一种魔芋甘露聚糖肽的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵和药用肽领域，涉及一种糖肽的制备方法，具体涉及一种魔芋甘露聚糖肽的制备方法。
【背景技术】
[0002]甘露聚糖肽曾用名为多抗甲素，是我国首创的一种生物免疫增强剂。它是由不同链长的甘露聚糖肽分子组合在一起形成的混合物，不存在小分子糖类和游离氨基酸，其主要结构为多肽链与甘露聚糖连接。现代药理及临床研究表明:甘露聚糖肽具有明显的生物活性，它可以调节机体免疫紊乱，显著增强自身免疫力。现较多用于治疗免疫功能低下或免疫障碍性疾病，如反复感冒、反复呼吸道感染、白细胞减少和肿瘤的辅助治疗以减轻放、化疗的不良反应等，并取得了较好的疗效，临床应用越来越广泛。
[0003]魔芋飞粉是在魔芋精粉加工过程中，飘落在周围的质量轻、颗粒小的细粉。魔芋飞粉中含有丰富的营养成分，蛋白质含量23.8%，水溶性糖分(甘露糖和葡萄糖)8.95%，是含高蛋白、低甘露聚糖的良好资源，但由于魔芋飞粉存在特殊的蛋腥味和臭味，目前主要用作动物饲料，利用率低。
[0004]目前，国内制备甘露聚糖肽主要从菌株培养液中提取，来源较单一。例如，专利申请号为03117579.1、名称为甘露聚糖肽及其制备工艺及用途的中国专利，是从α-溶血链球菌的发酵产物中分离提取精制而成甘露聚糖肽。专利申请号为200710093102.2、名称为高纯度甘露聚糖肽的制备方法的中国专利、以及专利申请号为200710093103.7、名称为甘露聚糖肽的制备方法的中国专利，均以α-溶血链球菌H1S-33号为菌株，进行液体发酵制备甘露聚糖肽。目前并未见到有以魔芋飞粉为原料制备甘露聚糖肽的方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种魔芋甘露聚糖肽的制备方法，该方法以魔芋飞粉为原料，通过发酵得到甘露聚糖肽，该方法既能拓宽甘露聚糖肽的来源，又为魔芋飞粉的开发利用提供了一条新途径。
[0006]为达到上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0007]—种魔芋甘露聚糖肽的制备方法，包括以下步骤:
[0008]I)发酵:向每10mL培养基中加入魔芋飞粉I?4g，采用耐热解蛋白芽孢杆菌和短小芽孢杆菌共生发酵，发酵完成后，发酵液经离心后去除菌体，取上清液，向其中加入I?5倍于上清液体积的纯化水，然后用三氯乙酸调节pH值至3.8?4.2，静置后去除沉淀，去除沉淀后得到的上清液即为魔芋糖肽液；
[0009]2)硫酸铵分级沉淀:向魔芋糖肽液中加入硫酸铵晶体，使硫酸铵的饱和度达到20?80%，然后静置、离心，离心得到的沉淀用pH = 7?9的Tris-Hcl缓冲液溶解，再经透析后得到可溶性糖肽；
[0010]3)用DEAE-52纤维素柱层析和SephadexG-1OO凝胶柱层析依次对可溶性糖肽进行分离纯化，得到魔芋甘露聚糖肽粗品；
[OO11 ] 4)将魔芋甘露聚糖肽粗品进行ConA-Sepharose4B亲和柱层析，即得到纯化的魔芋甘露聚糖肽。
[0012]所述步骤I)中的发酵工艺为:培养基的pH值为7.0?11.0，耐热解蛋白芽孢杆菌与短小芽孢杆菌的菌种比例为1: (I?3)，使用的菌液浓度为5X 17?5X 19个/mL，接种量为4?12 % (接种量为单位体积的培养基中接入的菌液的体积分数)，发酵温度为25?38°C，发酵时间为24?48h。
[0013]所述步骤I)中的培养基是向每10mL蒸馈水中加入蛋白胨lg、牛肉膏1.5g、NaN〇30.08?0.39g、K2HP04 0.04?0.25g、KCl 0.01 ?0.12g、MgS04.7H20 0.01 ?0.12g和FeSO40.001?0.0lg后得到的。
[0014]所述步骤I)中的发酵液在4°C下以8000?12000r/min的转速离心10?30min后去除囷体。
[0015]所述步骤2)中的静置是在-4°C下静置10?20min，离心是在4°C及8000?12000r/min的转速下离心10?30min。
[0016]所述步骤3)中的DEAE-52纤维素柱层析条件为:层析柱规格为(I?20)cmX(20?80)cm，上样量为I?500mL，依次用蒸馏水、0.05?0.15mo 1/L的NaHCO3溶液梯度洗脱，洗脱流速为0.5?80mL/min，每管收集2?4min，检测波长为280nm和490nm，合并同时具有糖、肽吸收峰的组分，浓缩、透析后备用。
[0017]所述步骤3)中的SephadexG-1OO凝胶柱层析条件为:层析柱规格为(I?20) cm X(50?120)cm，上样量为3?350mL，洗脱剂为蒸馏水，洗脱流速为0.5?180mL/min，每管收集3?6min，检测波长为280nm和490nm，合并同时具有糖、肽吸收峰的组分，再经浓缩、透析、乙醇沉淀干燥后得到魔芋甘露聚糖肽粗品。
[00? 8] 所述步骤4)中的ConA_Sepharose4B亲和柱层析条件为:层析柱规格为(I?20) cmX (20?40)cm，上样量为2?180mL，用0.2?0.5mol/L的α-甲基-D-甘露糖苷溶液竞争洗脱，洗脱流速为0.5?80mL/min，收集液经透析、浓缩、乙醇沉淀干燥后得到纯化的魔芋甘露聚糖肽。
[0019]制得的魔芋甘露聚糖肽中所含的甘露糖和葡萄糖的质量比为1.7:(I?4)。
[0020]相对于现有技术，本发明的有益效果为:
[0021]本发明提供的魔芋甘露聚糖肽的制备方法，在培养基中加入魔芋飞粉，通过耐热解蛋白芽孢杆菌和短小芽孢杆菌共生发酵得到魔芋糖肽液;然后采用硫酸铵分级沉淀提取魔芋糖肽液中的可溶性糖肽；再将可溶性糖肽依次通过DEAE-52纤维素柱层析和SephadexG-1OO凝胶柱层析进行分离纯化;最后采用ConA-Sepharose4B亲和柱层析得到纯化的魔芋甘露聚糖肽。本发明以魔芋飞粉为原料，结合发酵法、硫酸铵分级沉淀和色谱层析分离技术制备出魔芋甘露聚糖肽，发掘了魔芋飞粉的利用价值，拓宽了甘露聚糖肽的制备方法。运用本发明的方法，可以得到魔芋甘露聚糖肽，证实了魔芋飞粉是甘露聚糖肽的一种理想来源，填补了以魔芋飞粉为原料制备魔芋甘露聚糖肽的技术空白，既能拓宽甘露聚糖肽的来源，同时也为魔芋飞粉的开发利用、生产高附加值产品开辟了一条新的道路，在食品、医药等领域具有重要意义。
[0022]进一步的，对本发明制得的魔芋甘露聚糖肽的单糖成分进行了分析检测，发现制得的魔芋甘露聚糖肽中所含的单糖主要是甘露糖和葡萄糖，且甘露糖和葡萄糖质量比为1.7:(I?4)，可为魔芋甘露聚糖肽进一步在食品、医药等领域中的应用提供参考。
【附图说明】
[0023]图1为甘露聚糖肽标准品的氨基酸图谱；
[0024]图2为本发明制得的魔芋甘露聚糖肽的氨基酸图谱；
[0025]图3为甘露糖、葡萄糖混合标准品的高效液相色谱图；
[0026]图4为本发明制得的魔芋甘露聚糖肽的单糖水解物的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0027]下面结合实施例来详细说明本发明的技术方案。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明步骤或条件所做的修改或替代，均属于本发明的保护范围。
[0028]本发明提供了一种魔芋甘露聚糖肽的制备方法，以魔芋飞粉为原料，通过耐热解蛋白芽孢杆菌和短小芽孢杆菌共发酵制备魔芋多肽;采用硫酸铵分级沉淀法提取魔芋多肽中可溶性糖肽;然后将透析除盐后的粗糖肽依次通过DEAE-纤维素柱层析和凝胶柱层析进行分离纯化;最后采用亲和层析的方法得到纯化的魔芋甘露聚糖肽。本发明填补了以魔芋飞粉为原料结合发酵法、硫酸铵分级沉淀和色谱技术制备魔芋甘露聚糖肽的技术空白，同时也为魔芋飞粉的开发利用，生产高附加值产品开辟了一条新的道路，在食品、医药等领域具有重要意义。
[0029]下面结合具体的实施例对本发明进行进一步详细说明。
[0030]实施例1
[0031]I)发酵:将Ig魔芋飞粉加入到10mL发酵培养基中，采用耐热解蛋白芽孢杆菌和短小芽孢杆菌进行共生发酵。发酵完成后，发酵液在4°C下经8000r/min离心30min去除菌体，上清液加2倍纯化水，三氯乙酸调pH至3.8，静置后去沉淀，上清液即为魔芋多肽液。
[0032]其中，培养基的组成为:蛋白胨lg、牛肉膏1.5g、NaN03 0.2g,K2HPO4 0.2g、KCl
0.1g^MgSO4.7H20 0.1g、FeS04 0.005g，蒸馏水100mL。培养基的pH值为7，耐热解蛋白芽孢杆菌与短小芽孢杆菌的菌种比例为I: I，菌液浓度稀释至5 X 17个/mL，接种量为12% (V/V，接种量指的是单位体积的培养基中接入的菌液的体积分数，结合菌液浓度能够算出培养基与接种量