专利名称：利用鹿胎盘制备生物活性蛋白寡肽粉的方法
技术领域：
本发明涉及制备一种生物活性蛋白寡肽粉的方法，特别涉及一种利用鹿胎盘制备生物活性蛋白寡肽粉的方法。
背景技术：
目前已有人以鳕鱼肉、鲢鱼、大豆、动物皮等为原料，采用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶及胰蛋白酶等水解蛋白酶制备了生物活性寡肽。在动物原料中，水产生物较为多见，鹿源寡肽还未见报道，在寡肽的生物活性方面也多集中在清除自由基活性，ACE抑制活性寡肽还未见报道。鹿胎盘有补肾益精、延缓衰老的作用。但由于鹿胎盘温补作用显著，主要适合于气血不足，肾气亏虚的人食用，而大部分健康人群都不能过多食用，因此，限制了鹿胎盘的开发利用。同时，在一些鹿业公司鹿胎盘用酶活性为资源也未能被充分利用，而造成资源浪费。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用鹿肉制备的生物活性蛋白寡肽及其制备方法。为实现上述目的，本发明提供了一种利用鹿肉制备生物活性蛋白寡肽粉。本发明还提供了一种利用鹿肉制备生物活性蛋白寡肽粉及其制备方法，所述制备方法包括以下步骤a.鹿胎盘预处理将鹿胎盘煮至所述鹿胎盘的蛋白变性；b.蛋白酶水解向变性的鹿胎盘中添加碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，进行酶解反应；c.分离纯化将所述酶解液除盐、冷冻干燥所得到的淡黄色粉针状细末即为所述生物活性蛋白寡肽粉。本发明还提供了所述生物活性寡肽作为原料在医药、保健品、化妆品的应用。由于本发明以生物活性丰富以鹿肉或鹿胎盘作为原料，具有补肾益精、延缓衰老的功效；同时，由于寡肽富有的各种生物活性，本发明的生物活性的蛋白寡肽同时还具有 ACE抑制的补肾益精活性和基于清除自由基指标的抗衰老活性，将该生物活性寡肽作为原料应用于医药、保健品、化妆品领域，为有效利用鹿肉资源，提供一种开发途径。
图1为本发明实施例1的鹿胎盘寡肽四个批次的TLC图谱。图2为用相似度评价软件自动生成的本发明的鹿胎盘寡肽对照图谱。图3为本发明实施例1的鹿胎盘寡肽的分子量分布。图4为本发明实施例1的鹿胎盘寡肽在分子量为500-2000的展开图；图5为本发明实施例1的鹿胎盘寡肽浓度与ACE抑制活性关系曲线。
具体实施例方式下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。本发明是按以下技术方案实现的，其制备及质量检测方法是a.鹿肉预处理将鹿肉或者鹿胎盘中肉质部分，去除筋膜和血管，洗净，反复冻融，绞碎。优选地，原料选自鹿胎盘；优选地，冻融三次以上；优选地，用95°C以上水煮15-30 分钟。b.蛋白酶水解将变性的鹿肉与的水均勻混合，添加的碱性蛋白酶和的木瓜蛋白酶，进行酶解反应，灭酶活，冷却至常温。优选地，碱性蛋白酶占鹿胎原料的0.8%-2% ；木瓜蛋白酶占鹿胎原料的0. 8 % -2 %，优选地，在55 士 5°C，pH7. 5 士0. 5的条件下酶解反应3_5 小时；优选地，95°C以上灭酶活15分钟，冷却至常温；优选地，变性的鹿肉与1 1的水的混合比例为1 1，按重量计。c.分离纯化离心去除不溶杂质后，将酶解液稀释，分离，收集分子量< 5k的部分，将收集到的料液除盐，收集除盐后的浓缩液，旋转蒸发除去大部分水后，冷冻干燥即获得淡黄色粉针状细末。优选地，采用SOOOrpm高速离心；优选地，将酶解液稀释10倍以上， 优选地，采用超滤膜分离，优选地，利用纳滤除盐。d.薄层色谱检测产品薄层色谱条件为展开剂配方为正丁醇乙醇乙酸水 =4:1:1: 2，显色剂配方为0.2%的茚三酮乙醇溶液，得到该工艺产品的5个主要特征点，为合格。e.高效液相色谱检测产品高效液相条件为=Agilent 1100型高效液相色谱仪， At 1 ant I S T3色谱柱(4. 6X 10_，3 μ m)，流动相为100%的超纯水，流速0. 6ml/min,选样量10μ 1，检测波长紫外215nm。用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》软件制定出对照图谱，与对照图谱相似度大于90%的鹿胎盘寡肽为合格。实施例1以鹿胎盘为原料，去除其鹿胎盘肉质子叶，去除其血管和筋膜，将其洗净。将所属肉质子叶反复冻融三次，绞碎，95°C以上水煮15-30分钟。将变性的鹿肉与1 1的水均勻混合，添加鹿胎原料的0.8%的碱性蛋白酶(酶活力2. 4AU/g，丹麦诺维信)和2%的木瓜蛋白酶(800000u/g，南宁东恒华道)，在55士5°C，pH7. 5士0. 5的条件下，酶解反应3_5小时， 950C以上灭酶活15分钟，冷却至常温。采用SOOOrpm高速离心去除不溶杂质后，将酶解液稀释10倍以上，采用超滤膜分离，收集分子量< 5k的部分，将收集到的料液利用纳滤除盐， 收集纳滤后的浓缩液，旋转蒸发除去大部分水后，冷冻干燥即获得淡黄色粉针状细末。实施例2以鹿胎盘为原料，去鹿胎盘肉质子叶，去除血管和筋膜，洗净。将肉质子叶反复冻融三次，绞碎，95°C以上水煮15-30分钟。将变性的鹿肉与1 1的水均勻混合，添加鹿胎原料的2 %的碱性蛋白酶和0.8%的木瓜蛋白酶，在55 士 5°C，pH7. 5 士0. 5的条件下，酶解反应3-5小时，95°C以上灭酶活15分钟，冷却至常温。采用8000rpm高速离心去除不溶杂质后，将酶解液稀释10倍以上，采用超滤膜分离，收集分子量< 5k的部分，将收集到的料液利用纳滤除盐，收集纳滤后的浓缩液，旋转蒸发除去大部分水后，冷冻干燥即获得淡黄色粉针状细末。
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实施例3选料去鹿胎盘肉质子叶，去除血管和筋膜，洗净。将肉质子叶反复冻融三次，绞碎，95°C以上水煮15-30分钟。将变性的鹿肉与1 1的水均勻混合，添加鹿胎原料的1.5% 的碱性蛋白酶和1.5%的木瓜蛋白酶，在55 士 5°C，pH7. 5 士 0.5的条件下，酶解反应3-5小时，95°C以上灭酶活15分钟，冷却至常温。采用8000rpm高速离心去除不溶杂质后，将酶解液稀释10倍以上，采用超滤膜分离，收集分子量<证的部分，将收集到的料液利用纳滤除盐，收集纳滤后的浓缩液，旋转蒸发除去大部分水后，冷冻干燥即获得淡黄色粉针状细末。实施例4图1为本发明实施例1的鹿胎盘寡肽四个批次的TLC图谱。将上述实施例1的鹿胎盘寡肽的淡黄色粉末制备成四个批次，分别将四个批次的样品溶解并制成lmg/ml的溶液在展开缸中进行展开，采用TLC法检测四个批次生产的鹿胎盘寡肽产品，展开剂配方为正丁醇乙醇乙酸水=4 1 1 2，显色剂配方为0.2%的茚三酮乙醇溶液。对四个不同批次生产的鹿胎盘寡肽产品的薄层色谱结果进行分析，如图1所示，每个样品中，共含有5个可见圆点，从上到下1-5这5个点的比移值分别为0. 8375,0. 65，0. 5375,0. 475， 0.观75。当得到的产品为如图1所示从上到下的5个主要特征点时，为合格产品。实施例5高效液相色谱检测条件为高效液相色谱检测产品条件为=Agilent 1100型高效液相色谱仪，At Iant i S T3色谱柱(4. 6X 10mm，3 μ m),流动相为100 %的超纯水，流速 0. 6ml/min，进样量10 μ 1，检测波长紫外215nm。图2为相似度评价软件自动生成的鹿胎盘寡肽对照图谱。该图谱用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2004A》软件制定出，且该对照图谱积分数据如表1。与对照图谱相似度大于90%的鹿胎盘寡肽为合格产品。表1对照用指纹图谱积分数据
权利要求
1.一种利用鹿胎盘制备生物活性蛋白寡肽粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤a.鹿胎盘预处理将鹿胎盘煮至所述鹿胎盘的蛋白变性；b.蛋白酶水解向变性的鹿胎盘中添加碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，进行酶解反应；c.分离纯化将所述酶解液除盐、冷冻干燥所得到的淡黄色粉针状细末即为所述生物活性蛋白寡肽粉。
2.一种如权利要求1所述的生物活性蛋白寡肽粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤步骤a包括将鹿胎盘去除筋膜和血管后，反复冻融，再将融化的鹿胎盘绞碎，在水中煮已搅碎的鹿胎盘，直至所述鹿胎盘的蛋白变性；步骤b包括将变性的鹿胎盘与水混合，向混合物中添加碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，进行酶解反应，然后灭酶活性，将所得酶解液冷却至常温；步骤c包括将所述酶解液离心去除杂质后，稀释，并分离、收集酶解液中分子量< 5k 的部分，然后除盐，再将除盐后的浓缩液除去水后，冷冻干燥；所得到得淡黄色粉针状细末即为所述生物活性蛋白寡肽粉。
3.—种如权利要求1所述的生物活性蛋白寡肽粉的制备方法，其特征在于，所述鹿胎盘包括马鹿的胎盘或梅花鹿的胎盘。
4.一种如权利要求1所述的生物活性蛋白寡肽粉的制备方法，其特征在于，在步骤(b) 中，碱性蛋白酶的用量是鹿胎盘原料重量的0.8% _2%，木瓜蛋白酶的用量是鹿胎盘原料重量的0.8% _2%，酶解反应的pH为7. 5士0.5，酶解反应温度为55士5°C。
5.一种如权利要求1所述的生物活性蛋白寡肽粉的制备方法，其特征在于，在步骤(b) 中，所述变性的鹿胎盘和水的重量比例为1 1，所述酶解反应进行3-5小时。
6.一种如权利要求1所述的生物活性蛋白寡肽粉的制备方法，其特征在于，在步骤(b) 中，所述碱性蛋白酶的用量是鹿胎盘原料重量的0. 8%，所述木瓜蛋白酶的用量是鹿胎盘原料重量的2%，所述酶解反应为3小时。
7.—种如权利要求1所述的生物活性蛋白寡肽粉的制备方法，其特征在于，在步骤(b) 中，将酶解后的产物离心，并将所得上清液进一步纯化。
8.—种如权利要求1至7中任一项所述的方法制得的生物活性蛋白寡肽粉。
9.一种如权利要求8所述的一种生物活性蛋白寡肽粉，其特征在于，所述生物活性蛋白寡肽粉的总氨基酸含量占所述寡肽粉的79%以上。
10.一种如权利要求8所述的一种生物活性蛋白寡肽粉，其特征在于，所述生物活性蛋白寡肽粉的分子量在500-2000之间。
11.根据权利要求8所述的鹿胎盘生物活性寡肽作为原料在医药、保健品及化妆品中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种利用鹿肉的生物活性蛋白寡肽粉及其制备方法，其制备方法包括以下步骤将鹿肉进行预处理、蛋白酶水解及分离纯化，即得到所述生物活性蛋白寡肽粉；所得到的利用鹿肉的生物活性蛋白寡肽粉的总氨基酸含量在75％以上，分子量在500-2000之间。由于本发明以生物活性丰富的鹿胎盘作为原料，具有补肾益精、延缓衰老的功效；同时，由于寡肽富有的各种生物活性，本发明的生物活性的蛋白寡肽同时还具有ACE抑制的补肾益精活性和基于清除自由基的抗衰老活性，故本发明将该生物活性寡肽作为原料应用于医药、保健品、化妆品领域，为有效利用鹿肉资源，提供一种开发途径。
文档编号A61Q1/00GK102485903SQ20111023752
公开日2012年6月6日 申请日期2011年8月18日 优先权日2011年8月18日
发明者刘春生, 庞秀明, 董栗 申请人:内蒙古健元鹿业有限责任公司