一种具有抗肿瘤活性的壳五聚糖及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药技术领域。特别是一种壳五聚糖的制备工艺及其抗肿瘤活性。
【背景技术】
[0002]甲壳素是一种在自然界中是含量仅次于纤维素的第二大天然多糖，壳聚糖是甲壳素的脱乙酰产物，它们是存在于自然界唯一的天然阳离子多糖，并广泛存在于虾壳、蟹壳及真菌中。除了糖、蛋白质、脂肪、维生素和矿物质外，甲壳素被誉为人体所必需的第六生命要素。然而由于甲壳素具有不溶性，有关甲壳素低聚糖的研究停滞不前，同甲壳素和壳聚糖的大分子相比，甲壳低聚糖具有较高的溶解性，无毒，易被人体吸收。近年来随着该领域研究的深入发现，经裂解后的甲壳低聚糖展现出其独特且优越的生理活性和功能性质。
[0003]目前，甲壳低聚糖的制备方法主要有化学法和酶法。两种方法相比，酶法具有在酶解过程中，不需要加入其它反应试剂，无其他副反应，酶解过程易于控制，特异性高等优点，而化学法易用于工业化生产，也具有其不可替代的优势。本发明通过前期一系列实验的探索，从众多的化学解聚方法中选择了相对较适宜的亚硝酸钠解聚法，在可控范围内解聚甲壳素得到目标产物。该制备方法的成功对应用化学法在可控范围内解聚多糖研究方面具有很重要的现实意义，较目前常用的酶法解聚多糖有很多优势，工业化前景更加广阔。
【发明内容】
[0004]本发明目的以甲壳素为原料，探索应用亚硝酸钠化学裂解法，对甲壳素进行可控的化学裂解，制备出具有抗肿瘤活性的五糖解聚物。运用先进的生物学模型，初步测定了其抗肿瘤活性，为研究海洋一类新药提供了基础。
[0005]本发明通过以下技术方案实现以上目的:以甲壳素为原料，乙酸溶解后，加入亚硝酸钠进行裂解，裂解过程结束后用氢氧化钠中和，并加入乙醇沉淀，再经超滤、透析和凝胶分离，所得溶液冻干后即得壳五聚糖。
[0006]本发明制备出的壳五聚糖经LC-MS和核磁共振分析表明，该解聚产品分子量与壳聚糖五糖分子量理论值相一致，且其多糖骨架结构未被破坏。
[0007]本发明制备出的壳五聚糖，经体外细胞实验表明具有良好的抗肿瘤活性。
【附图说明】
[0008]图1壳五聚糖LC-MS图谱
[0009]图2壳五聚糖1H-NMR图谱
【具体实施方式】
[0010]下面的实施例将对本发明做进一步的解释，但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。本领域的技术人员在权利要求的范围内所做出的某些改变和调整也应该认为属于本发明范围
[0011]实施例1
[0012]壳五聚糖制备工艺路线:
[0013](I).取甲壳素多糖纯品用水溶解后制成5%?10%的溶液，用醋酸调节pH值2.0?4.0，添加亚硝酸钠控制反应体系中亚硝酸钠浓度为0.lmol/L?0.8mol/L，控制反应温度25°C?50°C，反应时间为4?8小时。
[0014](2).用氢氧化钠或氨水碱调节裂解液控制pH值为6.0?7.5。再向其中加入3?5倍体积乙醇进行醇沉，4°C防爆冰箱静置过夜，高速离心得沉淀物，用少量乙醇洗涤沉淀，最后冻干得到淡黄色裂解产物。
[0015](3).将裂解产物溶解后制成10%?20%的溶液，用冰醋酸调节pH值为4，过40?60 μ m滤膜除不溶解颗粒物杂质。DEAE-FF树脂活化预处理后装到合适大小的柱子中。柱子先用缓冲液A(50mM氯化钠，20mM乙酸钠，pH4)预平衡。滤液加载到柱子上，柱子用三倍体积的缓冲液A冲洗。之后用缓冲液B(1M氯化钠，20mM乙酸钠，pH4)将甲壳素多糖从柱子上洗脱下来，收集洗脱液。
[0016](4).将洗脱液过1500?2000D的超滤膜，去除部分未裂解的甲壳素多糖，得到超滤液然后浓缩、冻干后得超滤产物。
[0017](5).将超滤产物溶解在水中制备成30%?50%的水溶液，然后装入截留分子量为300?500Da的透析袋中，流水透析除盐。
[0018](6).将透析产物收集后浓缩过分子筛层析柱，分离不同分子量的甲壳素寡糖片段。分子筛层析柱填料为生物胶B1-Gel p2?P4。
[0019]实施例2
[0020]解聚产物的结构鉴定:
[0021](I) LC-MS 分析
[0022]图1是甲壳素多糖经亚硝酸钠解聚法制备的裂解产品LC-MS分析图谱。该解聚产品的M-1为979.86与壳聚糖五糖分子量相一致。同时根据谱图可以看出在解聚产品中只有很微量的其他分子量多糖残留。说明通过亚硝酸钠解聚法制备出分子量与五糖分子量相一致的多糖产品，并且应用一定的分离纯化方法可以制备出其纯品。
[0023](2)核磁共振分析
[0024]图2是甲壳素多糖经亚硝酸钠解聚法制备的裂解产品分析1H-NMR图谱，它保留了未解聚甲壳素多糖的所有特征共振峰，并且两者峰型基本一致。这说明了通过亚硝酸钠解聚法制备出的多糖骨架结构未被破坏。
[0025]实施例3
[0026]壳五聚糖的抗肿瘤活性:
[0027]采用CCK-8法研究壳五聚糖产物对胃癌细胞(BGC-823)，肝上皮细胞癌(Bel7402)，肺癌细胞(A549)的抗肿瘤活性。设置药物浓度梯度为3.5、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5,0.25,0.l、0mg/ml，用RPM1-1640+10 % FBS培养基培养，取生长对数期细胞消化铺板，细胞数目按5xl04个/ml铺板，180 μ L/孔，于37°C、5% C02培养箱中培养。待细胞贴壁后，加入不同浓度的壳五聚糖及阳性药物紫杉醇20 μ L/孔，每个浓度均设三个平行孔，给药孵育培养72h后，每孔加入CCK-820 μ 1，继续培养4h。酶标仪上检测0D45(]nm。以药物浓度为横轴，抑制率为纵轴，做折线图，通过SPSS软件算得药物对不同细胞的半数抑制率IC5。值。
[0028]结果表明壳五聚糖具有良好的抗肿瘤活性，其对人肝癌细胞(BEL-7402)、胃癌细胞(BGC823)和肺癌细胞(A549)的增殖和生长均有明显的抑制关系，其对应的IC50值分别是 2.343mg/ml、0.891mg/ml 和 1.766mg/ml。
【主权项】
1.一种具有抗肿瘤活性的壳五聚糖制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1).取甲壳索多糖纯品用水溶解后制成5%?10%的溶液，用醋酸调节pH值2.0?4.0，添加亚硝酸钠控制反应体系中亚硝酸钠浓度为0.lmol/L?0.8mol/L，控制反应温度25°C?50°C，反应时间为4?8小时。 (2).用氢氧化钠或氨水碱调节裂解液控制pH值为6.0?7.5。再向其中加入3?5倍体积乙醇进行醇沉，4°C防爆冰箱静置过夜，高速离心得沉淀物，用少量乙醇洗涤沉淀，最后冻干得到淡黄色裂解产物。 (3).将裂解产物溶解后制成10%?20%的溶液，用冰醋酸调节pH值为4，过40?60 μ m滤膜除不溶解颗粒物杂质。DEAE-FF树脂活化预处理后装到合适大小的柱子中。柱子先用缓冲液A(50mM氯化钠，20mM乙酸钠，pH4)预平衡。滤液加载到柱子上，柱子用三倍体积的缓冲液A冲洗。之后用缓冲液B(1M氯化钠，20mM乙酸钠，pH4)将甲壳素多糖从柱子上洗脱下来，收集洗脱液。 (4).将洗脱液过1500?2000D的超滤膜，去除部分未裂解的甲壳素多糖，得到超滤液然后浓缩、冻干后得超滤产物。 (5).将超滤产物溶解在水中制备成30%?50 %的水溶液，然后装入截留分子量为300?500Da的透析袋中，流水透析除盐。 (6).将透析产物收集后浓缩过分子筛层析柱，分离不同分子量的甲壳素寡糖片段。分子筛层析柱填料为生物胶B1-Gel P2?P4。2.权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的壳五聚糖的制备方法，其特征在于对甲壳素进行可控的化学裂解，制备出具有抗肿瘤活性的五糖骨架结构。3.权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的壳五聚糖经体外抗肿瘤药效学试验，其特征在于壳五聚糖对人肝癌细胞(BEL-7402)、胃癌细胞(BGC823)和肺癌细胞(A549)的增殖和生长均有明显的抑制关系，其对应的IC50值分别是2.343mg/ml、0.891mg/ml和1.766mg/ml。4.权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的壳五聚糖在制备抗肿瘤海洋新药中的用途。
【专利摘要】本发明提供了一种亚硝酸钠化学裂解法制备壳五聚糖的方法，同时应用超滤、凝胶柱分离、透析等多种手段分离出纯度较高的壳五聚糖产物。并应用了LC-MS和核磁共振氢谱验证了结构。本发明中的壳五聚糖对多种肿瘤细胞如人肝癌细胞(BEL-7402)、胃癌细胞(BGC823)和肺癌细胞(A549)的增殖和生长都具有较强的抑制作用。为研究海洋一类新药提供了基础。
【IPC分类】A61K31/702, C07H1/00, C07H3/06, A61P35/00
【公开号】CN105111248
【申请号】CN201510626372
【发明人】张军, 孙进, 周丽, 尹鸿萍, 姜红玲, 彭秀兰
【申请人】江苏双林海洋生物药业有限公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年9月25日