专利名称：用发根农杆菌遗传转化粘毛黄芩获得产黄芩苷的毛状根的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学、生理学、育种学以及基因工程等领域，涉及一种利用转 基因技术获得产黄芩苷的粘毛黄芩毛状根的方法，具体涉及发根农杆菌遗传转化粘毛 黄芩并获得产黄芩苷的粘毛黄芩毛状根的具体程序。本发明还提供利用基因工程技术 获得的产黄芩苷的粘毛黄萃毛状根及其培养的子代。
背景技术：
植物次生代谢产物具有极其复杂的化学结构，至今仍没有找到有效的或经济的合 成方法。相对于常规细胞培养，毛状根培养系统具有生长快速、不需外源植物激素、
合成次生代谢物质能力强而且稳定、向培养液释放部分代谢产物等优点。由于Ri质粒 转化的毛状根生长快，易于培养，有效成分高，具有表达完整的代谢通路，为药用植 物次生代谢产物的工业化生产提供了广阔前景。
目前，虽然国内外采用发根农杆菌遗传转化药用植物获得生产次生代谢产物的毛 状根的相关研究较多，但对遗传转化粘毛黄芩获得产黄芩苷毛状根的研究仍是空白。 粘毛黄芩属于唇形科黄芩属多年生药用草本植物。该属植物约300多种，世界广布， 我国有100种以上，可作为黄芩药用者约有7种左右，粘毛黄芩就是其中的一种。该 植物主要药用成分为黄零苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素等黄酮类化合物，现代药 理学证实其具有清热解毒、止血安胎、抗菌消炎、保肝利胆、降压脱敏、防晒美白等 作用。随着国际上对黄芩苷等研究的持续升温和认识的逐步深入，认为黄芩苷在清除 氧自由基、减轻组织的缺血再灌注损伤、调节免疫、促进细胞凋亡以及抗肿瘤和HIV 等多方面均有作用，具有重要的药用价值和开发利用前景。然而目前获得粘毛黄芩的 主要技术是人工栽培，但存在生产周期长、成活率低、农药残留超标和有效成分较低 等弊端，使得该方式商业前景尚不明朗。
发明内容
本发明的第一 目的就是提供一种转基因技术遗传转化粘毛黄芩获得产黄芩苷毛状 根的方法，该方法将发根农杆菌Ri质粒的T-DNA导入粘毛黄芩中，获得粘毛黄芩毛状根；
本发明的另一方面，还提供了一种用上述方法转化的宿主细胞，这种经转化的宿 主细胞发育为毛状根。在实例中该宿主细胞是粘毛黄芩 本发明的技术方案如下
一种获得产黄芩苷粘毛黄芩毛状根的方法和利用该方法获得的产黄芩苷的粘毛黄 芩毛状根，该方法步骤如下-
(1) 采用任何可能的手段获得无菌的粘毛黄芩；
(2) 采用任何转基因方法转移发根农杆菌的Ri质粒的T-DNA到粘毛黄吝细胞、 组织、器官、植株中；包括以下步骤
A、 活化发根农杆菌；
B、 发根农杆菌浸染粘毛黄芩外植体；
C、 发根农杆菌与粘毛黄芩外植体的共培养，步骤如下
I、 将侵染后的粘毛黄芩外植体接种在MS+AS 100/anoI丄"固体培养基上； II 、置于温度为25°C ± 1. (TC恒温暗培养1 5天
D、 外植体的除菌培养；
(3) 在特定的条件下筛选和鉴定毛状根，方法如下
I 、提取粘毛黄芩毛状根DNA
II、 获得含ro/B和ra/C引物的PCR反应体系；
III、 PCR反应扩增毛状根特有基因ro氾和ra/C;
IV、 电泳检测目标条带；
(4) 在适合的条件下培养粘毛黄芩毛状根，用于生产黄芩苷。 用上述方法获得的生命体，它是可生产黄芩苷的粘毛黄芩毛状根。 在本发明中，术语"生命体"指粘毛黄芩的细胞、组织、器官、植株。 在本发明中，术语"任何转基因方法"包括发根农杆菌Ri质粒介导遗传转化、基
因枪法介导的遗传转化、花粉管通道介导基因转化、生殖细胞浸泡法介导基因转化。 在本发明中，术语"在特定的条件下筛选和鉴定转化子"是指用在离体培养的条
件下根据毛状根特殊的形态学特征初步鉴定转化子；可以使用PCR、 Southern杂交、
Northern杂交和Western印迹等方法来鉴定转化子。
在本发明中，术语"在适合的条件下培养粘毛黄芩毛状根"是指对经过鉴定的粘
毛黄芩毛状根离体培养，并检测黄芩苷的含量，筛选黄芩苷含量提高的优良转化子进
行培养，获得其后代。
在本发明中，利用转基因技术，将发根农杆菌Ri质粒的T-DNA导入粘毛黄芩细胞 获得转化毛状根，通过筛选优良无性系，获得黄芩苷及其相关黄酮类化合物含量相对 较高而稳定的毛状根无性系，为黄芩苷的生产提供一种新型优质的可持续使用的药源。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件，例如《分子克隆》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例l
粘毛黄芩无菌外植体的获得
方法一利用外植体建立粘毛黄芩无菌外植体
采集粘毛黄芩新萌发出来的幼苗叶片，流水冲洗l小时；然后用75% (V/V)乙醇 浸泡45秒，无菌水冲洗3次；再用0.1% (M/V)升汞(HgCl2)溶液浸泡9分钟，无菌水 冲洗5次；然后接种在添加无菌丛生芽诱导培养基中(培养基盛于150mL三角瓶中，于 12rC灭菌20分钟)，该培养基配方为MS基本培养基，30g/L蔗糖调节培养基，pH值 为5.8，再添加8.5g丄"的琼脂粉。在光照培养箱中培养粘毛黄芩的叶片，培养条件为 25°C， 12小时光照，光照强度为55^1!101.111-2.3"。 17天后，即可获得无菌的粘毛黄芩无 菌幼苗，等到幼茎长到6cm长时可用于遗传转化。
方法二利用粘毛黄芩种子在无菌条件下萌发获得无菌外植体 选取粘毛黄芩饱满种子在清水中浸泡10小时，然后流水冲洗5小时，75%(V/V) 乙醇浸泡30秒，0.1%HgCl2 (M/V)浸泡12分钟，无菌水洗涤5次，接种于MS培 养基上，25t:的恒温培养箱中暗培养。14天后，种子开始萌发，然后将其置于温度为 25°C，光周期为12小时，光强为2000Lx的恒温培养箱中，22天后长成茁壮的幼苗， 切取茎段做转化外植体用。
实施例2
发根农杆菌遗传转化粘毛黄芩获得毛状根
1、发根农杆菌C58C1。使用前自超低温冰箱取出，接种于50mlYEB液体培养基中(添加利福平终浓度为40mg七'1)， 28'C， 200rpm振荡培养两次，复苏菌体；
2、 第二次活化培养结束两小时前加入乙酰丁香酮，使其终浓度达到lOOpmoH/1 也即菌液OD6oo达0.4时，加入乙酰丁香酮，继续28。C， 200rpm振荡培养，菌液00600 达0.6时，可用于转化；
3、 室温下4000rpm离心10分钟，弃上清，菌体用等体积MS液体培养基(含 lOOpmol'L-1乙酰丁香酮)悬浮，在28。C, 200rp振荡培养，使菌液浓度达到的OD6。^0.2 左右，成为转化液，此时可用于粘毛黄芩的遗传转化；1、 2、 3个步骤称为活化发根农 杆菌；
4、 取无菌粘毛黄芩幼嫩真叶、幼茎段、子叶和愈伤组织等植物不同部位，将茎切 成lcm小段，或将叶片切成2ci^左右，用无菌解剖针戳一些圆形伤口，放入上述转 化液中，浸染15分钟后取出，用无菌卫生纸吸干，接种于添加100/mioH/1乙酰丁香 酮的MS固体培养基中共培养2 3天，培养条件为25°C，无光照。该步骤称发根农 杆菌与粘毛黄芩的共培养。
5、 共培养结束后，在无菌吸水纸上吸干外植体上多余水分，转移至无植物生长调 节物的MS固体除菌培养基(添加500 mg，L"头孢菌素以达到除菌的目的)中培养， 培养条件为25°C,黑暗条件下培养。9天后，在粘毛黄芩受伤的部位开始出现毛状根。 该步骤称为粘毛黄芩的除菌培养。
6、 外植体每隔5天转入新鲜的同样的培养基中，待转化外植体上诱导出的毛状根 长到5cm左右时，分别切下单条的毛状根，接种在无植物生长调节物的1/2 MS固体培 养基上(添加500 mg七"头孢菌素以达到除菌的目的)继代培养；在无植物生长调节 物的1/2 MS固体培养基上生长的粘毛黄芩毛状根表现出毛状根特有的形态学特征生 长十分迅速、分枝很多、生长失去向地性。以后每15 20天继代培养一次，继代5次 后，农杆菌可以去除杆菌；然后仅在1/2MS固体培养基上继代培养方可。该步骤为粘 毛黄芩毛状根的获得与继代培养。
实施例3
粘毛黄芩毛状根的分子检测
1、粘毛黄芩毛状根基因组DNA的提取，方法如下
1)取200mg液体培养两周的毛状根，过滤后用10mL蒸馏水洗涤，充分吸干，液 氮速冻，研磨成粉。2) 1.5 mL Eppendorf管中，力口 500 //L抽提buffer (3%巯基乙醇)，充分震荡65。C 水浴50分钟，每5分钟颠倒混匀。
3) 4°C、 12，000rpm，离心10分钟。
4) 吸上清，加500 ^L酚氯仿异戊醇(25:24:1)，轻轻混匀，静置5分钟钟
至分层。
5) 室温，12，000rpm，离心10分钟。
6) 吸上清约350;/L，加等体积的氯仿异戊醇(24:1)，轻轻混匀，静置5分钟
至分层。
7) 室温，12,000 rpm，离心10分钟。
8) 吸上清约250;/L，加2倍体积的无水乙醇(一2(TC预冷)，充分混勾，室温放 置10分钟见有絮状DNA析出。
9) 室温，12,000 rpm，离心10分钟。
10) 弃上清，沉淀用75%的乙醇洗2次，稍离心，吸净残余乙醇，室温放置10分 钟，使乙醇挥发完全。
11) 力B lpLRNAase， 50//LTE，混匀，37。C水浴30—40分钟。
12) 加40/zL氯仿，轻轻混匀，静置5分钟至分层。 14)室温，12，000rpm，离心10分钟。
13) 吸取上清(约35 //L)到新Eppendorf管中，一2(TC保存，用于PCR检测。 抽提缓冲液配方如下
100mM Tris-HCl(pH8.0) 2.5%(V/V) 巯基乙醇 500mM NaCl 20mM EDTA 1.5%(W/V) SDS
2、粘毛黄芩毛状根中ro氾和w/C基因的PCR检测
诱发并维持毛状根形态的和ro/C基因是来源于发根农杆菌的Ri质粒上。基 因检测的PCR引物ra氾(423 bp)的引物为/ra氾(5，-GCT CTT GCA GTG CTA GAT ITS'), ro氾(5，-GAA GGT GCA AGC TAC CTC TC- 3，)； ro/C (626 bp)的引物为/ra/C (5，-TAA CAT GGC TGA AGA CGA CC- 3， )， m>/C (5'陽AAA CTT GCA CTC GCC ATG CC-
3，)。
反应体系均为(25 ;/L): ddH20 18 //L, 10 x PCRbuffer 2.5 〃L， 25腿ol/L MgCL2 2.0
//L， 10讓o1.1/1 dNTP mix 0.25;/L， 10 mmol/L primer 1 0.25 //L, 10 mmol/L primer 2 0.25 ;/L，
r叫DNApoLymerase 0.25 〃L (1.25 U)， Template基因组DNA 1.5 //L。
PCR反应程序94。C 5min—35循环(94°C for 40 sec—56°C for 40 sec—72。C
forlmin)—72°C 8 min。阳性对照为相应的工程菌，粘毛黄芩的天然叶片作为阴性对照。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和紫外检测。的扩增条带大小为423 bp， w/c为626bp。
实施例4
粘毛黄芩毛状根中黄芩苷含量和野生根中的含量比较
1、 黄芩苷吸收峰测定和标准曲线的制作
精密称取2mg黄芩苷标准对照品，用200mL75X (V/V)乙醇溶解，配成浓度 为1000^g/mL，用乙醇溶液作空白对照，在200 500nm波长下测黄芩苷的吸光度值， 得到最大吸收波长。然后讲母液分别梯度稀释成200、 100、 80、 60、 40、 20/^mL"。 分别往试管中加各梯度浓度标准溶液1 mL，加75X乙醇至5mL,分别加入0.3mL5 %亚硝酸钠，0.3mL 10%硝酸铝溶液，然后以75%乙醇定容至10mL，混匀，放置20 分钟，于278 nm波长处，用lcm比色杯测其吸光值，黄芩苷含量(//g)为横坐标， 吸光值(A)为纵坐标，得对照品的线性回归方程和标准曲线。
2、 粘毛黄芩中黄芩苷含量的测定
将培养30d的单克隆毛状根洗净，用吸水纸吸干水分，称鲜重后冷冻千燥30h至恒 重，研磨成粉，称取100mg干粉加入10mL甲醇超声破碎20min，过滤，再提取一次， 合并滤液，将甲醇提取液浓縮蒸干，用甲醇定容至10mL， 一2(TC保存，作为供试样品 溶液。三年生自然根打粉后，称取150mg，提取方法同上。
精密称取2mg黄芩苷标准对照品，用色谱纯甲醇溶解过滤，配成浓度为1000 pg/mL，分别梯度稀释成280、 140、 70、 35、 17.5 pg'mU1。在相应的色谱条件下进样， 且每一浓度进样三次，记录图谱及色谱参数，分别以峰面积对进样量回归分析，得对 照品的线性回归方程和标准曲线。结果为:粘毛黄芩毛状根中黄芩苷含量占干重3.58%, 与3年生野生药材黄芩黄苓苷的含量(7.62%)相比，约为药材黄芩0.47倍，但从单 位时间黄芩苷生成量来看，毛状根系是药材黄芩的17.14倍，可见粘毛黄芩毛状根培养 技术是获取黄芩苷的高效策略。
权利要求
1.一种获得产黄芩苷的粘毛黄芩毛状根的方法，特征在于采用转基因技术，用发根农杆菌遗传转化粘毛黄芩的器官，其步骤如下(1)粘毛黄芩无菌外植体的获得；(2)采用转基因方法转移发根农杆菌的Ri质粒的T-DNA到粘毛黄芩细胞、组织、器官或植株中；其中转基因方法选择发根农杆菌Ri质粒介导遗传转化、基因枪法介导的遗传转化、花粉管通道介导基因转化或生殖细胞浸泡法介导基因转化；包括以下步骤A、活化发根农杆菌；B、发根农杆菌浸染粘毛黄芩外植体；C、发根农杆菌与粘毛黄芩外植体的共培养，步骤如下I、将侵染后的粘毛黄芩外植体接种在MS+AS 100μmol·L-1固体培养基上；II、置于温度为25℃±1.0℃恒温暗培养1～5天D、外植体的除菌培养；(3)粘毛黄芩毛状根的获得与继代培养；(4)粘毛黄芩毛状根的分子检测，方法如下I、提取粘毛黄芩毛状根DNAII、获得含rolB和rolC引物的PCR反应体系；III、PCR反应扩增毛状根特有基因rolB和rolC；IV、电泳检测目标条带；(5)粘毛黄芩毛状根中黄芩苷的含量检测。
2. 用权利要求1所述方法获得产黄芩苷的粘毛黄芩的毛状根，其特征在于其基因 组中整合了来自于Ri质粒的诱导毛状根的基因。
3. 用权利要求1所述方法获得粘毛黄芩毛状根的继代培养毛状根。
全文摘要
本发明提供了一种利用基因工程技术遗传转化粘毛黄芩，获得生产黄芩苷的粘毛黄芩的毛状根的方法。涉及包含发根农杆菌遗传转化粘毛黄芩的方法，遗传转化获得可生产黄芩苷的粘毛黄芩毛状根。其过程是用发根农杆菌遗传转化粘毛黄芩，获得了粘毛黄芩毛状根，经分子检测确为遗传转化的毛状根，HPLC检测表明遗传转化获得的粘毛黄芩毛状根能够生产黄芩苷。本方法可以为黄芩苷的生产提供一种新型可持续的新型药源。
文档编号C12N15/82GK101182542SQ20071009305
公开日2008年5月21日 申请日期2007年11月27日 优先权日2007年11月27日
发明者敏 孙, 王淑芳, 桅 雷 申请人:西南大学