专利名称：一种利用发根农杆菌遗传转化高山红景天建立毛状根培养体系生产红景天甙的方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域。具体是一种利用发根农杆菌遗 传转化高山红景天建立毛状根培养体系生产红景天甙的方法。
技术背景高山红景天(Z / oc7o7a sac/ a2i/ e/ sis yl万or)又名库页纟工景 天，为景天科红景天属(欣o力'o7a Z.)多年生双子叶草本植物。 是珍稀药用植物之一，中医中具有"固本扶正"之功效，具有"适 应原"的作用。还具有抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗微波辐射等显 著功能，而且具有延缓肌体衰老、防止老年疾病等功效。由于高山 红景天在工业方面的开发，野生植物大量被采挖，资源日趋枯竭。 目前，当地政府己严禁采挖。自80年代初期，就开始人工引种栽培 的研究，由于高山红景天适应高寒、干燥、高海拔的生长环境，不 耐高温、潮湿气候以及易发病等原因，大面积栽培仍没获得成功。 高山红景天主要药用成分为红景天甙。明海泉等报道利用其甙元醇 进行糖基化反应人工合成红景天甙，但反应过程复杂，收率低。高 山红景天细胞培养为红景天甙的生产提供了一条途径，但产量很低， 培养细胞中的红景天甙含量至多只能达到野生植株的水平。许建峰 等利用细胞培养，用于高山红景天次生代谢物生产研究，通过外界 因子、前体物、诱导子以及细胞发酵的动力学研究，可使细胞培养 密度最大达到18 g DW/L，培养物中的红景天甙产量最大达到1980 mg/L。相当于野生高山红景天中红景天甙的含量，况且，由于激素 的添加不但增加成本，且影响红景天甙的品质。由于毛状根具有生长速度快、分枝多、弱向地性，处于器官化 水平，激素自养，生理生化、遗传特征稳定，有稳定的次生代谢物 合成能力。大量培养毛状根替代野生资源，促进中药现代化发展。 因此建立高山红景天毛状根培养系统大量培养具有重要意义。自1997年Ackermann首先用发根农杆菌转化高等植物以来，迄 今已有100多种植物建立了培养系统。并且利用其进行次生代谢物 生产。中药有效成分大多在根部。而Ri质粒诱导产生的毛状根具有 根的特性，且具有生长速度快、激素自养、分化程度较高，以及遗 传性状相对地稳定等优点，因此，较细胞培养更有利于次生代谢物 的大量生产。 发明内容本发明的目的在于通过生物技术手段大量生产高山红景天毛状 根，利用毛状根大量培养生产高山红景天甙，用以替代野生资源，填补中药缺口；本发明利用发根农杆菌遗传转化高山红景天获得毛 状根，利用发酵罐大量培养毛状根用以生产红景天甙。 本^明是通过以下技术方案实现的.-以高山红景天(Wc^o/a sac/m/Zwew^ ASor)为夕卜植体，禾!j 用发根农杆菌(Jgro6a"eWww r/z/zogew", ^r)进行遗传转化诱导产 生毛状根(hairy root)，通过培养条件(pH值、温度、侵染时间、 共培养时间和乙酰丁香酮添加)优化提高毛状根诱导率。毛状根经 发酵罐培养大量生产毛状根，通过碳源、氮源、光照、温度、pH值、 诱导子、前体物质和培养液的优化，提高高山红景天毛状根红景天 甙的含量。通过毛状根红景天甙的分离提取过程，生产红景天甙。
该方法的具体步骤如下1、 外植体的制备将高山红景天的无菌种子置1/2MS培养基萌 发，取3天苗龄的绿色子叶(留2mm左右的子叶柄)置于MS+0.5mg/L NAA+3.0mg/L 6-BA培养基上25。C继代培养。以在MS+1.2mg/L 2， 4-D+ 2.4mg/L 6-BA培养基中暗培养2-4天的叶片、茎段和子叶节为 外植体；2、 发根农杆菌培养将发根农杆菌R1000或LBA9402或R1601 或ATCC15834或A4 (菌种均由法国园艺中心提供)在YEB固体培养基 上活化，挑取单菌落，接种在LB液体培养基中，在27°C， 4000r/min 黑暗下摇床震荡培养，发根农杆菌菌液A。。为0.45 0.60时用于感 染夕卜植体。3、 侵染、共培养、毛状根诱导培养、除菌及筛选将外植体分别侵入发根农杆菌菌液，黑暗中侵染20 30min;将侵染过的外植体 置于MS+NAA (0.05mg/L) + Pro 700mg/L培养基上(培养基pH值为 5.0 6.0)，于18。C 2(TC共培养2 5天；移至1/2MS +卡那霉素 50 mg/L +头孢霉素450 mg/L+50 100m mol/L乙酰丁香酮培养基上， 光照培养2 5天，弱光培养诱导毛状根；将诱导产生的毛状根接入 抑菌、筛选培养基1/2MS+Cef (500mg/L) +Km (50mg/L)保持弱光 培养，每周转接一次，反复转接3 5次后；切下抗Km根系的2 5mm的根尖，接入液体培养基扩大培养。
4 、株系筛选及液体扩大培养选择生长的迅速、分枝较多的 毛状根株系，切取长2 4mm根尖部份，置于1/2MS液体培养基， 50ml培养液装入150ml三角瓶中弱光或暗培养条件下，于摇床上 50 80rpm/min振荡培养，25天继代一次。优化培养基中添加诱导 子和前体物质有利于高山红景天次生代谢物积累。诱导子为灵芝或 云芝或黑曲霉或毛霉，浓度为50mg/L 100mg/L;前体物质为酪 醇或酪氨酸或苯丙氨酸，浓度为0.8 1.8 mmol/L。其中诱导子以黑
曲霉为好，前体物以酪醇为好。5、毛状根中红景天甙含量测定采用高效液相色谱法测定。其 结果为通过发根农杆菌诱导高山红景天得到的毛状根，在25天左 右能够增值15 28倍。毛状根干品中红景天甙含量为3.58%，约是 野生长白山高山红景天根的5倍，西藏高山红景天的7倍。高山红 景天毛状根生长量最大可达到398.21g/L;红景天甙积累量可达到 14.26 g/L。比野生长白山高山红景天根的0.59%有显著的提高。6、高山红景天毛状根中红景天甙的分离提取工艺取高山红景 天毛状根培养物于空气循环干燥器60'C烘干，干粉以粉碎机粉碎成 20目的粗粉，用70%乙醇提取，或直接用70%酒精浸泡新鲜的毛状 根培养物，提取红景天甙。本方法由毛状根培养物中得到的红景天 甙的含量为毛状根干重的3.0°/。 3. 50%，总次生代谢物生产率为 14.06 g/L。本发明中涉及的縮写术语、培养基1. 外植体一一高山红景天的无菌苗切成的1.0cn^叶片、lcm长 茎段及子叶节。2. 发根农杆菌菌种--RIOOO， R1601, ATCC15834, A4 ，LBA9402由法国园艺研究中心(Tepter博士惠赠)。3. 发根农杆菌培养基LB、 YEBLB液体培养基为10g/L蛋白胨，5g/L酵母浸膏，10g/L NaCl，调pH值至7.2后高压灭菌。LB固体培养基在上述 的基础上加15g/L琼脂糖。 YEP培养基为10g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L 牛肉浸膏，15g/L琼脂糖，调pH值至7.0后高压灭菌。4. 植物基本培养基MS (Murashige and Skoog， 1962)， 50ml MS大量元素(20*)， 5ml MS微量元素(200*), 5ml Fe盐(200*)， 10ml V维生素(100"(V^1000mg，VB6l00mg，烟酸100mg， 甘氨酸200mg，肌醇10g，生物素5mg。定容至1000ml，配成母液)， 0.2g酪素，0.2g天冬素，0.5mg氨基苯甲酸，0.25mg核黄素。叶 酸50mg用少量NaOH溶解，定容至100ml，每升培养基取 lml(0.5mg/ml) 。 6.5g/L琼月旨，pH 5.8 6.0。5. 抗生素卡那霉素Km (Kanamycin)、头孢霉素Cef(cephamycin)6. 激素2 ， 4-D ( 2 ， 4-Dichlorophenoxyacetic acid ) 、 NAA(Naphthaleneacetic acid)、 6-BA ( benzyladenine)7. 其他试剂乙酰丁 香酮 AS( 3 ， 5-mcthoxy-4-hydroxyacetophenone)、月甫氣酸Pro ( proline )、 红景天武(salidroside) 本发明有益的效果体现在1、 通过毛状根诱导及培养技术解决高山红景天资源短缺问题， 为中药红景天来源开辟出一条有效途径。高山红景天为国家保护植 物，具有重要的药用价值，利用毛状根大量培养技术生产红景天甙， 可保护有限的野生资源，适合工业化大生产，具有实用性。2、 应用高山红景天毛状根大量培养生产红景天甙与栽培和野生 的植物相比，可获得稳定的质量和产量，不受自然条件的限制，不 占用耕地面积，只需占用有限的厂房和培养室。3、 通过人工调控优化培养条件，可提高毛状根的生长和次生代 谢物的合成，极大的提高红景天甙的产量。4、 该技术在毛状根液体大量培养过程中不添加任何激素，在暗 培养环境中快速生长，因此，可以大大降低成本。
图l是高山红景天无菌苗示意图。图2是发根农杆菌诱导产生的毛状根示意图。图3是毛状根在固体培养基上快速生长示意图。图4是毛状根ro/基因的PCR检测示意图。图5是液体培养的高山红景天毛状根示意图。图6是毛状根液体培养基生长曲线示意图。
具体实施方式
实施例1 无菌苗的获得取采自长白山海拔1700 2500米的高山红景天种子，用自来水 冲洗净，在75%酒精中浸泡1 min后，再用15 % NaClO消毒12min。 然后用无菌水冲洗3 5次，将水空干接种在无激素的1/2MS+ Pro 700mg/L培养基(琼脂0.6%)上萌发培养10 18天。25°C ，光强 20001ux， 16小时光照，8小时暗培养。待15天无菌苗长出，取3 天苗龄的绿色子叶(留2mm左右的子叶柄)置于MS+0.5mg/L NAA+3.0mg/L6-BA培养基上继代培养如图1所示。2 预培养取继代培养的无菌苗的子叶节、茎段和叶片，叶片和带叶柄的 子叶背腹面用刀轻划，茎段切成lcm长作外植体，接种在MS+1.2mg/L 2， 4-D+ 2.4mg/L 6-BA+ Pro 700mg/L培养基上预培养2 3天，待边 缘略有愈伤现象时用于侵染。3 发根农杆菌培养将发根农杆菌ATCC15834接种在YEB固体培养基上划线培养， 于27X:下活化3次，挑取平板上单菌落，接种在25ml LB液体培养 基。在27'C， 4000r/min黑暗下摇床震荡培养，继代3次后，发根
农杆菌菌液A。。为0. 45时用于感染外植体。4 发根农杆菌的侵染、共培养、除菌及筛选 将上述预培养的外植体分别浸入处于对数期菌液^)。为0.45的发根农杆菌ATCC15834菌液中，黑暗中侵染24min，取出用无菌滤 纸吸干多余的菌液，置于MS+NAA (0.05mg/L) + Pro 700mg/L培养 基上共培养2天后，移至1/2MS +卡那霉素50 mg/L +头孢霉素450 mg/L+60mmol/L乙酰丁香酮培养基上，于2(TC，散射弱光照除菌培 养。每5天转一次培养基。并以未经发根农杆菌感染的高山红景天 子叶、茎段和子叶节为对照。15天左右产生毛状根如图2所示。把 感染后外植体上长出的毛状根剪下移到新的培养基1/2MS+卡那霉素 50 mg/L +头孢霉素450 mg/L上，每周转接1次，直至除菌完成后， 移到不含抗生素的1/2 MS培养基上培养如图3所示。5 毛状根优质株系的筛选挑选除菌彻底、经过PCR检测的毛状根，将分枝多、生长快的 毛状根剪下长1 3 cm左右，移入1/2MS+Pro700mg/L培养液中。150ml 三角烧瓶中，每瓶装液50ml接入一根毛状根。25天后观察生长情况， 挑选生长旺盛的用于继代及大量培养。 6毛状根的检测基因组DNA微量提取1) 取0.5g 1.0g经过筛选的毛状根在液氮下研磨，装入50ml 离心管加入20ml Extraction Buffer( 100mM Tris-HC1,PH 8.0; 0.35mM Sorbitol; 5mM EDTA,PH 8.0; 1% 2-Mercaptoethanol (使用之前加入)) 并置于冰上。2) 4°C， 10000r/min离心IO分钟，去上清，用20ml Extraction Buffer溶解沉淀两次并离心。3) 去上清并用5ml Extraction Buffer悬浮沉淀，加入3.5ml High-Salt CTAB Buffer (50mM Tris-HCl,PH 8.0; 4M NaCl; 1.8% CTAB;25mM EDTA,PH8.0)和0.3mlSarkosyl(浓度为30%的水溶液)， 55'C温育60 90分钟。4) 加入等体积的氯仿异戊醇(24: 1)， 10000r/min离心10分钟。5) 去上清加入2/3体积预冷的混合有1/10体积乙酸钠的异丙 醇。4°C， 10000r/min离心20分钟。6) 去上清，用冷的75%的乙醇洗涤沉淀。去乙醇，在空气中干 燥DNA，并用200jalTE Buffer (10mM Tris,PH 8.0; lmMEDTA， PH 8.0) 溶解。7)加入10plRnase(lmg/ml)在37。C下温育40分钟，加入等体积 的酚氯仿，抽提去除蛋白质。室温下高速离心10分钟(最好13000r/min以上)。8) 取上清加入等体积预冷的100%的氯仿，沉淀去除蛋白质。室 温下高速离心10分钟。9) 取上清加入两倍体积的冷的无水乙醇(混合1/10体积的乙 酸钠)，沉淀DNA然后将其放于-2(TC下30分钟。10) 用最大转速沉淀DNA15分钟。用75%的冷的乙醇洗涤DNA 沉淀，并在空气中干燥。用50 00plTE Buffer溶解DNA。毛状根的PCR检测 取经过筛选的毛状根100 ng的基因组DNA为模板，以试管苗正 常根作为阴性对照，Ri质粒为阳性对照。rolC基因的引物序列(宝 生物合成)引物I序列5、一GATATATGCCAAATTTACACTAG—3、 引物II序列5、一GTTAACAAAGTAGGAAACAGG—3、PCR反应总体系为 50ul Taq Mix (购自宝生物) 25ul引物I 2 (20pmo1) ul引物II 2 (20pmo1) ul模板 5 (100ng) ul 去离子无菌水 16ul在PCR仪(UNOII，Biometra)中进行反应，反应程序为94°C， 45s; 45°C， 30s; 72°C， 45s共30个循环，72。C延长10min，如图4所示。 7 毛状根生长曲线的测定挑选生长旺盛的毛状根株系，接入1/2MS培养液中。150ml三 角烧瓶中，每瓶装液50ml接入毛状根鲜重0.390g(干重0.041g)，共30瓶。每5天测定一次鲜重和干重，以平均重量为指标绘制生长曲 线。鲜重系用布氏漏斗抽滤至无水滴下时测定，干重系60'C烘干后 测得如图6所示。8毛状根的液体培养基大量培养挑选生长旺盛的毛状根株系，接入150ml三角培养瓶装液50ml 的1/2MS+Pro700mg/L液体培养基中如图5所示。其中碳源为蔗糖或 果糖或葡萄糖(30 g/L);NH4+禾卩N(V为氮源，总氮浓度为80 mmol/L; 光照为2000x1散射光；温度为18°C 20°C; pH值为6.5 7.2;诱导 子为灵芝或云芝或黑曲霉或毛霉，浓度为50mg/L 100mg/L;前 体物质为酪醇或酪氨酸或苯丙氨酸，浓度为0.8 1.8 mmol/L。其中 诱导子以黑曲霉为好，前体物以酪醇为好。 9毛状根红景天甙的分离提取色谱条件Ci8色谱柱(250mmx4.6mm， 5|im)，流动相为甲醇- 水(20: 80)，流速1 ml/min，检测波长274nm用于红景天甙的测定。 对照品及供试品溶液的制备 红景天甙标准品购自中国生物制品检定所。精密称取红景天甙对照品5.08mg置10ml量瓶中，加甲醇至刻度， 摇匀，得红景天甙对照品贮备液；精密量取此贮备液lml置10ml量 瓶中，加甲醇至刻度，摇匀即得红景天甙对照品溶液(50.8)Lig/ml)。取 毛状根样品粗粉约0.4g，精密称定，置锥形瓶中，加甲醇90ml，浸 泡振摇60min后超声提取30min，放冷，滤过，用少许甲醇洗涤容器， 滤过，滤液并入100ml量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45Lm微孔 滤膜滤过，作为供试品溶液。标准曲线分别精密吸取红景天甙对照品溶液0.5、 1、 2、 5、 10ml，用甲醇稀释成含红景天甙1.56、 4.68、 7.8、 10.92、 15.6pg/ml 5种溶液，绘制标准曲线，其回归方程为Y-34663.4X- 2445.1， r = 0.9997(n = 5)。红景天甙在0.20 8.00pg/ml范围内呈良好的线性关 系。经计算分析红景天甙含量为毛状根干重的3.58%，约是野生长白 山高山红景天根的5倍，西藏高山红景天的7倍。高山红景天毛状 根生长量最大可达到398.21g/L;红景天甙积累量可达到14.26 g/L。 10高山红景天毛状根中红景天甙的分离提取工艺取高山红景天毛状根培养物于空气循环干燥器6(TC烘干，干粉 以粉碎机粉碎成20目的粗粉，用70%乙醇提取，或直接用70%酒精 浸泡新鲜的毛状根培养物，提取红景天甙。本方法由毛状根培养物 中得到的红景天甙的含量为毛状根干重的3.0% 3.50%，总次生代谢 物生产率为14.06 g/L。下面实施例2、 3、 4、 5中的1、 2、 5、 6、 7、 8、 9、 10步骤与 实施例1相同省略。 实施例23、 发根农杆菌培养将5种发根农杆菌LBA9402，接种在YEB固体培养基上划线培养， 于27'C下活化3次，挑取平板上单菌落，接种在25ml LB液体培养 基。在27°C， 4000r/min黑暗下摇床震荡培养，继代3次后，发根 农杆菌菌液A。。为0. 55时用于感染外植体。4、 发根农杆菌的侵染、共培养、除菌及筛选 将上述预培养的外植体分别浸入处于对数期菌液A。。为0.45 0. 60的发根农杆菌LBA9402菌液中，黑暗中侵染25min，取出用无 菌滤纸吸干多余的菌液，置于MS+NAA (0. 05mg/L) + Pro 700mg/L 培养基上共培养2. 5天后，移至1/2MS +卡那霉素50 mg/L +头孢霉
素450 mg/L+80m mol/L乙酰丁香酮培养基上，于20。C，散射弱光照 除菌培养。每5天转一次培养基。并以未经发根农杆菌感染的高山 红景天子叶、茎段和子叶节为对照。把感染后外植体上长出的毛状 根剪下移到新的培养基1/2MS+卡那霉素50 mg/L +头孢霉素450 mg/L 上，每周转接1次，直至除菌完成后，移到不含抗生素的1/2MS培 养基上培养。 实施例33、 发根农杆菌培养将5种发根农杆菌A4接种在YEB固体培养基上划线培养，于 27。C下活化3次，挑取平板上单菌落，接种在25ml LB液体培养基。 在27°C， 4000r/min黑暗下摇床震荡培养，继代3次后，发根农杆 菌菌液A。。为0.50时用于感染外植体。4、 发根农杆菌的侵染、共培养、除菌及筛选 将上述预培养的外植体分别浸入处于对数期菌液A。。为0. 50的发根农杆菌A4菌液中，黑暗中侵染24min，取出用无菌滤纸 吸干多余的菌液，置于MS+NAA (0.05mg/L) + Pro 700mg/L培养基 上共培养2天后，移至1/2MS +卡那霉素50 mg/L +头孢霉素450 mg /L+90m mol/L乙酰丁香酮培养基上，于25°C，散射弱光照除菌培养。 每5天转一次培养基。并以未经发根农杆菌感染的高山红景天子叶、 茎段和子叶节为对照。把感染后外植体上长出的毛状根剪下移到新 的培养基1/2MS+卡那霉素50 mg/L+头孢霉素450 mg/L上，每周转接 l次，直至除菌完成后，移到不含抗生素的1/2MS培养基上培养。 实施例43、 发根农杆菌培养将5种发根农杆菌R1601接种在YEB固体培养基上划线培养， 于27。C下活化3次，挑取平板上单菌落，接种在25ml LB液体培养 基。在27°C， 4000r/min黑暗下摇床震荡培养，继代3次后，发根 农杆菌菌液A。。为0.60时用于感染外植体。4、 发根农杆菌的侵染、共培养、除菌及筛选 将上述预培养的外植体分别浸入处于对数期菌液A。。为0.60的发根农杆菌R1601菌液中，黑暗中侵染25min，取出用无菌滤纸吸干 多余的菌液，置于MS+NAA (0.05mg/L) + Pro 700mg/L培养基上共 培养3天后，移至1/2MS +卡那霉素50mg/L +头孢霉素450mg/L+ 70m mol/L乙酰丁香酮培养基上，于25°C，散射弱光照除菌培养。每5 天转一次培养基。并以未经发根农杆菌感染的高山红景天子叶、茎 段和子叶节为对照。把感染后外植体上长出的毛状根剪下移到新的 培养基1/2MS+卡那霉素50 mg/L+头孢霉素450 mg/L上，每周转接1 次，直至除菌完成后，移到不含抗生素的1/2MS培养基上培养。 实施例53、 发根农杆菌培养将5种发根农杆菌RIOOO，接种在YEB固体培养基上划线培养， 于27。C下活化3次，挑取平板上单菌落，接种在25ml LB液体培养 基。在27eC， 4000r/min黑暗下摇床震荡培养，继代3次后，发根 农杆菌菌液A。。为0. 45 0. 60时用于感染外植体。4、 发根农杆菌的侵染、共培养、除菌及筛选 将上述预培养的外植体分别浸入处于对数期菌液A。。为0. 55的发根农杆菌R1000菌液中，黑暗中侵染30min，取出用无菌滤纸吸干 多余的菌液，置于MS+NAA (0.05mg/L) + Pro 700mg/L培养基上共 培养3天后，移至1/2MS +卡那霉素50 mg/L +头孢霉素450 mg/L+ 90m mol/L乙酰丁香酮培养基上，于25°C，散射弱光照除菌培养。每5 天转一次培养基。并以未经发根农杆菌感染的高山红景天 子叶、茎段和子叶节为对照。把感染后外植体上长出的毛状根剪下 移到新的培养基1/2MS+卡那霉素50 mg/L+头孢霉素450 mg/L上，每 周转接1次，直至除菌完成后，移到不含抗生素的1/2MS培养基上 培养。
权利要求
1、 一种利用发根农杆菌遗传转化高山红景天建立毛状根培养体 系生产红景天甙的方法，其特征在于其特点在于以高山红景天(i /zoflf/o/a sac/za/z7 ews" A5or ) 为夕卜植体，禾'J用发根农杆菌 (々ro6""eW謂Wn'zoge"es,爿r)进行遗传转化诱导产生毛状根(hairy root),通过培养条件(pH值、温度、侵染时间、共培养时间和乙酰 丁香酮添加)优化提高毛状根诱导率；毛状根经发酵罐培养大量生 产毛状根，通过碳源、氮源、光照、温度、pH值、诱导子、前体物 质和培养液的优化，提高高山红景天毛状根红景天甙的含量；通过 毛状根红景天甙的分离提取过程，生产红景天甙。
2、 如权利要求1所述一种利用发根农杆菌遗传转化高山红景天 建立毛状根培养体系生产红景天甙的方法，其特征在于高山红景 天为长白山高山红景天或西藏高山红景天。
3、 如权利要求1所述一种利用发根农杆菌遗传转化高山红景天 建立毛状根培养体系生产红景天甙的方法，其特征在于发根农杆 菌菌系为ATCC15834或A4或Ri1000或LBA9402或Ril601。
4、 如权利要求1所述一种利用发根农杆菌遗传转化高山红景天 建立毛状根培养体系生产红景天甙的方法，其特征在于毛状根诱导培养基pH值为5力 6.0;培养温度为18°C 20°C。
5、 如权利要求1所述一种利用发根农杆菌遗传转化高山红景天建立毛状根培养体系生产红景天甙的方法，其特征在于发根农杆菌转化高山红景天侵染时间为20 30 min;共培养时间为2 3天。
6、 如权利要求1所述一种利用发根农杆菌遗传转化高山红景天 建立毛状根培养体系生产红景天甙的方法，其特征在于发根农杆 菌转化高山红景天的培养过程添加乙酰丁香酮为50 100u mol/L。
7、 如权利要求1所述一种利用发根农杆菌遗传转化高山红景天 建立毛状根培养体系生产红景天甙的方法，其特征在于毛状根培 养培养液碳源为蔗糖、果糖和葡萄糖，添加量为20 35g/L。
8、 如权利要求1所述一种利用发根农杆菌遗传转化高山红景天 建立毛状根培养体系生产红景天甙的方法，其特征在于毛状根培 养培养液中NH/和N03-为氮源，总氮浓度为65 85 mmol/L。
9、 如权利要求1所述一种利用发根农杆菌遗传转化高山红景天 建立毛状根培养体系生产红景天甙的方法，其特征在于毛状根培 养液为1/2MS培养液，培养光照为2000x1散射光，培养温度为18 。C 2(TC，培养液pH值为6.5 7.2，诱导子为灵芝、云芝、黑曲霉 和毛霉，添加浓度为50mg/L 100mg/L，前体物质为酪醇、酪氨 酸及苯丙氨酸，添加浓度为0.8 1.8 mmol/L。
全文摘要
本发明公开了一种利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes，Ar)遗传转化高山红景天(Rhodiola sachalinensis A.Bor)建立毛状根培养体系生产红景天甙的方法。通过外植体的制备，发根农杆菌菌液培养，对高山红景天进行遗传转化诱导产生毛状根，经PCR检测，证明毛状根为转化产生，利用发酵罐培养大量生产毛状根，通过添加前体物质和诱导子提高红景天甙含量，用以生产红景天甙，替代濒临枯竭的高山红景天资源。
文档编号C12P19/44GK101121941SQ20071005546
公开日2008年2月13日 申请日期2007年3月26日 优先权日2007年3月26日
发明者周晓馥, 徐洪伟 申请人:吉林师范大学