控制植物分枝的K599-orf3基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种从发根农杆菌K599中获得控制植物分枝的K599-orf3基因，及其在控制农作物或观赏植物分枝中的应用。所述K599-orf3基因核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，该基因开放阅读框全长1479bp，编码492个氨基酸（SEQ?ID?No.2）。构建含该基因的植物转基因表达载体，并通过转基因技术将该基因转入植物细胞并表达，能有效增加植物的分枝；因此，将该基因转入农作物和园艺植物中，能分别提高其生物学产量和观赏价值，具有很好的应用潜力。
【专利说明】控制植物分枝的K599-orf3基因及其应用
(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及从发根农杆菌K599中获得控制植物分枝的K599-orf3基因及其应用。
(二)【背景技术】
[0002]植物的分枝是植物的重要的形态特征。植物分枝与其适应环境、生存竞争能力及产量形成密切相关，也决定着植物的株型(陈彩艳，邹军煌，张淑英，朱立煌.独脚金内酯能抑制植物的分枝并介导植物与纵枝真菌及寄生植物间的相互作用.中国科学C辑:生命科学，2009，39:525-533。Wang YH,Li JY.Branching in rice.Curr Opin Plant Biol,2011,14:94-99)。
(三)
【发明内容】
[0003]本发明目的是提供从发根农杆菌K599中获得控制植物分枝的K599_orf3基因，及其在控制农作物或观赏植物分枝中的应用。
[0004]本发明采用的技术方案是:
[0005]控制植物分枝的K599_orf3基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。该基因开放阅读框全长1479bp，编码492个氨基酸(SEQ ID N0.2)。
[0006]本发明还涉及 所述的基因在控制农作物或园艺植物分枝中的应用。
[0007]具体的所述应用为:构建含有所述K599_orf3基因的表达载体，以农杆菌介导法将其导入农作物或园艺植物中，获得分枝增加的转基因农作物或园艺植物。
[0008]本发明的有益效果主要体现在:本发明提供了从发根农杆菌K599中获得控制植物分枝的K599-orf3基因，构建含该基因的植物转基因表达载体，并通过转基因技术将该基因转入植物细胞并表达，能有效增加植物的分枝；因此，将该基因转入农作物和园艺植物中，能分别提高其生物学产量和观赏价值，具有很好的应用潜力。
(四)【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为扩增orf3的PCR产物电泳图。M:DS?2000marker ；1:利用引物orf3A_Pl、orf3A-P2扩增的PCR产物。
[0010]图2为重组质粒用BamH I和Sma I酶切结果。M:DS?2000marker ;1_5:重组质粒被BamH I和Sma I酶切。
[0011]图3为植物转基因表达载体pRI101-AN-orf3的构建示意图。
[0012]图4为植物转基因表达载体pRI101-AN-orf3酶切鉴定。M:标准DNA分子量，I:pRI101-AN，2:pMD19-orf3,3:pRI101-AN_orf3。
[0013]图5为转K599_orf3基因烟草植株再生过程。A:叶片切块；B:再生芽；C:再生植株；D移栽到盆钵中成活的小苗植株；E:正常开花的植株。
[0014]图6为利用orf3基因引物对烟草再生植株进行普通PCR扩增的结果。M:DS?2000DNA marker ；1:质粒 pRI101-AN_orf3 ；2:非转基因烟草；3_17:orf3 基因烟草再生植株。
[0015]图7为RT-PCR鉴定结果，其中A为actin扩增出的条带约为600bp，B为orf3基因扩增出的条带约为1479bp。M:DS?2000marker ；1:非转基因烟草；2_6:转基因烟草。
[0016]图8为转K599_orf8基因烟草和非转基因烟草的比较。左侧:非转基因；右侧:转基因。
[0017]图9为转K599_orf3基因拟南芥的筛选过程。A:拟南芥幼苗的纯性培养；B:拟南芥转基因种子萌发幼苗的筛选(绝大多数幼苗被抗生素杀死，子叶变黄发白；部分转基因幼苗的子叶保持绿色，继续生长);C:拟南芥转化阳性植株的后代在抗生素培养基上的筛选，幼苗出现遗传分离比(绿苗:黄白苗=3:1)。
[0018]图10为转K599_orf3基因的拟南芥植株形态特征。A:非转基因；B:转基因；C --左侧为非转基因，右侧为转基因。
(五)【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0020]实施例1:
[0021]一、orf3基因的克隆
[0022]1、实验材料
[0023]黄瓜喊型发根农杆菌K599由本实验室保存(the National Collection of PlantPathogenic Bacteria in U K 购买获取)。
[0024]2、发根农杆菌K599所含质粒pRi2659的提取
[0025]利用Sangon公司质粒小量快速抽提试剂盒提取。具体步骤如下:(I)在28°C,200r/min,含有km (50mg/L)和str (50mg/L)LB液体培养基中过夜培养野生型发根农杆菌K599。(2)取1.5-4.5ml菌液，9，000r/min离心30秒，尽可能倒干上清液，收集菌体。(3)用250微升溶液SI重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。(4)加250微升溶液S2，温和地上下翻转4-7次，使菌体充分裂解，室温放置4分钟。(5)加350微升溶液S3，立即温和地上下翻转4-7次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀。冰上静置3-5分钟，13，000r/min离心10分钟，小心取上清。(6)将上一步所得上清加入吸附柱中(吸附住放入收集管中)，13，OOOr/min离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。(7)加入500微升去蛋白液PE, 13，000r/min离心30-60秒，弃废液。(8)加入700微升漂洗液PW (已加入无水乙醇)，12，000r/min离心30秒，弃废液。(9)加入500微升漂洗液PW (已加入无水乙醇)，12，000r/min离心30秒，弃废液。(10)将吸附住放回空收集管中，13，OOOr/min离心2分钟，尽量除去漂洗液。(11)取出吸附住，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50微升ddH20，室温放置2分钟，12，000r/min离心1分钟，即得到质粒，放于_20°C冰箱备用。
[0026]3、PCR 扩增
[0027]根据异黄瓜碱型发根农杆菌Ri质粒pRil724 (GenBank登陆号NC_002575)以及农杆碱型发根农杆菌Ri质粒pRiA4 (GenBank登陆号K03313),通过blast比较,根据保守序列设计引物。引物由上海Sangon公司合成。并且在引物上加上限制性核酸内切酶Sma I(上游WPBamH I (下游)的位点序列。引物序列如下:orf3A_Pl: 5’-GACCCGGGACAATGTTTGCGTGCAAGG-3’，orf3A-P2:5’ -GCGGATCCTGCTTCTGTTTTGTATCGTGCT-3’。
[0028]PCR扩增反应体系见下表1。用美国ABI公司PE9700型DNA扩增仪进行扩增。PCR反应程序如下:94°C 5min使模板充分变性，然后进入扩增循环，每次循环包括:94°C 45s保持模板变性，然后55°C 45s复性，72°C 90s延伸，完成一个循环，重复30-35次，而后72°C IOmin使DNA延伸完整，最后4°C条件下保存以备用。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳30_60min，溴化乙锭(EtBt)染色，用美国BIO-RAD凝胶成像系统观察并拍照。
[0029]表1:PCR反应体系
【权利要求】
1.控制植物分枝的K599-orf3基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.如权利要求1所述的基因在控制农作物或园艺植物分枝中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为:构建含有所述K599-orf3基因的表达载体，以农杆菌介导法将其导入农作物或园艺植物中，获得分枝增加的转基因农作物或园艺植物。
【文档编号】C12N15/84GK103898129SQ201410064202
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年2月25日 优先权日:2014年2月25日
【发明者】向太和, 王沙沙, 王嫚, 宋亚玲, 钱永生, 孙扬 申请人:杭州师范大学