一种采用阳离子多糖制备高生物活性卵黄抗体的方法
【技术领域】
[0001]一种采用阳离子多糖制备高生物活性卵黄抗体的方法，属于生物制品和工业化分离技术领域。
【背景技术】
[0002]鸡卵黄中富含卵黄抗体、高磷蛋白等生物活性蛋白，并被认为是活性抗体含量与活性最高，也是最廉价的资源。但迄今为止，还没有如人们所期望的那样得到工业化利用。其主要原因是因为卵黄中含有丰富的脂肪、蛋白质、胆固醇、卵磷脂等多种物质，对卵黄抗体的工业化分离造成了严重的困难。目前分离蛋黄抗体的方法主要有以下几种:(I)采用乙醇、聚乙二醇、丙酮等有机试剂分离的方法，虽然分离效果较好，但因为卵黄抗体主要是用于功能食品添加剂、生物医药等领域，因此如采用上述办法则有以下几个方面的问题。一是成本较高(试剂耗量大，如目前普遍采用的PEG-6000的用量最高达到12%的高浓度)；二是工艺复杂，操作条件难以掌握，且易造成卵黄抗体活性损失，三是产品最终有化学有害物质残留，产品的安全性达不到要求。(2)采用离子交换、金属螯合色谱、亲和色谱分离的方法，虽然纯度较高，但生产规模只以克计，而成本更可高达每克上百元。(3)采用CMC、海藻酸钠等大分子胶的水相抽提法，由于直接将大分子胶加入蛋黄体系，因此抽提效率较低，并在蛋黄中仍然含有较多的杂质及CMC、海藻酸钠等残留胶体大分子，直接影响了下一步超滤分离浓缩工艺，迄今尚未解决。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种采用阳离子多糖高效澄清技术，结合低温超滤浓缩分离新工艺，彻底解决了在分离过程中蛋黄液中残留高分子胶体的缺点，有利于卵黄抗体的分离提取，同时又使得蛋黄液可以得到进一步的应用。采用本发明能够以年产10吨以上的规模生产高生物活性蛋黄抗体产品。同时剩余蛋黄粉经加工后，还可得到剩余蛋黄粉、蛋黄油或蛋黄卵磷脂等副产品。使得蛋黄的加工深度得到了极大的提高，产品附加值也大增加。而成本则远低于以前的方法。
[0004]本发明的内容为:生产工艺流程框图如图1所示。主要技术特征有如下几点:(I)采用阳离子多糖高效澄清技术，结合工业化超滤浓缩分离技术，从蛋黄中分离提取活性蛋黄抗体，使蛋黄活性抗体的低成本、工业化分离得以实现，可达到年产10吨以上蛋黄抗体产品的生产规模。(2)采用PP膜精密过滤结合0.22 μm聚醚砜膜微滤对浓缩液进行冷除菌，产品可达到无菌级别。(4)微滤液中按比例加入甘油或吐温-20等保护剂，可在-30~0°C低温保存，可有效地保护产品生物活性。(5)整个工艺流程都在低温下(O?12°C)进行，确保了产品的高生物活性。
[0005]本发明的工艺为:
(I)将原料新鲜鸡蛋经检查消毒后，采用手工或机械方式分离蛋清和蛋黄。蛋清可直接经喷雾干燥制得副产品蛋白粉，或经发酵后喷雾干燥制得脱糖蛋白粉。将蛋黄经高纯水稀释、搅拌、沉淀分离后，得蛋黄抽提液，技术条件为:蛋黄:高纯水=1:6?20 (w/w)，直接搅拌5?25分钟，采用自然沉降4?16小时后分离。上清液中为蛋黄抗体粗提液。沉淀物(剩余蛋黄)经喷雾干燥后制得副产品蛋黄粉或采用超临界提取方法分离得到蛋黄卵磷脂、蛋黄油和剩余蛋黄粉等副产品。
[0006](2)将蛋黄抗体粗提液，按比例加入阳离子多糖，分别经搅拌、离心分离或板框过滤后得到澄清液，视料液情况而稍有不同，一般的范围为0.01?5.1% (w/w)，搅拌5?30min，然后静置1min?40min后，经管式离心或板框过滤后去除沉淀物，管式离心机5000?10000r/min分离或加入0.03?1.5%(w/w)娃藻土进行板框过滤，沉淀物等杂质弃去。
[0007](3)澄清液进行低温连续超滤膜分离，得到浓缩截留液。超滤温度为4?12°C，超滤膜的截留分子量为50，000?150，000，采用聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)、改性聚砜膜(PS膜)或聚醚砜膜(POS)。膜总面积可达10M2以上。
[0008](4)超滤透过液主要是一些低分子物质，可弃去。最后将浓缩截留液进行低温微滤除菌，微滤膜材料为改性聚砜膜(PS膜)或陶瓷膜等，孔径为0.1-0.5 um。
[0009](5)微滤透过液按比例加入5~20%甘油或吐温-20，无菌分装，得到主产品一卵黄活性抗体。
[0010]本发明的优点:
(I)该工艺采用阳离子多糖澄清方法，大大降低了后道工序中超滤膜的污染，使得工业化超滤生产得以实现。
[0011](2)超滤工艺具有无相态变化，不存在高温或化学因素破坏的优点，从根本上攻克了蛋黄抗体在加工过程中容易失活的难关，可最大程度地保留产品的活性。
[0012](3)微滤除菌既能够去除包括活菌体和死菌体在内的细菌体，其产品可实现无菌，而其他方法(如巴氏热杀菌或辐照低温杀菌)都会使蛋黄抗体的效价大大降低，从而大大降低产品的生物活性。
[0013](4)由于该工艺在水相提取蛋黄抗体及澄清时，只使用了高纯水，不必调节pH，从而使得对副产品蛋黄粉或全蛋粉的影响比其他工艺要小得多。而且采用了膜分离等高新技术后，可保证蛋黄抗体产品中不含任何有害物质，不含激素，高效安全。
[0014](5)提高了资源利用度，在生产过程中避免使用有机溶剂等有害物质，减少污染，保护了环境。
[0015](6)自动化程度较高，操作条件容易掌握，生产效率高，生产成本可大幅降低。
[0016]具体实施案例:
将2吨新鲜鸡蛋经消毒、打蛋、分蛋，所得蛋黄约0.60吨加入4一 12吨水，搅拌15分钟，低温保温沉淀12 —15小时，离心分离。沉淀物为剩余蛋黄，经喷雾干燥制得副产品蛋黄粉，约240公斤左右。上清液为蛋黄抗体抽提液，按配比加入阳离子多糖，搅拌15分钟，经板框过滤后将沉淀物弃去。澄清液经POS膜超滤，4?12°C，膜面积100m2。浓缩截留液经0.22um聚醚砜膜微滤膜除菌后，按比例加入甘油或者吐温-20，得到主产品卵黄抗体液体，约为100~150公斤。
[0017]应用举例:
本产品可用于各种消毒喷雾剂、湿巾、牙膏、免洗洗手液等；在制备免疫检测试剂中的应用，具体包括:免疫电泳、ELISA、免疫沉淀、免疫印迹、抗体芯片、时间分辨荧光免疫分析和免疫细胞学等一系列免疫诊断技术，用以检测相应的抗原。可添加含蛋黄活性抗体的婴儿、老年人及免疫功能低下人群的功能食品中，如婴儿仿母乳产品、老年奶粉。
【主权项】
1.一种采用阳离子多糖制备高生物活性卵黄抗体的方法，本发明的特征是采用阳离子多糖提取技术，结合超滤技术，分离活性卵黄抗体，其工艺为: (1)将原料新鲜鸡蛋经消毒、分蛋后，将蛋黄经水稀释、搅拌、沉淀分离后，得到蛋黄抽提液，技术条件为:蛋黄:水=1:6?20 (w/w)，在O?12°C下自然沉降4?16小时； (2)卵黄抗体粗提液中加入阳离子多糖，经搅拌、离心分离或板框过滤后，得澄清液，技术条件为:阳离子多糖总用量为抽提液的0.01?5.1% (w/w);阳离子多糖为壳聚糖、阳离子瓜尔豆胶或阳离子的羟乙基纤维素(HEC);搅拌5?30min，管式离心机5000?8000r/min分离，或加入0.03?1.5%(w/w)娃藻土进行板框过滤； (3)将澄清液进行连续超滤膜分离，得到浓缩截留液，技术条件为:超滤温度4?12°C，超滤膜的截留分子量为50，000?100，000，膜材料为聚偏氟乙烯或改性聚砜； (4)将浓缩截留液先采用PP膜进行低温精密过滤，除去悬浮杂质，然后再采用聚醚砜膜微滤膜除菌，微滤膜孔径为0.22um ; (5)将得到的无菌微滤透过液加入5~20%的甘油或吐温-20等保护剂，添加量5~20%，在-30°C ~0°C保存，得主产品卵黄活性抗体。2.按权利要求1所述的方法，其特征为采用阳离子多糖为壳聚糖、阳离子瓜尔豆胶或阳离子的羟乙基纤维素(HEC)。3.按权利要求1所述的方法，其特征为采用微滤技术对超滤浓缩液进行冷除菌，主产品的微生物指标可以达到无菌级别。4.按权利要求1所述的方法，其特征为实现了年产10吨以上的工业化规模生产高生物活性的卵黄抗体。
【专利摘要】本发明涉及一种采用阳离子多糖制备高生物活性卵黄抗体的方法，属于生物制品和工业化分离技术领域。本发明采用阳离子多糖高效提取技术，结合超滤浓缩分离，微滤除菌过滤，添加保护剂，实现了工业化规模从蛋黄中分离提取高生物活性无菌卵黄抗体，年产10吨以上。本发明采用了生物免疫、膜分离等高新技术，具有技术含量高，资源利用度高，自动化程度高的特点，是清洁工艺生产绿色生物活性食品的典型代表。
【IPC分类】C07K16/02
【公开号】CN105218666
【申请号】CN201510770940
【发明人】卢晓露, 郑辉, 杨严俊
【申请人】广东京豪医药科技开发有限公司
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年11月12日