专利名称：高纯度甘露聚糖肽的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种高纯度甘露聚糖肽的制备方法。
背景技术：
甘露聚糖肽是从a-溶血链球菌(Str印tococcus hemolyticus-a -Hemolysis) H,S-33号菌经深层发酵、分离提取的糖肽类物质。在哺乳动物体内 能提升外周白细胞，增强网状内皮系统吞噬功能，活化吞噬细胞及淋巴细胞， 诱导胸腺淋巴细胞产生活性物质，改善和增强机体免疫功能和应激能力。临床 上主要用于恶性肿瘤放、化疗中改善免疫功能低下的辅助治疗。
甘露聚糖肽是一种高分子生物聚合物，其聚合程度和链长的不同使得其分 子大小也不相同，通常a-溶血链球菌仏S-33号菌的发酵产物中，甘露聚糖肽 的重均分子量分布在1万至100万之间。研究表明，甘露聚糖肽的重均分子量 太小，其免疫活性较低，太大则作为外源性生物大分子异物，能引起机体产生 过敏等诸多不良反应。因此，作为药用甘露聚糖肽，国家药品标准规定甘露 聚糖肽原料药的重均分子量应为40000 90000，注射用甘露聚糖肽用的重均分 子量应为40000 65000。以此在确保疗效的前提下，保证其异常毒性、过敏试 验、细菌内毒素等指标符合规定，确保用药安全。
中国专利CN1172952C公开了一种"甘露聚糖肽组合物及其制备工艺和用 途"，在其说明书3 4页公开了甘露聚糖肽的制备方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种甘露聚糖肽产品纯度高的制备方法。
本发明高纯度甘露聚糖肽的制备方法包括如下步骤
(1) 制备发酵产物a-溶血链球菌仏S-33号菌的深层发酵液，经灭活、浓 縮、乙醇沉淀得到含有甘露聚糖肽的发酵产物；
(2) 提取及粗品的制备发酵产物加3 10倍量(W/V)的纯化水，在搅拌 下进行提取，然后用三氯乙酸调节pH1.5 3.5，静置、除去沉淀物， 清液在搅拌下加浓度90%以上乙醇至40% 80%乙醇浓度，静置，分离沉
淀；沉淀物加纯化水按步骤(2)反复溶解、沉淀，干燥得甘露聚糖肽 粗品；
(3) 大分子甘露聚糖肽的分离用截留10 30万分子量的滤膜滤除甘露聚 糖肽粗品中的大分子甘露聚糖肽，滤液用截留1 5万分子量的滤膜进 行浓缩处理，得甘露聚糖肽水溶液；
(4) 大分子甘露聚糖肽的水解将大分子甘露聚糖肽用溶菌酶、淀粉酶和纤 维素酶中任意一种或者用盐酸、磷酸、乙酸和氢氟酸中任意一种进行水 解。
上述步骤(4)中酶水解的步骤如下大分子甘露聚糖肽用5 20倍量(W/V) 的纯化水溶解，调整pH6.0 8.0，按500 100000U/g的量加入所述溶菌酶、淀 粉酶和纤维素酶中任意一种，20 6(TC保温4 20小时，加热至沸，冷却至室温， 调整pH2.0 3.0，滤过，得甘露聚糖肽水溶液。
上述步骤(4)中酸水解的步骤如下大分子甘露聚糖肽用5 20倍量(W/V) 辨度0.5 5%盐酸、磷酸、乙酸和氢氟酸中任意一种溶液溶解，加热60 105。C 并保温0.5 8小时，冷却，调整pH值中性，得甘露聚糖肽水溶液。
口服用甘露聚糖肽原料的精制，将上述步骤(3)和步骤(4)所得甘露聚糖 肽水溶液混合，过滤至清，取样测定重均分子量和分布宽度，合格者用浓度50 80%乙醇沉淀，静置、离心或滤过分离沉淀物，干燥得甘露聚糖肽原料；不合格 者，用超滤的方法去除小分子和大分子甘露聚糖肽，再用乙醇沉淀，静置、离心 或滤过分离沉淀物，干燥得口服用甘露聚糖肽原料。
注射用甘露聚糖肽原料的精制，将上述步骤(3)和步骤(4)所得甘露聚糖 肽水溶液混合，用5 20倍量(W/V)的蒸馏水溶解，按O. 1 5% (重量)的比 例加入活性炭，70 10(TC保温10 60分钟，冷却、滤过，清液用浓度50 80% 乙醇沉淀，静置、离心或滤过分离沉淀物，无水乙醇或丙酮脱水后干燥得注射用 甘露聚糖肽原料。
本发明是将a -溶血链球菌H,S-33号菌的深层发酵产物用纯化水在搅拌下 进行提取，用三氯乙酸沉除溶于水的蛋白杂质，经乙醇反复沉淀的方法得到甘 露聚糖肽粗品；粗品再用超滤的方法将符合与超过药用分子量标准规定的甘露 聚糖肽分离出来，大分子甘露聚糖肽部分经酶解或酸解后，与分子量符合规定 的甘露聚糖肽部分合并，再经活性炭吸附、乙醇沉淀、脱水千燥，得到符合药 用标准的甘露聚糖肽。经过上述超滤、水解步骤，本发明制得的甘露聚糖肽纯 度高，可达90 98%。
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。
具体实施例方式
实施例1
发酵产物的制备方法为现有技术，见中国专利CN1172952C说明书第3 4 页所公开的内容，即a -溶血链球菌H,S-33号菌的深层发酵液经过灭活、浓縮、 乙醇沉淀得到含有甘露聚糖肽的发酵产物。发酵产物1000g加10000ml的纯化 水，在搅拌下进行提取，然后用三氯乙酸调节pH2.0 2.5，静置、离心或滤过 除去沉淀物，清液在搅拌下加浓度95%乙醇至75%乙醇浓度，静置，离心或滤过 分离沉淀；沉淀物再加纯化水如上述步骤反复溶解、沉淀六次，干燥，得甘露 聚糖肽粗品115g;粗品加10倍量(W/V)的纯化水溶解，过滤除去不溶物，清 液用300000分子量的滤膜超滤大分子甘露聚糖肽，滤液用截留10000分子量的 滤膜进行浓縮处理。大分子甘露聚糖肽水溶液调整pH值7. 5 8. 0，加50000U/g 的溶菌酶100ml，混匀，40。C保温水解4小时，测定重均分子量在50000至80000 之间，加热煮沸10分钟，冷却，调节pH值3.0左右，过滤至清，与上述滤液 的浓縮液合并，加浓度95%乙醇至75%乙醇浓度，静置，离心分离沉淀，沉淀物 用无水乙醇、丙酮脱水后干燥即得口服用甘露聚糖肽原料。此法甘露聚糖肽得 量在92 98g，纯度达95%，按发酵产物计收率为9. 2 9. 8%，按粗制品计收率 为80 85%。
实施例2
发酵产物的制备同实施例1。发酵产物1000g加10000ml的纯化水，在搅拌 下进行提取，然后用三氯乙酸调节pH2.5 3.5，静置、离心或滤过除去沉淀物， 清液在搅拌下加浓度90%乙醇至80%乙醇浓度，静置，离心或滤过分离沉淀；沉 淀物再加纯化水如上述步骤反复溶解、沉淀六次，干燥，得甘露聚糖肽粗品115g; 粗品加10倍量(W/V)的纯化水溶解，过滤除去不溶物，清液用300000分子量 的滤膜超滤大分子甘露聚糖肽，滤液用截留10000分子量的滤膜进行浓縮处理。 大分子甘露聚糖肽水溶液调整pH值7. 5 8. 0，加5%盐酸使之盐酸浓度为1%， 加热6(TC，回流下水解40分钟，测定重均分子量在50000至80000之间，冷 却，用NaOH中和后与上述滤液的浓縮液合并，用20倍量(W/V)的蒸馏水溶解， 按重量5%的比例加入活性炭，10(TC保温60分钟，冷却、滤过，清液用浓度50% 乙醇沉淀，静置、离心或滤过分离沉淀物，无水乙醇或丙酮脱水后干燥得注射 用甘露聚糖肽原料。此法甘露聚糖肽得量在80 92g，纯度达96%，按发酵产物 计收率为8. 0 9. 2%，按粗制品计收率为69. 5 80%。
权利要求
1.一种高纯度甘露聚糖肽的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤(1)制备发酵产物α-溶血链球菌H1S-33号菌的深层发酵液，经灭活、浓缩、乙醇沉淀得到含有甘露聚糖肽的发酵产物；(2)提取及粗品的制备发酵产物加3～10倍量(W/V)的纯化水，在搅拌下进行提取，然后用三氯乙酸调节pH1.5～3.5，静置、除去沉淀物，清液在搅拌下加浓度90％以上乙醇至40％～80％乙醇浓度，静置，分离沉淀；沉淀物加纯化水按步骤(2)反复溶解、沉淀，干燥得甘露聚糖肽粗品；(3)大分子甘露聚糖肽的分离用截留10～30万分子量的滤膜滤除甘露聚糖肽粗品中的大分子甘露聚糖肽，滤液用截留1～5万分子量的滤膜进行浓缩处理，得甘露聚糖肽水溶液；(4)大分子甘露聚糖肽的水解将大分子甘露聚糖肽用溶菌酶、淀粉酶和纤维素酶中任意一种或者用盐酸、磷酸、乙酸和氢氟酸中任意一种进行水解。
2. 根据权利要求1所述一种高纯度甘露聚糖肽的制备方法，其特征在于,所述步 骤(4)中酶水解的步骤如下大分子甘露聚糖肽用5 20倍量(W/V)的纯 化水溶解，调整pH6.0 8.0，按500 100000U/g的量加入所述溶菌酶、淀粉'酶和纤维素酶中任意一种，20 6(TC保温4 20小时，加热至沸，冷却至室 温，调整pH2.0 3.0，滤过，得甘露聚糖肽水溶液。
3. 根据权利要求1所述一种高纯度甘露聚糖肽的制备方法，其特征在于，所述步 骤(4)中酸水解的步骤如下大分子甘露聚糖肽用5 20倍量(W/V)浓度 0.5 5%盐酸、磷酸、乙酸和氢氟酸中任意一种溶液溶解，加热60 105i:并 保温0.5 8小时，冷却，调整pH值中性，得甘露聚糖肽水溶液。
4. 根据权利要求1至3任意所述一种高纯度甘露聚糖肽的制备方法，其特征在 于，将步骤(3)和步骤(4)所得甘露聚糖肽水溶液混合，过滤至清，用浓度 50 80%乙醇沉淀，静置、分离沉淀物，干燥。
5. 根据权利要求1至3任意所述一种高纯度甘露聚糖肽的制备方法，其特征在-于，将步骤(3)和步骤(4)所得甘露聚糖肽水溶液混合，用5 20倍量(W/V) 的蒸馏水溶解，按O. 1 5%(重量)的比例加入活性炭，70 10(TC保温10 60分钟，冷却、滤过，清液用浓度50 80%乙醇沉淀，静置、分离沉淀物， 干燥。
全文摘要
本发明公开了一种高纯度甘露聚糖肽的制备方法。该方法包括如下步骤制备发酵产物，提取及粗品的制备，大分子甘露聚糖肽的分离，大分子甘露聚糖肽的水解。本发明经过超滤、水解步骤，制备的甘露聚糖肽纯度高，可达90～98％。
文档编号C12P21/02GK101186941SQ20071009310
公开日2008年5月28日 申请日期2007年12月4日 优先权日2007年12月4日
发明者曾康芬, 丽 李, 泉 江, 王君山, 琳 艾, 郭才旺, 爽 陈, 马宏伟 申请人:成都川抗万乐药业有限公司