一株深海真菌枝孢霉及其提取物和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株深海真菌枝孢霉及其提取物和应用。深海真菌枝孢霉(Cladosporium?sp.)FS86于2014年3月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC?NO：M?2014108，其发酵提取物对病原真菌白色念珠菌(Candida?albicans)、黑曲霉(Aspergillus?niger)、黄曲霉(Aspergillus?flavus)、绿色木霉(Trichoderma?viride)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum?gloeosporioides)、柱枝双孢霉(Cylindrocladium?scoparium)或新月弯孢霉(Curvularia?lunata)具有显著抑制效果。因此，本发明的实现，为开发新的抗病原真菌药物和发掘深海真菌来源的天然活性物质提供了科学依据。
【专利说明】一株深海真菌枝孢霉及其提取物和应用
【技术领域】:
[0001]本发明属于生物和医药【技术领域】,具体涉及一株深海真菌枝孢霉(Cladosporiumsp.)FS86,以及从该菌株的液体培养产物中制备的发酵提取物，和该提取物在制备抗病原真菌药物中的应用。
【背景技术】:
[0002]白色念珠菌(Candidaalbicans)是一种重要的条件致病性真菌，通常存在于正常人口腔，上呼吸道，肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病，当机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调，则本菌大量繁殖并改变生长形式(芽生菌丝相)侵入细胞引起疾病。近年来随着大剂量抗生素、激素、免疫抑制剂的应用，以及器官移植术的开展，使深部真菌感染日益增多并可危及生命。白色念珠菌病主要是引起的急性、亚急性或慢性感染，是最常见的真菌病，日益严重的耐药现象和有限的治疗药物使白色念珠菌感染成为临床上迫切需要解决的问题。
[0003]植物病原真菌是植物病害的主要病原微生物，是威胁植物生存的重大因素，每年都给农林业生产带来巨大损失。目前植物真菌病害仍以有机合成的化学药剂防治为主，但大量化学农药的使用，不但对人类环境造成了严重危害，而且增加了病原真菌的抗药性。在人类越来越关注环境质量的今天，加强生物防治在植物病害中的应用，是病害防治的必然选择。因此，从微生物资源中寻找新的活性物质代替化学农药和使用天然抗菌化合物保护作物已成为当前研 究的重点。
[0004]海洋约占地球表面积的71%，蕴藏丰富的微生物资源，其中微生物占海洋生物数量的90%，控制着所有保持地球生态系统平衡的重要生物和生化循环，已有的研究数据表明海洋微生物资源库远比陆地微生物资源库大，而且目前还尚未被人类充分发掘和利用，可见海洋微生物是人类丰富的药源生物资源。
[0005]海洋中存在着许多自然条件特殊的环境，尤其是深海海洋环境，使生活于深海的海洋微生物处于独特的物理、化学和生态环境中，在永久黑暗、高水压、贫营养、剧变的温度梯度、高盐度和高浓度的有毒物质包围下，它们形成了极为特殊的生物结构、代谢机制系统。由于这种极端的环境，使深海海洋真菌能产生结构新颖、活性独特的代谢产物，具有巨大的应用价值，可为新药和生物农药的开发提供优异的种质资源。因此，深海微生物活性物质是研究开发海洋新药物的必然而有效的选择，也是目前深海微生物资源开发的热点。
【发明内容】
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[0006]本发明的第一个目的是提供一株深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.)FS86,该菌株于2014年3月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址:中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO:M2014108o
[0007]本发明的深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.)FS86是从南海(12° 58.551' E,17° 0.646' N) 1598m深处的沉积物中分离、纯化得到。其分离纯化方法为:将海泥样品用含3%粗海盐的无菌水稀释到10%，27°C振荡20min，取0.2mL均匀涂布在分离培养基中，26~28°C恒温箱培养，待菌落长出后，挑取菌落划线纯化得到。
[0008]所述分离培养基通过以下方式获得:用水煮200g马铃薯20min，过滤得计，再加入葡萄糖20g、KH2P043g、MgSO40.75g、BJOmg、粗海盐30g，琼脂20g，用水补足至1L，pH自然。
[0009]通过形态学研究，并根据《真菌鉴定手册》(魏景超，1979)，该菌株初步被鉴定为枝抱霉(Cladosporium sp.)。
[0010]其形态特征如下:
[0011]在分离培养基中28°C培养3天后，菌落微高出培养基，浅墨绿色，有沟纹，边缘具白色短绒毛状菌丝；培养5天后，菌落颜色墨绿色，边缘菌丝呈灰白色；培养7天后，菌落变成橄榄褐色至黑褐色，有辐射状沟纹(图1);菌丝有隔，淡黄褐色或黄褐色，分生孢子梗直立或弯曲，10-50X3 μ m，顶端具1-4个孢痕；分生孢子淡黄褐色至深橄榄色，圆柱形、椭圆形、纺锤形或橄榄形，2.0~9.0 X 2.5~4.5 μ m，O~I个隔膜，大多数无隔膜，I~4个细胞，孢痕和孢脐明显(图2)。
[0012]根据常规方法提取该菌株的DNA，并利用真菌的ITS区的通用引物扩增其ITS区，其ITS区的碱基序列如SEQ ID N0.1所示。通过在GenBank中进行Blast检索，与其相似度最高的两条序列均为枝孢霉(Cladosporium sp.),相似度达99.2%。
[0013]结合形态学特征和ITS序列分析结果，该菌株被鉴定为枝孢霉(Cladosporiumsp.)，命名为枝抱霉(Cladosporium sp.)FS86。 [0014]该菌株于2014年3月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址:中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO:M2014108。
[0015]本发明的第二个目的是提供一种具有抗病原真菌作用的深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.)发酵提取物。
[0016]本发明的深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.)发酵提取物是通过以下方法制备的，其特征在于，以上述枝孢霉FS86作为发酵菌株，液体发酵获得发酵培养物，用乙酸乙酯或无水乙醇或体积分数95%以上的乙醇水溶液冷浸，优选是用乙酸乙酯冷浸，冷浸液经浓
缩后获得。
[0017]所述的冷浸时间优选为24~48小时。
[0018]所述的液体发酵，优选是将枝孢霉FS86菌接种到发酵培养基中，120r/min，26°C培养7d，获得发酵培养物，所述每升发酵培养基通过以下方式获得:用水煮200g马铃薯20min,过滤得计，再加入葡萄糖10g、甘露醇20g、酵母膏3g、蛋白胨5g、味精5g、粗海盐
3.0g,用水补足至1L, pH自然。
[0019]本发明的第三个目的是提供深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.)FS86发酵提取物在制备抗病原真菌药物中的应用。
[0020]本发明通过实验发现,本发明的深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.)FS86发酵提取物在250yg/片滤纸浓度下,对白色念珠菌(Candida albicans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、绿色木霉(Trichoderma viride)、胶抱炭疽菌(Colletotrichum gloeospor1ides)、柱枝双抱霉(Cylindrocladium scoparium)和新月弯抱霉(Curvularia Iunata)的抑菌圈直径分别为 45.2mm、41.0mm、40.2mm、30.8mm、36.8mm、35.2mm、30.5mmn 选择 4mg/mL, 2mg/mL, lmg/mL, 0.5mg/mL, 0.2mg/mL, 0.lmg/mL, 0.05mg/mL7个浓度下进行最低抑菌浓度(MIC值)试验，确定该发酵提取物对白色念珠菌、黑曲霉、黄曲霉、绿色木霉、胶孢炭疽菌、柱枝双孢霉和新月弯孢霉的MIC值分别为0.lmg/mL、lmg/mL、2mg/mL、2mg/mL、lmg/mL、lmg/mL、0.25mg/mL。由此可见，本发明的枝孢霉FS86发酵提取物具有显著的抗病原真菌活性，可用来制备抗病原真菌药物。
[0021]本发明的第四个目的是提供一种抗病原真菌药物，其特征在于，该抗病原真菌药物包含枝孢霉FS86发酵提取物作为活性成分。
[0022]所述的抗病原真菌药物优选为抗白色念珠菌、黑曲霉、黄曲霉、绿色木霉、胶孢炭疽菌、柱枝双孢霉或新月弯孢霉的药物。
[0023]本发明的枝孢霉FS86发酵提取物具有广谱抗病原真菌活性，表明该发酵提取物具有很好的应用前景，因此本发明为开发新的抗病原真菌药物、发掘深海真菌来源的天然活性物质提供了科学依据。
[0024]本发明的枝孢霉((:1&(108?01^111118?.奸586于2014年3月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址:中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO:M2014108。
【专利附图】
【附图说明】:
[0025]图1是枝孢霉(Cladosporium sp.)FS86在分离培养基中的菌落特征,其中A、B、C分别为培养3天、5天、7天。
[0026]图2是枝孢霉(Cladosporium sp.)FS86在光学显微镜和电子显微镜下的照片，A为分生孢子和分生孢子梗的光学显微照片为分 生孢子的光学显微照片；C-D为分生孢子和分生孢子梗的扫描电镜照片；D-F为分生孢子的扫描电镜照片。
【具体实施方式】:
[0027]以下通过具体实施例来对本发明进一步说明，但并非限制本发明。
[0028]实施例1:深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.)FS86的分离和鉴定
[0029]深海真菌枝孢霉(Cladosporiumsp.)FS86 是从南海(12。58.551 ' E,17° 0.646' N) 1598m深处的沉积物中分离、纯化得到。其分离纯化方法为:将海泥样品用含3%粗海盐的无菌水稀释到10%，27°C振荡20min，取0.2mL均匀涂布在分离培养基中，26~28°C恒温箱培养，待菌落长出后，挑取菌落划线纯化得到。所述分离培养基每升通过以下方式获得:用水煮200g马铃薯20min,过滤得计，再加入葡萄糖20g、KH2P043g、MgSO40.758、811011^、粗海盐3(^琼脂20g，用水补足至1L，pH自然。
[0030]通过形态学研究，并根据《真菌鉴定手册》(魏景超，1979)，该菌株初步被鉴定为枝抱霉(Cladosporium sp.)。
[0031]其形态特征如下:
[0032]在分离培养基中28°C培养3天后，菌落微高出培养基，浅墨绿色，有沟纹，边缘具白色短绒毛状菌丝；培养5天后，菌落颜色墨绿色，边缘菌丝呈灰白色；培养7天后，菌落变成橄榄褐色至黑褐色，有辐射状沟纹(图1);菌丝有隔，淡黄褐色或黄褐色，分生孢子梗直立或弯曲，10-50X3 μ m，顶端具1-4个孢痕；分生孢子淡黄褐色至深橄榄色，圆柱形、椭圆形、纺锤形或橄榄形，2.0~9.0 X 2.5~4.5 μ m，O~I个隔膜，大多数无隔膜，I~4个细胞，孢痕和孢脐明显(图2)。[0033]根据常规方法提取该菌株的DNA，并利用真菌的ITS区的通用引物扩增其ITS区，其ITS区的碱基序列如SEQ ID N0.1所示。通过在GenBank中进行Blast检索，与其相似度最高的两条序列均为枝孢霉(Cladosporium sp.),相似度达99.2%。
[0034]结合形态学特征和ITS序列分析结果，该菌株被鉴定为枝孢霉(Cladosporiumsp.)，命名为枝抱霉(Cladosporium sp.)FS86。
[0035]该菌株于2014年3月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址:中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO:M2014108。
[0036]实施例2:深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.)FS86发酵提取物的制备
[0037]将枝孢霉FS86菌接种到发酵培养基中，120r/min，26°C培养7d，获得枝孢霉FS86发酵培养物。
[0038]将枝孢霉FS86的发酵培养物，用乙酸乙酯冷浸24h，冷浸液再经减压浓缩得即得到褐色膏状的提取物，即为枝孢霉FS86发酵提取物。
[0039]所述每升发酵培养基通过以下方式获得:用水煮200g马铃薯20min，过滤得计，再加入葡萄糖10g、甘露醇20g、酵母膏3g、蛋白胨5g、味精5g、粗海盐3.0g,用水补足至1L,pH:自然。
[0040]实施例3:深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.)FS86发酵提取物的抗病原真菌活性
[0041]一、抗菌活性测定:
[0042]采用滤纸片法测定枝孢霉FS86发酵提取物对白色念珠菌、黑曲霉、黄曲霉、绿色木霉、胶孢炭疽菌、柱枝双孢霉或新月弯孢霉的抗菌活性。
[0043]将实施例2得到的枝孢霉FS86发酵提取物用DMSO溶解，并稀释至50mg/mL浓度。
[0044]将液体发酵获得的上述病原真菌菌液用生理盐水分别稀释至菌数或孢子数含量为106个/mL的浓度，吸取浓度为106个/mL的菌夜或孢子悬浮液ImL于培养皿中，倒入已冷却至合适温度的PDA培养基,混合均匀,用无菌镊子夹取厚度为1.5_、直径为6mm的滤纸片置于含菌平板上，同时在滤纸片上分别滴加枝孢霉FS86发酵提取物稀释液5 μ L作为样品组，以DMSO代替该发酵提取物稀释液作为空白对照组，将平板置于26°C恒温箱培养72h，用十字测量法测量抑菌圈直径的大小，重复三次实验，以抑菌圈直径大小来评价抗菌活性。
[0045]实验结果如表1所示:
[0046]表1:深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.)FS86发酵提取物的抗病原真菌作用
(X n=3)
[0047]
【权利要求】
1.一株深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.) FS86，其保藏编号为CCTCC NO:M2014108。
2.一种深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.) FS86发酵提取物,其特征在于,其是通过以下方法制备的:以权利要求1所述的深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.)FS86作为发酵菌株，液体发酵获得发酵培养物，用乙酸乙酯或无水乙醇或体积分数95%以上的乙醇水溶液冷浸，冷浸液经浓缩后获得深海真菌枝孢霉FS86发酵提取物；所述的冷浸时间为24~28小时。
3.根据权利要求2所述的深海真菌枝孢霉(Cladosporiumsp.)FS86发酵提取物,其特征在于，所述的液体发酵是将深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.)FS86菌接种到发酵培养基中，120r/min，26°C培养7d，获得发酵培养物，所述发酵培养基每升通过以下方式获得:用水煮200g马铃薯20min,过滤得计,再加入葡萄糖10g、甘露醇20g、酵母膏3g、蛋白胨5g、味精5g、粗海盐3.0g，用水补足至1L，pH自然。
4.权利要求2所述的深海真菌枝孢霉(Cladosporiumsp.)FS86发酵提取物在制备抗病原真菌药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的抗病原真菌药物为抗白色念珠菌(Candida albicans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、绿色木霉(Trichoderma viride)、胶抱炭疽菌(Colletotrichum gloeospor1ides)、柱枝双抱霉(Cylindrocladiumscoparium)或新月弯抱霉(Curvularialunata)的药物。
6.一种抗病原真菌药物，其特征在于，该抗病原真菌药物包含权利要求2所述的深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.)FS86发酵提取物作为活性成分。
7.根据权利要求6所述的抗病原真菌药物，其特征在于，所述的抗病原真菌药物为抗白色念珠菌(Candida albicans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、绿色木霉(Trichoderma viride)、胶抱炭疽菌(Colletotrichumgloeospor1ides)、柱枝双抱霉(Cylindrocladiumscoparium)或新月弯抱霉(CurvulariaIunata)的药物。
【文档编号】C12R1/645GK104031844SQ201410212196
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年5月19日 优先权日:2014年5月19日
【发明者】李浩华, 章卫民, 王磊, 谭国慧 申请人:广东省微生物研究所