一种鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的制备方法及其用图
【技术领域】
[0001] 本申请涉及生物制品领域，更具体地，涉及一种鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的制备方法 及其用途。
【背景技术】
[0002] 胶原蛋白是人体或其他动物体内含量最丰富的一类蛋白质，主要存在于骨、皮、肌 腱、血管等组织，作为结缔组织中极为重要的一种蛋白质，起着支撑器官、保护机体的功能。 胶原蛋白作为天然的高分子化合物，具有合成高分子材料无法比拟的生物相容性和可降解 性，所以用途非常广泛，遍及医药、食品、化妆品等领域。
[0003] 胶原蛋白肽是一种新型胶原蛋白类产品，是以胶原蛋白或富含胶原蛋白的物质为 原料制备的。它具有原胶原蛋白或组成氨基酸所不具有的独特生理功能，可完全溶解于水， 水溶液粘度低，分子量较小，因此，它更容易透过表皮被真皮吸收，也容易通过消化道被消 化，在日化、保健食品领域有广阔的应用前景。
[0004] 关于胶原蛋白肽的制备，目前多见于以猪、牛的皮和骨、或水产来源酶解处理获得 的胶原蛋白肽的研究。而以鳄鱼特别是鳄鱼骨为原料的胶原蛋白肽还少见报道。随着鳄鱼 人工养殖与繁殖技术的日趋成熟，食用鳄的量大增，每年都有大量的鳄鱼骨被丢弃，不仅造 成资源浪费，而且还会污染环境。如果能合理利用鳄鱼骨的价值，将变废为宝，并带来显著 的经济价值和社会价值。
[0005] 目前胶原蛋白肽的制备，多采用酶解的生物学方法。酶法作用条件较温和，产品的 相对分子质量分布较窄，反应条件和过程容易控制，安全性较高。酶法制备的胶原蛋白肽不 仅可应用于功能性食品上，在医学和药学方面的应用也被广泛关注。由于原料为鳄鱼骨，成 分质地比较特殊，普通蛋白酶无法对鳄鱼骨胶原蛋白进行彻底地水解，且水解得到的产物 其生物学效应不显著。因此，对鳄鱼骨进行水解的难点在于水解酶的选择以及不同酶间的 组合。由于不同底物的分子结构和氨基酸序列存在差异，而不同的蛋白酶的水解作用位点 又不同，这直接导致不同蛋白酶的水解产物具有不同的生物学性质和不同的相对分子质量 分布范围。酶的不同组合方式是调整产物分子质量及分布的有效方法。在选择用于水解鳄 鱼骨的蛋白酶时，酶系、酶作用的强弱、酶的作用位点等都会对最终产物产生重要影响，对 多肽产品开发起着至关重要的作用。
【发明内容】
[0006] 本发明涉及一种鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的制备方法，包括:A.在溶剂中高压蒸煮已 去除肌肉、脂肪的鳄鱼骨，浓缩得鳄鱼骨胶;B.将得到的鳄鱼骨胶用蛋白酶处理，得到酶解 液;C.将所述酶解液离心分离，取上清干燥，得到鳄鱼骨胶原蛋白肽粉。在所述制备方法的 优选的实施方案中，所述在溶剂中高压蒸煮的时间可以是30±5分钟，其中所述溶剂可以是 水，优选蒸馏水，其中所述鳄鱼骨的重量与所述溶剂的体积的比例可以为1:3,其中所述浓 缩可以是浓缩至溶液的总体积的50%。在所述制备方法的优选的实施方案中，其中所述蛋 白酶可以为木瓜蛋白酶，所述木瓜蛋白酶与所述鳄鱼骨胶的重量比例可以为ο. 8%-1.8%， 优选为1.6%。在所述制备方法的优选的实施方案中，其中所述蛋白酶处理的条件可以是在 保持所述蛋白酶活性的pH下、在55°C± 2°C的温度下水解4小时± 5分钟。在所述制备方法的 优选的实施方案中，其中所述离心可以是在室温以4500rpm离心15±5分钟。在所述制备方 法的优选的实施方案中，其中所述干燥可以包括冷冻干燥和喷雾干燥，优选冷冻干燥。
[0007] 本发明还涉及由本发明的制备方法制备的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉。
[0008] 本发明还涉及包含本发明的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的用于保健品或化妆品的抗氧 化剂、抗DNA损伤剂或美白添加剂。
[0009] 本发明还涉及本发明的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉作为保健品或化妆品中的抗氧化剂、 抗DNA损伤剂或美白添加剂的用途。
[0010] 鳄鱼骨含有丰富的胶原蛋白，通过现代生物技术的酶法适当处理后，能够获得优 质的胶原蛋白肽。
[0011] 本申请的实施方案中，本发明人所选择的木瓜蛋白酶为巯基蛋白酶，是一种在酸 性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶，可水解蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨酸的 羧基端，并能优先水解那些在肽键的N-端具有两个羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽键。 本申请的实施例示出，木瓜蛋白酶水解鳄鱼骨胶原蛋白的产物为具有还原性末端的产物， 具有很好的生物学效应。
[0012] 此外，本申请公开的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的制备方法，不同于以往处理原材料的 复杂工序，而是跳过了从原料中提取胶原蛋白的工艺，直接对原材料进行处理，获得了功效 良好的优质胶原蛋白肽，达到了简化制备工艺的目的。
[0013] 本申请制备的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉不仅可以提高鳄鱼生产加工的附加值，同时可 减少环境污染、避免资源浪费，从而取得良好的社会价值和经济价值。本申请实施例中的实 验结果表明，本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉在抗氧化、体外抗DNA损伤方面效果显著;在对 蘑菇酪氨酸酶活性的实验中，本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉对酪氨酸酶活性具有显著的抑 制效果，说明其具有很好的美白功效。
【附图说明】
[0014] 图1显示了不同蛋白酶对鳄鱼骨胶水解的影响。在图1中，横坐标为不同蛋白酶（中 性蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶和胰蛋白酶），纵坐标为羟脯 氨酸含量。
[0015] 图2显示了不同酶量对鳄鱼骨胶水解的影响。其中，横坐标为不同酶量（0.8%、 1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%)，纵坐标为羟脯氨酸含量。
[0016] 图3显示了不同时间对鳄鱼骨胶水解的影响。其中，横坐标为不同酶解时间（lh、 2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h)，纵坐标为羟脯氨酸含量。
[0017] 图4显示了本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的全波长扫描结果。其中，横坐标为波 长，纵坐标为吸光度值。
[0018] 图5是本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的抗氧化活性检测，显示了本申请的不同浓 度的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉对DPPH和0H的清除率及相对总还原力的影响。
[0019] 图6显示了本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉对小鼠线粒体肿胀的影响。横坐标为不 同的时间（〇111；[11、5111；[11、10111；[11、15111；[11、20111；[11、25111；[11)，纵坐标为吸光度值0052()111]1。
[0020] 图7是DNA琼脂糖凝胶电泳图，显示了本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉在体外对由羟 自由基引发的DNA损伤的保护作用。其中，泳道1:无损伤对照组，泳道2:损伤对照组，泳道3: 0.5mg/mL的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉组，泳道4:1.Omg/mL鳄鱼骨胶原蛋白肽粉组。
[0021] 图8显示了本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉对蘑菇酪氨酸酶活性的影响。横坐标为 不同浓度的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉(0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.511^/1^)，纵坐标为酪 氨酸酶的相对活性。
[0022]图9显示了本申请的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖的影响。横 坐标为不同浓度的鳄鱼骨胶原蛋白肽粉处理组(浓度分别为12.5、25、50、100、200、400、800 yg/mL)，纵坐标为细胞相对增殖率。
【具体实施方式】
[0023]下面将以实施例的方式对本申请作进一步的详细描述，以使本领域技术人员能够 实践本申请。应当理解，可以采用其他实施方式，并且可以做出适当的改变而不偏离本申请 的精神或范围。为了避免对于使本领域技术人员能够实践本申请来说不必要的细节，说明 书可能省略了对于本领域技术人员来说已知的某些信息。因此，以下详细描述不应以限制 性的意义来理解，且本发明的范围仅由所附权利要求界定。
[0024]以下的实施例便于更好地理解本申请，但并不用来限制本申请的范围。
[0025]下述实施例中所使用的各原料，除特别指出的以外，均可由市售获得。
[0026]实施例1
[0027] 不同蛋白酶对鳄鱼骨胶水解的影响
[0028]取新鲜鳄鱼骨，去掉多余的肉、脂肪，清洗，剁成小块后，加入适量蒸馏水，鳄鱼骨 的重量与加入水的体积比例为1:3，在高压锅(GI54，Zealway，美国）内煮(压力约0.4MPa) 30 分钟后，冷却，浓缩至溶液的总体积的50 %，得鳄鱼骨胶。取6份等量鳄鱼骨胶，分别放入6个 烧杯中，在各烧杯中分别加入基于骨胶重量的1%的中性蛋白酶(枯草芽孢杆菌来源的中性 蛋白酶，枣庄市杰诺生物酶有限公司）、酸性蛋白酶(黑曲霉来源的酸性蛋白酶，枣庄市杰诺 生物酶有限公司）、碱性蛋白酶(地衣芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶，枣庄市杰诺生物酶有限 公司）、木瓜蛋白酶(上海生工）、复合蛋白酶(CN复合蛋白酶，无锡杰仁生物科技