乙型肝炎病毒HBSAg抗原，IL-2的(B8R基因缺失插入HBSAg抗原，TK区插入IL-2基因)的天坛株重组痘苗病毒的乙型肝炎病疫苗。
本发明的目的在于提供用于以痘苗病毒VTT为母本病毒，构建B8R区缺失，同时在该区插入各种外源基因的重组痘苗病毒转移质粒pSKB8R、pSKB8RLacZ、pSKB8RNeo、pSKB8RPNeo和它们的构建方法。
本发明提供了一种用于转移质粒pSKB8RLacZ构建的质粒pSC65，含有该质粒的大肠埃希氏菌Esherichia coli已于2004年2月24日在北京保藏，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.1097。
本发明提供了一种用于转移质粒pSKB8Rneo构建的质粒pVI75，含有该质粒的大肠埃希氏菌Esherichia coli已于2004年2月24日在北京保藏，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.1098。
本发明所涉及的一种B8R基因缺失为lacZ所取代的重组病毒VTTΔB8R1acZ可以作为同源重组构建B8R基因缺失区插入外源基因的疫苗株的亲本毒株。VTTΔB8RlacZ构建方法即将痘苗病毒天坛株VTT(北京生物制品所保藏，Tiantan株752-1)与转移质粒pSKB8RLacZ共转染CEF细胞进行同源重组，经蓝白筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因缺失为lacZ所取代的重组病毒VTTΔB8RlacZ。提取DNA，进行PCR扩增及DOTBLOT鉴定、检测重组病毒B8R基因缺失的稳定性，表明VTTΔB8RlacZ在CEF细胞连续培养传代15代B8R基因缺失稳定。VTTΔB8RlacZ在CEF细胞连续培养传代15代插入外源基因lacZ稳定表达。重组缺失病毒VTTΔB8RlacZ在CEF、TK-143、CV-1细胞中的繁殖生长曲线测定，结果表明VTTΔB8RlacZ的生长曲线与VTT生长曲线相似。B8R基因缺失对重组缺失病毒在细胞中的繁殖复制没有影响。兔皮内毒力实验表明VTT752-1形成红肿痘疱面积显著大于VTTΔB8RlacZ形成痘疱，VTT752-1形成红肿痘疱而后出现溃破接痂，VTTΔB8RlacZ形成痘疱无溃破接痂，VTTΔB8RlacZ形成痘疱消褪较VTT752-1形成痘疱消褪早。B8R基因缺失显著降低痘苗病毒天坛株病毒毒力。
本发明涉及的一种B8R基因缺失、表达HIV-1抗原的VTKgpeΔB8R(B8R基因缺失不带lacZ选择标记，TK区插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpolenv基因)的天坛株重组痘苗病毒的艾滋病疫苗及一种B8R基因缺失表达HIV-1抗原的VTKgpe/ΔB8RlacZ(B8R基因缺失为lacZ所取代，亲本毒株VTTΔB8RlacZ的TK区插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpol env基因)的天坛株重组痘苗病毒的艾滋病疫苗。即将VTKgpe(TK区插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpol env基因的天坛株重组痘苗病毒)与转移质粒pSKB8RLacZ共转染CEF细胞进行同源重组，经蓝白筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因缺失为lacZ所取代的重组病毒VTKgpeΔB8RlacZ，再以VTKgpeΔB8RlacZ为亲本株与pSKB8RNeo共转染CEF细胞进行同源重组，经G418压力筛选、蓝白斑筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因缺失不带lacZ选择标记的重组病毒VTKgpeΔB8R。裸鼠毒力实验表明VTKgpeΔB8R毒力较VTKgpe显著降低，腹腔接种VTT(104pfu)及VTKgpe(106pfu)15天裸鼠死亡，接种VTKgpeΔB8R(107pfu)裸鼠存活。胞内IFN-γ.染色流式细胞仪分析、T淋巴细胞增殖、CTL检测显示B8R基因缺失显著提高表达HIV-1基因的天坛株重组痘苗病毒特异性细胞免疫。本发明上述所涉及的TK区是指Tiantan株Genebank，gi6969640基因组的79799bp-81271bp的一段核苷酸序列。
本发明涉及B8R基因缺失、表达HIV-1和乙型肝炎病毒各种单价或多价抗原的天坛株重组痘苗病毒的艾滋病及乙型肝炎病疫苗。
本发明涉及B8R基因缺失、表达外源基因单价或多价抗原的天坛株重组痘苗病毒包括重组疫苗、表达外源基因重组痘苗病毒以及它们在制备治疗病毒病的重组痘苗病毒疫苗药物中的应用。
以上本发明所描述的技术特征目前国内外未见任何报道，所以本发明具有创造性、新颖性和实用性。对人类病毒病的重组痘苗病毒疫苗药物治疗将带来十分重要的意义。
图1显示转移质粒pSKB8R、pSKB8RLacZ、pSKB8RNeo的构建路线图2显示pSKB8R酶切确认分析结果，图中泳道2，3分子量标记DL2000，DL15000(购自大连宝生物工程有限公司)，泳道1pSKB8R(NdeI和BgLII)。
图3显示pSKB8RlacZ酶切确认分析结果，图中泳道1分子量标记DL15000，泳道2pSKB8RLacZ(SpeI)，泳道3pSKB8RLacZ(SacI)，泳道4pSKB8RLacZ(NdeI)。
图4显示pSKB8RNeo酶切确认分析结果，图中泳道1分子量标记DL15000，泳道2pSKB8RNeo(BamHI和BgLII)。
图5显示pSKB8RPNeo酶切确认分析结果，图中泳道12分子量标记DL2000，15000，泳道3pSKB8RPNeo(SaLI/SmaLI)。
图6显示重组病毒VTTΔB8RlacZ、VTKgpeΔB8RlacZ、VTKgpeΔB8R构建示意图。
图7显示PCR扩增检测重组病毒VTTΔB8RlacZ B8R基因缺失1，6DNA标准2VTTDNA PCR扩增产物(引物B8RLF、B8RRR)3VTTDNA扩增产物(引物B8RF、B8RRR)图8Dot Blot检测病毒基因组中B8R基因提取痘苗病毒VTT752-1DNA及重组病毒VTTΔB8RlacZ传代15代DNA，以B8R基因地高辛标记探针进行Dot Blot检测。VTT752-1Dot Blot结果显示杂交印迹斑点，VTTΔB8RlacZ传代15代Dot Blot结果未显示杂交印迹斑点，表明VTTΔB8RlacZ在CEF细胞连续培养传代15代B8R基因稳定缺失图9显示重组缺失病毒VTTΔB8RlacZ细胞中的繁殖曲线测定以VTTΔB8RlacZ重组病毒在CEF中增殖，其不同时间收获的病毒PFU值，绘制病毒繁殖曲线(与TK-143、Wish、CV-1细胞上繁殖曲线相似)。结果表明VTTΔB8RlacZ的繁殖曲线与对照VTT繁殖曲线相似。B8R基因缺失对重组缺失病毒在细胞中的繁殖复制没有影响。48h病毒繁殖高峰达107PFU/ml。(生长曲线纵轴为PFU对数值)图10显示兔皮内毒力实验结果兔背皮内左侧接种1×106PFU的VTTΔB8RlacZ，右侧接种1×106PFU/ml的VTT752-1，将0.1ml 1×107pfu/ml VTTΔB8RlacZ重组病毒，对兔背皮内注射后，逐日观察皮肤红肿面积，第5天可见红肿痘疱，明显小于对照痘苗病毒，且无溃破，消褪较早。表明重组病毒VTTΔB8RlacZ毒力比对照VTT752-1显著减弱。
图11显示PCR扩增检测重组病毒VTKgpeΔB8R B8R基因缺失提取重组病毒DNA为模板，以引物B8RLF、B8RRR进行PCR扩增。重组病毒VTKgpeΔB8R由于B8R基因缺失，PCR扩增出1244bp片段，包括B8R基因外左侧同源序列B8RL片段583bp、右侧同源序列B8RR片段661bp。而对照VTTDNA为模板扩增出2Kb片段，包括B8R基因外左侧同源序列B8RL片段583bp、B8R基因818bp、右侧同源序列B8RR片段661bp。结果表明VTKgpeΔB8R在CEF细胞连续培养传代15代B8R基因稳定缺失。
图12、Dot Blot检测病毒VTKgpeΔB8R基因组中B8R基因1、VTT752-1 2、VTKgpeΔB8R提取痘苗病毒VTT752-1DNA及重组病毒VTKgpeΔB8R传代15代DNA，以B8R基因地高辛标记探针进行Dot Blot检测。VTT752-1Dot Blot结果显示杂交印迹斑点，VTKgpeΔB8R传代15代Dot Blot结果未显示杂交印迹斑点，表明VTKgpeΔB8R在CEF细胞连续培养传代15代B8R基因稳定缺失图13显示胞内IFN-γ.染色流式细胞仪分析结果。DNA+VTKgpeΔB8R免疫组小鼠脾细胞T淋巴细胞，在体外经表位肽刺激后，分泌IFN-γ的CD8+T淋巴细胞占脾脏总CD8+T淋巴细胞的百分比数显著高于DNA+VTKgpe免疫组。VTKgpeΔB8R免疫组小鼠脾细胞分泌IFN-γ.CD8百分比数显著高于VTKgpe免疫组。
图14显示T淋巴细胞增殖3H-TdR法检测结果。DNA+VTKgpeΔB8R免疫组小鼠脾细胞T淋巴细胞，在体外经表位肽刺激后，刺激指数(SI)显著高于DNA+VTKgpe免疫组。
图15显示CTL乳酸脱氢酶法检测结果。DNA+VTKgpeΔB8R免疫组小鼠脾细胞T淋巴细胞，特异性杀伤显著高于DNA+VTKgpe免疫组。VTKgpeΔB8R免疫组高于VTKgpe免疫组图16 Western Blot分析VTKgpeΔB8R目的基因表达1 VTT感染CEF细胞 2，3，4VTKgpeΔB8R感染CEF细胞5预染蛋白Marker
具体实施方案实施例一、转移质粒的构建1.质粒pBR-SK的构建5’PBR322-SACI-FORGGAGCTCCGACCGATGCCCTTGAGAGCC3’PBR322-KPNI-REGGGGTACCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGPCR扩增商业质粒pBR322包括全部功能元件的序列，记为pBR。
反应体系10×Pyrobest Buffer 5μldNTPMisture(各2.5mM)5μl3’PBR322-KPNI-RE(50μM)0.5μl5’PBR322-SACI-FOR(50μM) 0.5μlpBR322 0.5μlPyrobest DNA Polymerase(5U/ml) 0.5μlddH2O38μl反应条件94℃预变性2min；94℃30s，68℃5min，共35个循环；72℃7min；4℃。
纯化 大连宝生物的KpnI和SacI共酶切PCR产物pBR，跑胶回收。
用大连宝生物的KpnI和SacI共酶切质粒pBS-SK，得到多克隆位点序列(小片段)，记为SK，跑1.5％琼脂糖胶回收。
连接酶切回收产物pBR和SK，转化Top10大肠杆菌感受态，并筛选出正确克隆子，记为pBR-SK。
2.转移质粒pSKB8R的构建在载体质粒pBR-SK插入痘苗病毒天坛株B8R基因外左侧同源序列B8RL片段、右侧同源序列B8RR片段。见图1。采用PCR技术分别以痘苗病毒DNA扩增痘苗病毒天坛株B8R基因外左侧同源序列B8RL片段(引物B8RLF、B8RLR)右侧同源序列B8RR片段(引物B8RRF、B8RRR)，B8RL片段、B8RR片段分别用BgLII切连接，以连接产物为模板PCR扩增(引物B8RLF、B8RRR)B8R基因外左右侧同源序列连接大片段B8RLR。大片段B8RLR、pBRSK质粒分别以KpnI/BamHI酶切、T4DNALigase连接构建带有天坛株B8R基因外左右侧同源臂的转移质粒pSKB8R。引物序列B8RLFgtaataggtaccgtagcatcctattcg B8RLRtataatagatcttatggtgttgtttgB8RRFaactaaagatctcggtagcac B8RRRattcgtggatccattgtaacaagatatcB8RL片段(引物B8RLF、B8RLR)，B8RR片段(引物B8RRF、B8RRR)，，连接大片段B8RLR(引物B8RLF、B8RRR)PCR扩增反应采用大连宝生物工程有限公司的试剂盒，反应体系如下模板DNA 1μl正、反向引物 各1μl10×Pyrobest缓冲液 5μldNTP混合物(各2.5mM) 5μlPyrobest DNA聚合酶(5U/ml)0.5μlddH2O37.5μlPCR反应条件94℃预变性2min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共20个循环；72℃7min；4℃。
大片段B8RLR延伸产物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit进行纯化回收，回收产物KpnI/BamHI共酶切(Takara公司产)。pBRSK质粒载体KpnI/BamHI共酶切(Takara公司产)。用Omega公司E.Z.N.A.GelExtraction Kit进行电泳纯化回收.。二者T4DNALigase(Takara公司产)连接构建带有天坛株B8R基因外左右侧同源臂的转移质粒pSKB8R。连接产物分别转化感受态大肠杆菌Top10，涂含氨苄青霉素的LB平板，37℃培养12-16小时。提取质粒，用相应限制性内切酶酶切分析鉴定，酶切鉴定结果分别参见图2。
3.转移质粒pSKB8RLacZ的构建在pSKB8R左侧同源序列B8RL片段、右侧同源序列B8RR片段间插入痘苗病毒启动子序列pE/L、p7.5及下游LacZ序列。以质粒pSC65为模板扩增痘苗病毒启动子序列pE/L、p7.5及下游LacZ序列(引物pSC65F、pSC65R)。pE/L、p7.5及下游LacZPCR扩增片段(引物pSC65F、pSC65R)以BamHI酶切、转移质粒pSKB8R以BgLII酶切，二者T4DNALigase连接构建转移质粒pSKB8RLacZ。pSKB8RLacZ带有痘苗病毒启动子序列pE/L、p7.5和p7.5下游的LacZ序列以及两侧的B8R基因外同源臂。pSC65Ftctttcggatccttgttgaattagatcg pSC65RgtttgccatacgctcacagaagpE/L、p7.5及下游LacZPCR扩增片段PCR扩增反应采用大连宝生物工程有限公司的试剂盒，反应体系如下质粒pSC65 1μl正、反向引物(pSC65F、pSC65R) 各1μl10×Pyrobest缓冲液 5μldNTP混合物(各2.5mM)5μlPyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0.5μlddH20 37.5μlPCR反应条件94℃预变性2min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共20个循环；72℃7min；4℃。
pE/L、p7.5及下游LacZPCR扩增片段延伸产物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit进行纯化回收，回收产物BamHI酶切(Takara公司产)。转移质粒pSKB8R载体BgLII酶切(Takara公司产)。用Omega公司E.Z.N.A.Gel Extraction Kit进行电泳纯化回收.。二者T4DNALigase(Takara公司产)连接构建pSKB8RlacZ。连接产物分别转化感受态大肠杆菌Top10，涂含氨苄青霉素的LB平板，37℃培养12-16小时。提取质粒，用相应限制性内切酶酶切分析鉴定，酶切鉴定结果分别参见图3。
4转移质粒pSKB8Rneo的构建即在pSKB8R左侧同源序列B8RL片段、右侧同源序列B8RR片段外侧插入痘苗病毒启动子序列pH6及下游Neo序列。以质粒pVI75为模板扩增痘苗病毒启动子序列pH6及下游Neo序列(引物NeoF，NeoR)，BamHI、SacII酶切pH6+Neo片段、转移质粒pSKB8RBamHI、SacII酶切，二者T4DNALigase连接构建转移质粒pSKB8RNeo。引物NeoFcgcggatcctcgatccccagattacaaacaactagg，引物NeoRtccccgcggacagatttctccgtgatagggatcgpH6及下游Neo序列PCR扩增反应采用大连宝生物工程有限公司的试剂盒，反应体系如下质粒1μl正、反向引物(NeoF，NeoR)各1μl10×Pyrobest缓冲液 5μldNTP混合物(各2.5mM) 5μlPyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0.5μlddH2O 37.5μlPCR反应条件94℃预变性2min；94℃30s，58℃30s，72℃60s，共20个循环；72℃7min；4℃。
pH6及下游Neo序列PCR扩增片段延伸产物用Omega公司的E.Z.N.ACycle-Pure Kit进行纯化回收，回收产物SacII/BamHI酶切(Takara公司产)。转移质粒pSKB8R载体SacII/BamHI酶切(Takara公司产)。用Omega公司E.Z.N.A.Gel Extraction Kit进行电泳纯化回收.。二者T4DNALigase(Takara公司产)连接构建转移质粒pSKB8RNeo。连接产物分别转化感受态大肠杆菌Top10，涂含氨苄青霉素的LB平板，37℃培养12-16小时。提取质粒，用相应限制性内切酶酶切分析鉴定，酶切鉴定结果分别参见图4。
5转移质粒pSKB8RPNeo的构建即在pSKB8RNeo左侧同源序列B8RL片段、右侧同源序列B8RR片段间插入两个互为反向的痘苗病毒启动子序列pE/L、p7.5。以质粒pSC65为模板扩增痘苗病毒启动子序列pE/L、p7.5及多克隆位点。pE/L、p7.5及多克隆位点扩增片段(引物PMF，PMR)以BamHI酶切、转移质粒pSKB8R以BgLII酶切，二者T4DNALigase连接构建pSKB8RP。质粒pSKB8RPSacII/BamHI酶切，pH6及下游Neo序列PCR扩增片段延伸产物用SacII/BamHI酶切(Takara公司产)，二者T4DNALigase连接构建转移质粒pSKB8RPNeo。PMFcgggatccgtcgacttcgaacttattt PMRcgggatcccccgggctcgagttatgatcttpE/L、p7.5及多克隆位点扩增片段PCR扩增反应采用大连宝生物工程有限公司的试剂盒，反应体系如下质粒pSC65 1μl正、反向引物(PMF，PMR) 各1μl10×Pyrobest缓冲液 5μldNTP混合物(各2.5mM) 5μlPyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0.5μlddH2O 37.5μlPCR反应条件94℃预变性2min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共20个循环；72℃7min；4℃。
pE/L、p7.5及多克隆位点扩增片段延伸产物用Omega公司的E.Z.N.ACycle-Pure Kit进行纯化回收，回收产物BamHI酶切(Takara公司产)。转移质粒pSKB8R载体BglII酶切(Takara公司产)。用Omega公司E.Z.N.A.Gel Extraction Kit进行电泳纯化回收.。二者T4DNALigase(Takara公司产)连接构建pSKB8RP。
质粒pSKB8RP SacII/BamHI酶切，pH6及下游Neo序列PCR扩增片段(如前)用SacII/BamHI酶切(Takara公司产)，二者T4DNALigase连接构建转移质粒pSKB8RPNeo。图5。
实施例二B8R基因缺失为lacZ所取代的重组病毒VTTΔB8RlacZ的构建。图6。
将痘苗病毒天坛株VTT与转移质粒pSKB8RLacZ共转染CEF细胞进行同源重组，经蓝白筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因缺失为lacZ所取代的重组病毒VTTΔB8RlacZ。以0.1~0.01PFU/cell病毒量VTT752-1感染80％成片CEF细胞吸附1~1.5h后，采用脂质体转染技术(参照美国INVITROGEN公司Lipofectin试剂盒)将重组质粒pSKB8RLacZ转染CEF细胞中。48小时后收获重组病毒液，用含200μg/ml X-gal营养琼脂铺斑，随机挑取孤立蓝斑病毒，连续单斑纯化5代，以待鉴定获得B8R基因缺失为lacZ所取代的重组病毒VTTΔB8RlacZ。
提取DNA，进行PCR扩增及DOT BLOT鉴定、检测重组病毒B8R基因缺失的稳定性，表明VTTΔB8RlacZ在CEF细胞连续培养传代15代B8R基因缺失稳定。VTTΔB8RlacZ在CEF细胞连续培养传代15代插入外源基因lacZ稳定表达。VTTΔB8RlacZ在CEF细胞连续培养传代15代，VTTΔB8RlacZ传代第5、15代分别感染CEF细胞，检测其样品中β-半乳糖苷酶活性，同时设立VTT感染细胞对照。第5代β-半乳糖苷酶活测定OD420nm值为3.027，第15代OD420nm值为2.819。VTT感染细胞对照OD420nm值为0.04。结果表明VTTΔB8RlacZ在CEF细胞连续培养传代插入外源基因lacZ稳定表达.(图7，图8)和表1。
表1
重组缺失病毒VTTΔB8RlacZ在CEF、TK-143、CV-1细胞中的繁殖生长曲线测定，结果表明VTTΔB8RlacZ的生长曲线与VTT生长曲线相似(图90。B8R基因缺失对重组缺失病毒在细胞中的繁殖复制没有影响。兔皮内毒力实验表明VTT752-1形成红肿痘疱面积显著大于VTTΔB8RlacZ形成痘疱，VTT752-1形成红肿痘疱而后出现溃破接痂，VTTΔB8RlacZ形成痘疱无溃破接痂，VTTΔB8RlacZ形成痘疱消褪较VTT752-1形成痘疱消褪早。B8R基因缺失显著降低痘苗病毒天坛株病毒毒力。见图10。
实施例三B8R基因缺失表达HIV-1抗原的VTKgpeΔB8RlacZ(B8R基因缺失为lacZ所取代，TK区插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpol env基因)的天坛株重组痘苗病毒的艾滋病疫苗。
即将VTKgpe(TK区插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpol env基因的天坛株重组痘苗病毒)与转移质粒pSKB8RLacZ共转染CEF细胞进行同源重组，经蓝白筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因缺失为lacZ所取代的重组病毒VTKgpeΔB8RlacZ。以0.1~0.01PFU/cell病毒量VTKgpe感染80％成片CEF细胞吸附1~1.5h后，采用脂质体转染技术(参照美国INVITROGEN公司Lipofectin试剂盒)将重组质粒pSKB8RLacZ转染CEF细胞中。48小时后收获重组病毒液，用含200μg/ml X-gal营养琼脂铺斑，随机挑取孤立蓝斑病毒，连续单斑纯化5代，以待鉴定获得B8R基因缺失为lacZ所取代的重组病毒VTKgpeΔB8RlacZ提取DNA，进行PCR扩增及DOT BLOT鉴定、检测重组病毒B8R基因缺失的稳定性，表明VTKgpeΔB8RlacZ在CEF细胞连续培养传代15代B8R基因缺失稳定。VTKgpeΔB8RlacZ在CEF细胞连续培养传代15代插入外源基因gagpol env稳定表达。
实施例四B8R基因缺失、表达HIV-1抗原的VTKgpeΔB8R(B8R基因缺失不带lacZ选择标记，TK区插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpol env基因)的天坛株重组痘苗病毒的艾滋病疫苗。
再以VTKgpeΔB8RlacZ为亲本株与pSKB8RNeo共转染CEF细胞进行同源重组，经G418压力筛选、蓝白斑筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因缺失不带lacZ选择标记的重组病毒VTKgpeΔB8R。以0.1~0.01PFU/cell病毒量VTKgpeΔB8RlacZ感染80％成片CEF细胞吸附1~1.5h后，采用脂质体转染技术(参照美国INVITROGEN公司Lipofectin试剂盒)将重组质粒pSKB8RNeo转染CEF细胞中。48小时后收获重组病毒液，以400ug/mlG418压传三代。用含200μg/ml X-gal营养琼脂铺斑，随机挑取孤立白斑病毒，连续单斑纯化5代，以待鉴定获得B8R基因缺失不带lacZ选择标记的重组病毒VTKgpeΔB8R。
提取DNA，进行PCR扩增及DOT BLOT鉴定、检测重组病毒B8R基因缺失的稳定性，表明VTKgpeΔB8R在CEF细胞连续培养传代15代B8R基因缺失稳定。VTKgpe/ΔB8R在CEF细胞连续培养传代15代插入外源基因gagpolenv稳定表达。
裸鼠毒力实验表明VTKgpe/ΔB8R毒力较VTKgpe显著降低，腹腔接种VTT(104pfu)及VTKgpe(106pfu)15天裸鼠死亡，接种VTKgpeΔB8R(107pfu)裸鼠存活(表2)。胞内IFN-γ.染色流式细胞仪分析、T淋巴细胞增殖、CTL检测显示B8R基因缺失显著提高表达HIV-1基因的天坛株重组痘苗病毒特异性细胞免疫(图13，14，15)。
表2Virus Dose(pfu) Number of deathVTT 1020/41031/41044/4VTKgpe 1040/41050/41063/4VTKgpeΔB8R1050/41060/41070/4实施例五PCR扩增检测重组病毒VTKgpeΔB8R B8R基因缺失。Westernblot检测VTKgpeΔB8R传代15代插入外源基因gagpol env稳定表达提取重组病毒DNA为模板，以引物B8RLF、B8RRR进行PCR扩增。重组病毒VTKgpeΔB8R由于B8R基因缺失，PCR扩增出1244bp片段，包括B8R基因外左侧同源序列B8RL片段583bp、右侧同源序列B8RR片段661bp。而对照VTTDNA为模板扩增出2Kb片段，包括B8R基因外左侧同源序列B8RL片段583bp、B8R基因818bp、右侧同源序列B8RR片段661bp(图11)。结果表明VTKgpeΔB8R在CEF细胞连续培养传代15代B8R基因稳定缺失。Dot Blot检测病毒VTKgpeΔB8R基因组中B8R基因，提取痘苗病毒VTT752-1DNA及重组病毒VTKgpeΔB8R传代15代DNA，以B8R基因地高辛标记探针进行Dot Blot检测。VTT752-1Dot Blot结果显示杂交印迹斑点，VTKgpeΔB8R传代15代Dot Blot结果未显示杂交印迹斑点，表明VTKgpeΔB8R在CEF细胞连续培养传代15代B8R基因稳定缺失。见图12。VTKgpeΔB8R感染CEF细胞，48小时后收获细胞和上清，以人多抗血清(美国国立卫生研究院艾滋病研究和参比试剂项目提供)进行WesternBlot分析，出现了特异的反应条带(gp140，p55)说明所构建的疫苗可以正确的表达目的基因(图16)。
实施例六、重组痘苗病毒艾滋病疫苗的效果实验本例中使用无菌饲养的6-8周龄BALB/c(H-2d)雌性小鼠(体重19-25克，购自中国药品生物制品检定所)检测本发明疫苗的效力。各DNA疫苗用1×PBS制备成1mg/ml的注射液。每种免疫组含10只小鼠。免疫前24小时每只小鼠左右后肢胫骨前肌各注射50ul 25％(w/v)蔗糖高渗溶液以增加肌肉细胞的通透性，提高摄取质粒效率，同时，蔗糖还有一定的佐剂的作用。蔗糖处理24小时后，胫骨前肌注射DNA 100ug/只(每后肢50ug)。每间隔2周以同样剂量加强免疫3次。第6周时1，2组分别用VTKgpeΔB8R、VTKgpe重组痘苗病毒加强，107pfu/鼠。第4，6周时3，4组分别用VTKgpeΔB8R、VTKgpe重组痘苗病毒免疫，107pfu/鼠。在第9周时取血清及脾淋巴细胞检测抗体以及细胞因子。对照使用pCDN A空载体、不插入目的基因的痘苗病毒天坛株(天花疫苗，由北京生物制品所惠赠)以及空白鼠对照(表3)。
表3
相关实验及结果如下1、血清Gag特异性抗体IgG水平的检测为检测不同重组痘苗病毒单独免疫和加强免疫所诱导的特异性体液免疫水平，在第四次免疫后两周及取小鼠血清，用Gag P55抗原(美国国立卫生研究院艾滋病研究和参比试剂项目惠赠)包被酶标板，间接ELISA法进行Gag特异性IgG抗体水平的检测。各免疫组Gag特异性IgG抗体滴度列于表4。
表4
2、流式细胞仪检测体外抗原表位肽刺激后分泌IFN-γ的CD8+T淋巴细胞CD8+T淋巴细胞是一种最重要的抗病毒效应细胞，所以检测了免疫后脾淋巴细胞中分泌IFN-γ的HIV-1特异性CD8+T淋巴细胞。脾淋巴细胞用MHC-I限制性HIV(gag p24(AMQILKDTI)，V3(SIRIGPGQTF YATGD)andpol(NPDIVIYQYMDDLYVGSDL，YMDDLYVGSDLEIGQHRTK，KEPPFLWMGYELHPDKWTV)刺激12小时后，对细胞内IFN-γ和CD8，CD3分子进行染色，流式细胞仪(贝克曼·库尔特公司产品)进行分析。DNA+VTKgpeΔB8R免疫组小鼠脾细胞T淋巴细胞，分泌IFN-γ的CD8+T淋巴细胞占脾脏总CD8+T淋巴细胞的百分比数显著高于DNA+VTKgpe免疫组。VTKgpeΔB8R免疫组小鼠脾细胞分泌IFN-γ.CD8百分比数显著高于VTKgpe免疫组。
实施例七、B8R基因缺失、表达乙型肝炎病毒HBSAg抗原，IL-2的(B8R基因缺失插入HBSAg抗原，TK区插入IL-2基因)的天坛株重组痘苗病毒的乙型肝炎病疫苗的构建。
构建过程将重组痘苗病毒VTKIL-2(TK区插入IL-2基因)与转移质粒pSKB8RLacZ共转染CEF细胞进行同源重组，经蓝白筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因缺失为lacZ所取代的重组病毒VTKIL-2ΔB8RlacZ。将HBSAg基因插入转移质粒PSKB8RPNeo中(PSKB8RPNeoSaLI酶切补平，T4DNA连接酶连接HBSAg基因与PSKB8RPNeo)构建质粒PSKB8RPSNeo，HBSAg基因置于转移质粒痘苗病毒启动子下。将VTKIL-2ΔB8RlacZ与PSKB8RPSNeo共转染CEF细胞进行同源重组，经蓝白筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因，缺失lacZ为HBSAg基因所取代的重组病毒VTKIL-2ΔB8RS。
具体方法参见前述的方法。
权利要求
1.一种用于同源重组构建B8R基因缺失区插入外源基因的IFN-γ受体基因B8R缺失的天坛株重组痘苗病毒VTTΔB8RlacZ，其构建步骤为转移质粒pSKB8R、pSKB8RLacZ、pSKB8RNeo和pSKB8RPNeo的构建；将痘苗病毒天坛株VTT与转移质粒pSKB8RLacZ共转染CEF细胞进行同源重组，经蓝白筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因缺失为lacZ所取代的天坛株重组痘苗病毒减毒载体VTTΔB8RlacZ。
2.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒VTTΔB8RlacZ，其转移质粒pSKB8RLacZ，它是在转移质粒pSKB8R左侧同源序列B8RL片段、右侧同源序列B8RR片段间插入痘苗病毒启动子序列pE/L、p7.5及下游LacZ序列，以质粒pSC65为模板扩增痘苗病毒启动子序列pE/L、p7.5及下游LacZ序列引物为pSC65F、pSC65R得到的。
3.根据权利要求2所述的重组痘苗病毒VTTΔB8RlacZ，其质粒pSC65的保藏号是CGMCC No.1097。
4.权利要求2所述的重组痘苗病毒VTTΔB8RlacZ，其转移质粒pSKB8R，即在载体质粒pBR-SK插入痘苗病毒天坛株B8R基因外左侧同源序列B8RL片段、右侧同源序列B8RR片段的一种转移质粒。
5.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒VTTΔB8RlacZ，其转移质粒pSKB8RNeo是在pSKB8R左侧同源序列B8RL片段、右侧同源序列B8RR片段外侧插入痘苗病毒启动子序列pH6及下游Neo的一种转移质粒。
6.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒VTTΔB8RlacZ，其转移质粒pSKB8RPNeo是在pSKB8RNeo左侧同源序列B8RL片段、右侧同源序列B8RR片段间插入两个互为反向的痘苗病毒启动子序列pE/L、p7.5及多克隆位点的一种转移质粒。
7.根据权利要求1所述的重组痘苗VTTΔB8RlacZ，其B8R基因缺失、涉及基因缺失TK区插入外源基因表达病毒各种单价或多价抗原基因的天坛株重组痘苗病毒疫苗构建。
8.根据权利要求7所述的重组痘苗VTTΔB8RlacZ，其天坛株重组痘苗病毒疫苗是一种B8R基因缺失表达HIV-1抗原的VTKgpeΔB8RlacZ，B8R基因缺失为lacZ所取代，TK区插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpol env基因的天坛株重组痘苗病毒的艾滋病疫苗，将VTKgpe，即TK区插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpol env基因的天坛株重组痘苗病毒与转移质粒pSKB8RLacZ共转染CEF细胞进行同源重组，经蓝白筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因缺失为lacZ所取代的重组病毒VTKgpeΔB8RlacZ。
9.据权利要求7所述的重组痘苗VTTΔB8RlacZ，其天坛株重组痘苗病毒疫苗是一种B8R基因缺失、表达HIV-1抗原的VTKgpeΔB8R，即B8R基因缺失不带lacZ选择标记，TK区插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpolenv基因的天坛株重组痘苗病毒VTKgpeΔB8R的艾滋病疫苗。
10.根据权利要求9所述的重组痘苗VTTΔB8RlacZ，其重组痘苗病毒VTKgpeΔB8R的艾滋病疫苗，是IFN-γ受体基因B8R缺失的天坛株重组痘苗病毒recombinant vaccinia virus VTKgpe CGMCC.NO.1099。
11.根据权利要求7所述的重组痘苗VTTΔB8RlacZ，其B8R基因缺失、涉及基因缺失插入HBSAg抗原，TK区插入IL-2基因表达乙型肝炎病毒HBSAg抗原，IL-2的天坛株重组痘苗病毒的乙型肝炎病疫苗。
12.根据权利要求1-11所述的重组痘苗VTTΔB8RlacZ，任选其中一项在制备治疗病毒病的重组痘苗病毒疫苗药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及IFN－γ受体基因(B8R)缺失的天坛株重组痘苗病毒减毒载体以及基于此载体构建的表达HIV－1各种抗原(单价及多价)的IFN－γ受体基因(B8R)缺失的天坛株重组痘苗病毒艾滋病疫苗，一种天坛株重组痘苗病毒recombinan t vaccinia virius VTKgpe毒recombinant vaccinia virus VTKgpe CGMCC.NO.1099和另外一种乙型肝炎病毒HBSAg抗原，IL－2的天坛株重组痘苗病毒的乙型肝炎病疫苗。本发明在制备治疗病毒病的重组痘苗病毒疫苗药物中的应用有着重要的意义。
文档编号A61K39/295GK1560248SQ200410028279
公开日2005年1月5日 申请日期2004年3月10日 优先权日2004年3月10日
发明者邵一鸣, 黄薇, 刘颖 申请人:中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心, 中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防