一种生物酶催化制备胞二磷胆碱的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术及制药领域，包括基因工程和酶工程，本发明公开了用这个 菌株制备胞二磷胆碱的方法。
【背景技术】
[0002] 胞二磷胆碱，又名胞苷二磷酸胆碱，中国药典2005年版定名为胞磷胆碱，英文名： Citichaline，它的化学名称:胆碱胞啼啶核苷-5 ' -二磷酸酯。它是卵磷脂生物合成的前体， 当大脑功能下降时，脑组织内的卵磷脂含量显著减少。补充外源性胞二磷胆碱即能激活卵 磷脂的生物合成，刺激脑干网状结构的兴奋，提高苏醒阈值，恢复神经组织机能，改善脑代 谢和神经传导，提高患者的意识水平。
[0003] 上世纪50年代由kennedy博士等人发现并确定分子结构，稍后Rossiter等阐明其 功能。70年代初，日本武田制药株式会社研发并用于治疗脑外伤，脑手术伴随的意识障碍的 临床获得成功，其商品名:Nichdin，中译名:尼柯灵。我国自70年代中期，华东师范大学生化 教研室和天厨味精厂等单位协作，首先采用啤酒酵母作酶促生物发酵，稍后又进行了化学 合成的探索，并在上海华山医院、上海市第一人民医院、新华医院等脑外科和神经内科进行 约二年期的临床应用。目前，胞二磷胆碱已作为脑外科、神经内科以及不同类型的老年痴呆 症用药。因此，对它的需求量很大，目前国内市场已达60吨上下，且出口量也与日倶增。
[0004] 现行的胞二磷胆碱生产方法多由多种微生物参与或者所使用底物价格昂贵，成本 高，且较难以控制，本发明采用单一菌株进行发酵，目的在于提供作为用于药品胞二磷胆碱 的更为高效经济的制造方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种可在大肠杆菌中高效表达酵母磷酸胆碱转胞苷酰酶 (CCT)及大肠杆菌嘧啶代谢途径中的乳清苷酸焦磷酸化酶(pyrE)、乳清苷酸脱羧酶(pyrF)、 尿甘酸激酶(pyrH)、核苷二磷酸激酶(NDK)和CTP连接酶(pyrG)，利用氯化铵、乳清酸和磷酸 胆碱基质进行反应，生成胞苷二磷酸胆碱的方法。
[0006] 以下详细说明本发明：
[0007]本发明所使用的工程菌为单一菌株，同时具有酵母磷酸胆碱转胞苷酰酶(CCT)及 大肠杆菌嘧啶代谢途径中的乳清苷酸焦磷酸化酶(pyrE)、乳清苷酸脱羧酶(pyrF)、尿甘酸 激酶(pyrH)、核苷二磷酸激酶(NDK)和CTP连接酶(pyrG)活性。
[0008] 把分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌的种子液接种到培养基体系 中培养48~72小时，所述分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌的种子液的加入 体积为培养基体系体积的5%~10%;期间补充适量的葡萄糖、蛋白胨以及酵母提取物，发 酵完成后发酵液离心收集菌体。
[0009] 取上述菌体悬浮在磷酸缓冲液中用超声波或匀浆仪破碎，获得破碎液，在上述破 碎液中加入铵盐进行盐析，获得饱和度为10 %~50 %盐析液，再将上述盐析液固液分离，得 胞苷磷酸转移酶清液，其中，所述菌体与所述磷酸缓冲液的悬浮比例为1:4~1:10。
[0010]培养本发明微生物的培养基，所述培养基体系中含有蛋白胨20~30g/L，酵母提取 物10~20g/L，葡萄糖5~8g/L，无机盐8~15g/L，余量为纯化水，工程菌发酵发酵过程中，期 间补充的葡萄糖的量为培养基体系中含有的葡萄糖的量的10-15倍，补充的蛋白胨的量为 为培养基体系中含有的蛋白胨的量的50-80%，补充的酵母提取物的量为为培养基体系中 含有的酵母提取物的量的50-80%。
[0011]无机盐，优选地，胞磷胆碱钠的合成的步骤中，固定化胞苷磷酸转移酶含量为20~30g/L，三憐酸胞昔二纳为40~60mmol/L;憐酸胆喊120~240mmol/L;乙酸儀20~30mmol/L; 反应温度30~40°C; pH值为6 · 5~8 · 0。
[0012]培养最适温度为25~37°C，培养中培养基的pH值最好维持在中性6.5~8,培养时 间是6~24小时。
【附图说明】
[0013]附图1为质粒构建流程图；
[0014]附图2为胞磷胆碱钠标准品的IR图谱；
[0015]附图3为制得的胞磷胆碱钠的IR图谱；
[0016]附图4为制得的胞磷胆碱钠的UV图谱；
[0017]附图5为制得的胞磷胆碱钠的1H-NMR图谱；
[0018]附图6为制得的胞磷胆碱钠的13C-NMR图谱；
[0019] 附图7为制得的胞磷胆碱钠的质谱图。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
[0021] 实施例1
[0022] cct和pyrG基因表达载体构建
[0023] 根据已知大肠杆菌K12 MG1655 pyrG基因核酸序列和酿酒酵母cct基因核酸序列， 分别以大肠杆菌和酿酒酵母染色体作为模板，扩增出全长cct基因和pyrG基因。
[0024]采用常规细菌和酵母菌DNA提取方法分别提取了购自德国的原始大肠杆菌菌株DH5a和酿酒酵母菌株ATCC 26786/26787(DSM 4266/4267)的基因组DNA。
[0025]扩增使用的是保真性较好的pfu酶，加A尾后连接于pUC19-T vector，挑取阳性克 隆送交测序公司。
[0026] ①质粒pUCG的构建
[0027]将连接于pUC19_T vector上的pyrG基因从载体上酶切下来，使用的限制性内切酶 为Sma I和BamH I，同时载体pUC18使用限制性内切酶Nru I和BamH I进行酶切，将载体酶切 产物回收后，与回收的pyrG基因片段进行酶连反应，通过Sma I和BamH I等限制性酶消化， 进行分析，确认片段已经连接成功。最终获得质粒pUCG，pyrG基因此时是由lacZ启动子诱导 表达的。
[0028] ②质粒pUC-CCT的构建
[0029]将连接于PUC19-T vector上的cct基因从载体上酶切下来，使用的平末端限制性 内切酶为DraI，同样，pUC18使用的为平末端酶SmaI，将载体酶切回收后，与cct基因进行 酶连反应，先PCR扩增验证，再通过SmaI等限制性酶消化，进行分析，确认片段已经连接成 功。
[0030] ③质粒pUCG-CCT的构建
[0031] 通过PCR扩增，先将带有启动子的cct基因连接于pUC19-T vector上，测序确认序 列，用Nde I酶切下目的片段，进行琼脂糖电泳，按照回收试剂盒操作说明回收DNA，溶解在 20yL TE中，于离心管内-20°C保存。与脱磷载体pUCG/Nde I的连接，取一个0.2mL PCR管，加 入7.5yL外源DNA片段，lyL pUCG脱磷酸化载体，lyL 10XT4 Ligation Buffer，0.5yL T4连 接酶，混勾后放置于16°C水浴过夜。将酶联产物转化至大肠杆菌菌株DH5a中，在含有l〇〇mg/ L的Amp的平板上挑取阳性克隆。酶切并PCR扩增以验证阳性克隆的正确性。
[0032 ] 大肠杆菌染色体上pyrE、pyrF、pyrH、ndk操纵元的构建
[0033] 从大肠杆菌K12MG1655染色体上分别扩增出？7也、？7冲、？7也、11(^基因，测序后， 通过EcoRI、SacI酶切位点将pyrE片段连接于质粒pUC18上，得到质粒pUCpyrE;再通过SacI、 Smal位点将pyrF片段连接到质粒pUCpyrE上，得到质粒pUC-pyrEF;接着将pyrH片段经由 Smal和Xbal位点连接到pUC-pyrEF上，得到质粒pUCpyrEFH;最后通过Xbal和Hindlll位点将 ndk片段连接到pUCpyrEFH上，获得在lac启动子后可诱导表达 操纵元的质粒pUCpyrEFHk，构建流程参照图1。
[0034] 带有KRT-Km-FRT元件的口7也47冲4}^!1、11(11^操纵元质粒的构建