根癌农杆菌介导的黑孢块菌遗传转化方法
【专利摘要】本发明公开了一种根癌农杆菌介导的黑孢块菌遗传转化方法，属于黑孢块菌的遗传转化领域。本发明根癌农杆菌介导的黑孢块菌遗传转化方法，包括以下步骤：(1)制备黑孢块菌孢子悬浮液；(2)将携带有目的基因的双元载体质粒转化根癌农杆菌，获得根癌农杆菌阳性转化子，制备菌液；(3)将步骤(2)制备的菌液与步骤(1)制备的黑孢块菌孢子悬浮液混合，共培养；(4)选择性培养，筛选黑孢块菌转化子，鉴定，即得。本发明方法以黑孢块菌的孢子为受体，以根癌农杆菌为介体，具有简单方便，转化效率高且稳定，转化子为单拷贝的频率高等优点，适用于黑孢块菌功能基因组学及生物学研究等。
【专利说明】根癌农杆菌介导的黑孢块菌遗传转化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及黑孢块菌的转化方法，尤其涉及根癌农杆菌介导的黑孢块菌遗传转化 方法，属于黑孢块菌的遗传转化领域。
【背景技术】
[0002] 黑孢块菌（Tuber melanosporum)是一种原产自法国，与橡树、栎树等树种根系共 生的外生菌根型食用真菌，以其与生俱来的独特香味和"钻石"身价而备受关注。黑孢块菌 基因组测序的完成推动了研宄人员从分子水平对黑孢块菌生物学的认识，但是由于黑孢块 菌尚未建立成熟的遗传操作系统，极大限制了黑孢块菌功能基因组学研宄。
[0003] 近年来发展起来的根癌农杆菌介导的丝状真菌转化方法具有以下三个优点： 第一，农杆菌可以转化完整的细胞如孢子、菌丝体，甚至是大型真菌的子实体，这就免 去了制备原生质体的麻烦，从而不需要考虑影响原生质体转化率的诸多因素（Vianey Olmedo-Monfil，Carlos Cortes-Penagos，Alfredo Herrera-Estrella. Three decades of fungal transformation:key concepts and applications. Methods in Molecular Bi〇 1 ogy，2004, 267:297-313.);第二，农杆菌转化的转化效率很高；研宄表明，农杆菌介 导丝状真菌的转化效率一般在300-720个转化子每10 7个细胞，比其他真菌转化方法 高 100-1000 倍（Marcel-J.A.de Groot，Paul Bundock，Paul_J.J Hooykaas，Alice_G. M. Beijersbergen. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nature Biotechnology, 1998, 16:839-842.);第三，T-DNA 插入产 生的突变体大部分为单拷贝插入，当采用具有单核的分生孢子为转化受体时可以得到后 代不分离的转化子，避免了真菌菌丝多核所造成的转化子不稳定的难题（ED Mullins，X Chen, P Romaine, R Raina, DM Geiser, S Kang. Agrobacterium-Mediated Transformation of Fusarium oxysporum:An Efficient Tool for Insertional Mutagenesis and Gene Transfer. Phytopathology, 2001，91:173-180.)。根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化系 统存在的缺点是转化需要大量的孢子或者子实体作为转化受体，并不适用于人工培养条件 下产抱少或者不产抱真菌（Olmedo-Monfil et al, 2004)。
[0004] 黑孢块菌在发酵条件和真菌常规培养基PDA培养基上产孢很少或者不产孢，同时 黑孢块菌目前尚未有成功制备原生质体的报道，缺少一套适合黑孢块菌的遗传转化系统是 限制黑孢块菌分子生物学研宄的瓶颈。
[0005] 因此，亟待构建一种简单、高效的黑孢块菌遗传转化系统，对于推动黑孢块菌功能 基因组学研宄，促进黑孢块菌资源的开发和利用具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种根癌农杆菌介导的黑孢块菌（Tuber melanosporum)遗传转化方法，该方法简单方便、转化效率高且稳定。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0008] 本发明公开了一种根癌农杆菌介导的黑孢块菌（Tuber melanosporum)遗传转化 方法，包括以下步骤：
[0009] (1)制备黑孢块菌孢子悬浮液；（2)将携带有目的基因的双元载体质粒转化根癌 农杆菌，获得根癌农杆菌阳性转化子，制备菌液；（3)将步骤（2)制备的菌液与步骤（1)制 备的黑孢块菌孢子悬浮液混合，共培养；(4)选择性培养，筛选黑孢块菌转化子，鉴定，即 得。
[0010] 其中，步骤（1)所述黑孢块菌孢子悬浮液中孢子浓度为104-108个/mL，优选为10 6 个/mL ;所述制备黑孢块菌孢子悬浮液，包括：(a)将黑孢块菌菌丝体接种于PDA培养基，于 28°C培养活化；优选的，活化3d ; (b)将活化后的黑孢块菌菌丝体接种于VBC培养基，28°C 培养4-9d，优选为7d ;用无菌水洗涤菌丝体，收集黑孢块菌的孢子，稀释，即得。
[0011] 步骤（2)将携带有目的基因的双元载体质粒转化根癌农杆菌的方法为本领域技 术人员所熟知，例如化学转化法。
[0012] 步骤（2)所述制备菌液包括：(a)挑取根癌农杆菌阳性转化子，接种到含抗生素的 LB培养基中，28°C 200rpm震荡培养12-20h，优选为18h，离心，收集菌体；(b)用頂培养基 重悬菌体，离心，收集菌体；（c)用頂培养基重悬菌体，将菌体浓度0D_调至0. 1?0. 6,优 选为0. 15?0. 3,28°C 200rpm振荡培养3-8h，优选为6h，即得。
[0013] 其中，所述IM培养基中含有乙酰丁香酮，优选的，所述乙酰丁香酮的浓度为 200mmol/L〇
[0014] 本发明根癌农杆菌介导的黑孢块菌遗传转化方法中，步骤（3)将步骤（2)制备的 菌液与步骤（1)制备的黑孢块菌孢子悬浮液等体积混合；所述共培养的培养基为铺有硝酸 纤维素薄膜的CM培养基；共培养条件为28°C避光培养24-60h，优选为48h。
[0015] 其中，所述CM培养基为添加2 % (w/v)琼脂糖的頂培养基，含有终浓度为 200mmol/L的乙酰丁香酮。
[0016] 步骤（4)所述选择性培养是将步骤（3)共培养后的硝酸纤维素薄膜揭下，正向铺 到含抗生素的PDA培养基，28°C培养至出现可见的单菌落。进一步将单菌落挑取至新的选 择性培养基上，分离有抗生素抗性的黑孢块菌菌株。
[0017] 本发明所述抗生素选自头孢霉素、潮霉素或卡那霉素。
[0018] 本发明根癌农杆菌介导的黑孢块菌遗传转化方法，利用VBC培养基促进黑孢块菌 大量产孢，随后将含有双元载体的根癌农杆菌与黑孢块菌孢子混合后共培养，通过抗性筛 选，获得转化子。该方法的转化效率可达1-6X10 5个孢子，转化效率高且稳定，克服了黑孢 块菌多细胞菌丝体难以快速制备大量单细胞原生质体等原因导致的黑孢块菌遗传转化困 难的问题。
[0019] 本发明成功的将PCAMBIA1302-1质粒转化了黑孢块菌，筛选到一系列整合潮霉素 抗性基因的突变体。PCR鉴定结果表明，所有供试转化子均能扩增出预期大小的片段，说明 黑孢块菌转化子含有插入的T-DNA片段。进一步将PCR扩增产物进行序列测定，Blast分 析表明，扩增片段与潮霉素磷酸转移酶基因的一致性达到100%，进一步说明T-DNA已经成 功的转入黑孢块菌基因组，且可以稳定的遗传。本发明以1〇 6孢子为出发材料，通过根癌农 杆菌介导分别筛选到28、45和62个阳性转化子，阳性转化效率达到4. 53± 1. 75个/105个 孢子。
[0020] 本发明还成功的将外源绿色荧光蛋白编码基因引入黑孢块菌，经表达以后，受体 细胞在激发光下表现出特异的绿色，可以用于发酵过程中细胞活性检测、形态分析，同时也 是研宄黑孢块菌与寄主植物相互作用关系的重要工具。该实验结果从细胞水平进一步证实 本发明构建的黑孢块菌遗传转化系统的有效性，同时也为黑孢块菌生物学研宄提供了一种 重要工具。
[0021] 本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0022] (1)本发明方法与基于原生质体转化方法相比更为简单，同时该方法适用于其它 产孢较少的丝状真菌。
[0023] (2)本发明方法利用VBC培养基一次可以大量制备黑孢块菌的孢子，满足构建突 变体文库等遗传操作的需要。
[0024] (3)本发明以黑孢块菌的孢子为受体，以根癌农杆菌为介体，具有转化效率高、转 化子为单拷贝的频率高等优点，适用于黑孢块菌T-DNA随机插入突变体文库的构建、功能 基因的沉默或敲除等。这是国内外首次报道黑孢块菌的遗传转化系统。
[0025] 本发明所涉及到的术语宙义
[0026] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所了解相同的含义。
[0027] 术语"遗传转化"意指通过某种途径或技术将外源基因导入受体细胞的基因组中， 并使之在受体细胞中得以表达。
[0028] 术语"转化子"意指导入外源DNA从而获得新的遗传性状的受体菌单菌落。
[0029] 术语"抗生素"意指由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活 过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育 功能的化学物质；包括0 _内酰胺类（如头孢菌素类）、氨基糖苷类（如卡那霉素）、酰胺醇 类（如氯霉素）等几千种。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 图1为黑孢块菌在产孢培养基VBC的生长情况及孢子形态观察；其中，A :黑孢块 菌在产孢培养基VBC的生长情况；B :孢子形态观察；
[0031] 图2为质粒pCAMBIA1302-l的图谱；
[0032] 图3为部分黑孢块菌转化子菌落形态；其中，A :未转化的黑孢块菌菌株；B :部分 黑孢块菌转化子菌落；
[0033] 图4为随机挑选的黑孢块菌转化子潮霉素磷酸转移酶基因（hph)的PCR扩增的电 泳图谱；其中，1-10 :黑孢块菌转化子；positive control :以PCAMBIA1302质粒作为模板的 PCR扩增结果；Negative control (wild type):以野生型黑孢块菌基因组作为模板扩增结 果；Negative control (without template) :PCR 反应体系中不添加模板；
[0034] 图5为质粒pCAMBIA1302的图谱；
[0035] 图6为黑孢块菌野生菌株及转化子荧光检测结果；其中，A :黑孢块菌野生菌株；B : 黑孢块菌转化子。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领 域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节 和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0037] 1、实验材料
[0038] 黑孢块菌（四川省绵阳市食用菌研宄所）；
[0039] 根癌农杆菌EHA105 (硫酸卡那霉素敏感型）（由南京农业大学武俊副教授惠赠）；
[0040] PCAMBIA1302-1质粒（本发明人实验室构建，利用Spel与Xbal双酶切 PCAMBIA1302后，通过粘性末端自连构建pCAMBIA1302-l质粒，lacZa和启动子区被删 除）；
[0041] pCAMBIA1302 质粒(The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vector for plant transformation.Plant Molecular Biology. 25(6)，989-994(1994))。
[0042] 实施例1黑孢块菌突变体文库的构建
[0043] 1、实验方法
[0044] 1. 1黑孢块菌孢子的制备
[0045] (1)将黑孢块菌菌丝体接种于PDA培养基上，于28°C培养活化3d。PDA培养基： 200g去皮马铃薯，加适量蒸馏水煮制30min后加葡萄糖20g，MgS0 4 *7H20 1. 5g，KH2P043. 0g， VB150mg，琼脂18g，补充蒸馏水定容至1000mL，pH自然，115°C，30min高温灭菌。
[0046] (2)将活化后的黑孢块菌菌落边缘的菌丝体接种于VBC培养基上，28°C培养7d后， 用5mL无菌水洗涤菌丝体，收集黑孢块菌的孢子。
[0047] VBC 培养基：磷酸二氢钾 1. 0g，硝酸钾 1. 0g，蔗糖 0? 5g，VB1100mg，VC 100mg，琼脂 20g，蒸馏水定容至1000mL，pH自然，115°C，30min高温灭菌。
[0048] (3)将一滴孢子悬浮液置于血球计数板上，利用显微镜对孢子进行计数，将孢子悬 浮液稀释至1〇 6个/mL。
[0049] 1. 2根癌农杆菌的转化及培养
[0050] 采用化学转化法将PCAMBIA1302-1质粒（图1)转化根癌农杆菌。
[0051] 1. 2. 1根癌农杆菌感受态制备
[0052] 将保存的根癌农杆菌EHA105 (硫酸卡那霉素敏感型）在LB固体培养基上活化，转 接三次后，接种到LB液体培养基中，28°C，200rpm，摇床振荡培养至0D_= 0. 5,收集细胞， 利用预冷的〇. 1M CaCl2溶液制备根癌农杆菌感受态细胞。
[0053] LB培养基成份：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，定容至1L。
[0054] 1. 2. 2pCAMBIA1302-l质粒转化根癌农杆菌
[0055] 将10yL pCAMBIA1302-l质粒加入50yL根癌农杆菌感受态细胞中，冰浴静置 30min，然后置于液氮中速冻3min，立即37°C水浴热击5min ;再置于冰上2min，加入650 y L 28°C预热的LB液体培养基，28°C，200rpm，摇床振荡培养5h，4000r/min离心菌液5min，重悬 于100 y L液体LB培养基中，涂布在含有50 y g/mL卡那霉素的LB固体培养基上，筛选根癌 农杆菌阳性转化子。
[0056] 利用菌落PCR鉴定阳性转化子，鉴定引物为：HPT-5 :GACGACACCGTCAGCGCGTC， HPT-3 :CITTGCCCTCGGACGAGTGCTGG。PCR 反应体系为 50yL，包括 lOXBuffer 5yL， dNTP (20mmol .LiMuL，引物（25pmol ? y L 〇 各 2 y L，Mg2+ (25mmol *L 菌体 DNA (约 50ng ? y I71) 1 y L，Taq DNA 聚合酶（5U ? y I71) 0? 5 y L，加 H20 至 50 y L。反应条件：94°C变 性 5min ;94°C 30sec，5(TC 30sec，72°C lmin，30 个循环；72°C延伸 10min〇
[0057] 1. 2. 3根癌农杆菌阳性转化子的培养
[0058] 挑取活化的根癌农杆菌EHA105 (携带pCAMBIA1302-l质粒）单菌落接种到LB培 养基（含50yg/mL硫酸卡那霉素）中，28°C、200rpm震荡培养18h后，5000rpm离心5min， 弃去上清，收集菌体。用IM培养基重悬菌体，5000rpm离心5min，弃去上清，收集菌体，再次 用IM培养基重悬菌体，通过頂培养基将菌体浓度0D 6(i(i调至0. 15?0. 3,28°C 200rpm摇床 振荡培养6h。
[0059] 頂培养基成份：KH2P041. 45g，K2HP042. 05g，（NH4) 2S040. 5g，MgS04 ? 7H20 0? 5g，NaCl 0? 15g，CaCl20. 067g，FeS04 ? 7H20 0? 0025g，1M MES(pH 5. 5)40mL，20%葡萄糖（W/V) 10mL， 50%甘油（￥/￥)51^，微量元素51^，200111111〇1乙酰丁香酮仏5)11^，定容至11，1151：高压灭菌 30min〇
[0060] 微量元素配制：称取 ZnS04 ? 7H20、CuS04 ? 5H20、MnS04 ? 7H20、Na2Mo04 ? 7H20、H3B03 各0. Olg溶于lOOmL水中。
[0061] 200mmol乙酰丁香酮配制：称取0. 039g溶于lmL无水乙醇中。
[0062] 20 %葡萄糖：称取20g葡萄糖，无菌水定容至100mL。
[0063] 50%甘油：50mL甘油溶于50mL的无菌水中。
[0064] 1. 3根癌农杆菌与黑孢块菌孢子共培养及选择性培养
[0065] 将上述制备好的EHA105 (携带pCAMBIA1302-l质粒）菌液和黑孢块菌孢子悬浮液 等体积涡旋混匀，吸取200 y r混合液均匀涂布在铺有硝酸纤维素薄膜的CM培养基上，CM培 养基在使用前加入AS至终浓度为200mM/L。将培养皿在超净工作台中吹至半干，28 °C避光 培养48h。将硝酸纤维素薄膜从共培养基上揭下，正向铺到PDA培养基（含200 y g/mL头孢 霉素、250 y g/mL潮霉素B)上，28 °C培养，直至在PDA培养基上出现可见的单菌落。
[0066] CM培养基为添加2 % (w/v)琼脂糖的頂培养基。
[0067] 1. 4黑孢块菌转化子的筛选及鉴定
[0068] 1. 4. 1黑孢块菌转化子的筛选
[0069] 将PDA培养基上生长的单菌落挑取至新的选择性培养基上，分离有潮霉素抗性的 黑孢块菌菌株，将抗性菌株继续在含50 y g/mL潮霉素B培养基上培养三代至生长稳定。
[0070] 1. 4. 2黑孢块菌转化子的鉴定
[0071] 将潮霉素抗性菌株接种到含有50 y g/mL潮霉素B、200 y g/mL头孢霉素的PDA液 体培养基中，28°C，200rpm培养72h，13000rpm离心5min，弃上清，收集菌体，提取转化子基 因组。基因组提取采用真菌基因组提取试剂盒（商品编号D3390-01，0MEGA生物技术公司）。
[0072] PCR鉴定采用靶向潮霉素抗性基因的特异引物（HPT-F2 :GACGACACCGTCAGTGCGTC， HPT-3 :CITTGCCCTCGGACGAGTGCTGG)。PCR 反应体系为 50 y L，包括 lOXBuffer 5 y L， dNTP (20mmol .LiMuL，引物（25pmol ? y L 丨）各 2 y L，Mg2+ (25mmol *L 菌体 DNA (约 50ng ? y I71) 1 y L，Taq DNA 聚合酶（5U ? y I71) 0? 5 y L，加 H20 至 50 y L。反应条件：94°C变 性 5min ;94°C 30sec，50°C 30sec，72°C lmin，30 个循环；72°C延伸 10min。PCR 产物按照常 规方法用1 %琼脂糖凝胶进行电泳，经凝胶成像系统成像观察并记录电泳结果。
[0073] 将PCR扩增产物进行序列测定，Blast分析扩增片段与潮霉素磷酸转移酶基因的 一致性。
[0074] 2、实验结果
[0075] 2. 1黑孢块菌在产孢培养基VBC的生长情况及孢子形态观察
[0076] 黑孢块菌在产孢培养基VBC的生长情况及孢子形态观察见图2。
[0077] 2. 2黑孢块菌转化子的筛选
[0078] 部分黑孢块菌转化子菌落形态见图3。
[0079] 2. 3黑孢块菌转化子的鉴定
[0080] PCR鉴定结果（图4)表明，供试转化子及质粒pCAMBIA1302-l均能扩增出预期大 小的片段，而未经转化的野生型菌株及无菌水对照则扩增不到相应大小的片段，说明黑孢 块菌转化子含有插入的T-DNA片段。
[0081] 为了进一步证实PCR扩增结果的可靠性，将PCR扩增产物进行序列测定，其核苷酸 序列为SEQ ID NO. 1所示。Blast分析表明，该片段与潮霉素磷酸转移酶基因的一致性达到 100%，进一步说明T-DNA已经成功的转入黑孢块菌基因组，且可以稳定的遗传。
[0082] 本发明以106孢子为出发材料，通过根癌农杆菌介导分别筛选到28、45和62个阳 性转化子，阳性转化效率达到4. 53 ± 1. 75个/105个孢子。
[0083] 实施例2黑孢块菌的基因标记
[0084] 1、实验方法
[0085] 1. 1黑孢块菌孢子的制备
[0086] 具体方法同实施例1。
[0087] 1. 2根癌农杆菌的转化及培养
[0088] 具体方法同实施例1，所用质粒为pCAMBIA1302(图5)。
[0089] 1. 3根癌农杆菌与黑孢块菌孢子共培养及选择性培养
[0090] 具体方法同实施例1。
[0091] 1. 4黑孢块菌转化子的筛选及鉴定
[0092] 1. 4. 1黑孢块菌转化子的筛选
[0093] 将PDA培养基上生长的单菌落挑取至新的选择性培养基上，分离有潮霉素抗性的 黑孢块菌菌株，将抗性菌株继续在含50 y g/mL潮霉素B培养基上培养三代至生长稳定。
[0094] 1. 4. 2黑孢块菌转化子荧光强度检测
[0095] 挑取阳性转化子的菌丝体置于载玻片上，置于倒置荧光显微镜（IX-51，日本奥林 巴斯公司生产）下进行荧光检测。
[0096] 2、实验结果
[0097] 挑取阳性转化子的菌丝体置于载玻片上，置于倒置荧光显微镜下进行荧光检测， 采用蓝光激发光，能够观察到阳性转化子产生明显荧光，而野生菌株不产生荧光（图6)。
[0098] 本实验主要将外源绿色荧光蛋白编码基因引入黑孢块菌，经表达以后，受体细胞 在激发光下表现出特异的绿色，可以用于发酵过程中细胞活性检测、形态分析，同时也是研 宄黑孢块菌与寄主植物相互作用关系的重要工具。
[0099] 该实验结果从细胞水平进一步证实本发明构建的黑孢块菌遗传转化系统的有效 性，同时也为黑孢块菌生物学研宄提供了一种重要工具。
【权利要求】
1. 一种根癌农杆菌介导的黑孢块菌（Tuber melanosporum)遗传转化方法，其特征在 于，包括以下步骤： (1)制备黑孢块菌孢子悬浮液；(2)将携带有目的基因的双元载体质粒转化根癌农杆 菌，获得根癌农杆菌阳性转化子，制备菌液；（3)将步骤（2)制备的菌液与步骤（1)制备的 黑孢块菌孢子悬浮液混合，共培养；(4)选择性培养，筛选黑孢块菌转化子，鉴定，即得。
2. 按照权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于：步骤（1)所述黑孢块菌孢子悬 浮液中孢子浓度为104-108个/mL，优选为10 6个/mL。
3. 按照权利要求1或2所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤（1)所述制备黑孢块菌 孢子悬浮液，包括：（a)将黑孢块菌菌丝体接种于PDA培养基，于28°C培养活化；优选的，活 化3d ; (b)将活化后的黑孢块菌菌丝体接种于VBC培养基，28°C培养4-9d，优选为7d ;用无 菌水洗涤菌丝体，收集黑孢块菌的孢子，稀释，即得。
4. 按照权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤（2)所述制备菌液包括： (a)挑取根癌农杆菌阳性转化子，接种到含抗生素的LB培养基中，28°C 200rpm震荡培养 12-20h，离心，收集菌体；(b)用頂培养基重悬菌体，离心，收集菌体；（c)用頂培养基重悬 菌体，将菌体浓度〇D6(i(i调至0. 1?0. 6,28°C 200rpm振荡培养3-8h，即得。
5. 按照权利要求4所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤（2)所述制备菌液包括： (a)挑取根癌农杆菌阳性转化子，接种到含抗生素的LB培养基中，28°C 200rpm震荡培养 18h，离心，收集菌体；(b)用頂培养基重悬菌体，离心，收集菌体；（c)用頂培养基重悬菌 体，将菌体浓度〇D6(l(l调至0. 15?0. 3,28°C 200rpm振荡培养6h，即得。
6. 按照权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于：步骤（3)将步骤（2)制备的菌 液与步骤（1)制备的黑孢块菌孢子悬浮液等体积混合；所述共培养的培养基为铺有硝酸纤 维素薄膜的CM培养基；共培养条件为28°C避光培养24-60h，优选为48h。
7. 按照权利要求4、5或6所述的遗传转化方法，其特征在于：所述IM培养基或共培养 的培养基中含有乙酰丁香酮；优选的，所述乙酰丁香酮的浓度为200mmol/L。
8. 按照权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于：步骤（4)所述选择性培养是将 步骤（3)共培养后的硝酸纤维素薄膜揭下，正向铺到含抗生素的PDA培养基，28°C培养至出 现可见的单菌落。
9. 按照权利要求4、5或8所述的遗传转化方法，其特征在于：所述抗生素选自头孢霉 素、潮霉素或卡那霉素。
【文档编号】C12N15/80GK104450767SQ201410788066
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月17日 优先权日:2014年12月17日
【发明者】汤亚杰, 贾开志, 徐阳华, 张权 申请人:湖北工业大学