一种提高尼莫克汀发酵产量的方法
【专利摘要】一种提高尼莫克汀发酵产量的方法，包括以下步骤：A、选取出发菌株；B、菌株斜面培养；C、菌株种瓶培养；D、种子罐培养；E、发酵罐培养。本发明的一种提高尼莫克汀发酵产量的方法，通过在发酵中后期单次或多次补加乙酸钠，实现了尼莫克汀产量的大幅度提升。
CGMCC No.6217
20120614
【专利说明】一种提高尼莫克订发酵产量的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及尼莫克汀的发酵生产，具体涉及一种提高尼莫克汀发酵产量的方法。
【背景技术】
[0002]尼莫克汀是由产色链霉菌或者蓝灰链霉菌发酵产生的一种十六元环大环内酯类抗生素，它主要用于合成亲脂性更强的莫西克汀。尼莫克汀主要用于合成活性更强的农药兽药莫西克汀(Moxidectin)。莫西克汀20世纪80年代中期以来开始作为兽用驱虫药使用，能够高效的杀灭线虫和体表寄生虫，同时对动物有很好的安全性，是目前被广泛用于兽医临床的广谱、高效、新型大环内酯类驱虫抗生素。
[0003]现有技术中尼莫克汀的产量低，远远不能满足工业需求。现有技术中提高尼莫克汀的方法有选取高产的菌株、补糖、添加氨基酸或其它营养成分等等，例如，申请号为201110242857.0的专利《一种发酵生产尼莫克汀的方法》中公开了 “在发酵生产尼莫克汀的过程中，当发酵液中的总糖浓度低于30g/L时，通过向发酵液间歇或连续补加糖类物质，使发酵液中的总糖浓度控制在10_40g/L进行发酵”，通过间隙或连续补糖来提高尼莫克汀的产量，但是其效果依然不理想，在发酵过程中存在葡萄糖代谢阻遏效应，而葡萄糖对尼莫克汀的产量有着关键性的影响，因而，虽然可通过补糖来提高尼莫克汀产量，但是具有一定的局限性。
【发明内容】
[0004]本发明为解决现有技术中尼莫克汀的产量低、发酵结束时的产量有待提高的技术问题，提供利用一种可以提高尼莫克汀发酵产量的方法。
[0005]本发明为实现其目的采用的技术方案是:
[0006]一种提高尼莫克汀发酵产量的方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0007]A、选取出发菌株:选取一株乙酸钠抗性产色链霉菌突变株，所述的一株乙酸钠抗性产色链霉菌突变株的分类名称为产色链霉菌(Streptomyces cyanneorisens)DC18_01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏编号为CGMCC N0.6217，保藏日期为2012年6月14日；
[0008]B、菌株斜面培养:将产色链霉菌(Streptomyces cyanneorisens)DC18-01接种于斜面培养基，于26-30°C、30% -60%湿度条件下培养96_144h，得到斜面菌种；
[0009]C、菌株种瓶培养:挖取2-5cm2步骤B制备的斜面菌种接种于种瓶培养基中，于26-30 0C，220-240rpm震荡培养24_30h，得到成熟种液；
[0010]D、种子罐培养:将步骤C得到的成熟种液以体积比0.05%接种量接种至种子罐培养基中，控制培养温度为27.5-28.5°C，罐压为0.03-0.05MPa，培养过程中的溶氧控制在25%以上，得到种瓶培养液；
[0011]E、发酵罐培养:将步骤D得到的种瓶培养液以体积比10%接种量接种至发酵培养基中，控制发酵罐温度为27.5-28.5°C，罐压为0.03-0.05MPa，发酵液中的溶氧控制在60%以上，葡萄糖浓度控制在0.5-2.0g/mL，在发酵150h之后至少一次向发酵液中补加浓度为10-20mg/L的乙酸钠溶液，共补加1-2%体积比的乙酸钠，在发酵260_280h停止补糖，当葡萄糖浓度低于0.2g/mL时停止发酵，制得含有尼莫克汀的发酵液。
[0012]所述的步骤E发酵罐培养过程中在发酵开始后168h补入乙酸钠溶液。
[0013]所述的步骤E发酵罐培养过程中在发酵开始后168h、216h补入乙酸钠溶液。
[0014]所述的步骤E发酵罐培养过程中在发酵开始后156h、192h和228h补入乙酸钠溶液。
[0015]步骤B所述的斜面培养基成分及用量(g/100mL)为:葡萄糖0.3_0.5、麦芽糖0.1-0.15、酵母膏或酵母粉0.3-0.5、淀粉0.4-0.6、黄豆饼粉0.4-0.6、糊精0.4-0.6、磷酸氢二钾 0.01-0.03、琼脂 1-2。
[0016]步骤C所述的种瓶培养基成分及用量(g/100mL)为:葡萄糖0.5_2、糊精1_3、黄豆饼粉1-2、酵母膏或酵母粉1-2、硫酸镁0.05-0.2、磷酸氢二钾0.05-0.2。
[0017]步骤D所述的种子罐培养基成分及用量(g/100mL)为:葡萄糖2_3、黄豆饼粉1_2、酵母膏或酵母粉1-2、硫酸镁0.05-0.2、磷酸氢二钾0.05-0.2。
[0018]步骤E所述的发酵培养基的成分及用量(g/100mL)为:葡萄糖4_6，黄豆饼粉2.5-3.5，酵母粉 0.3-0.5，硫酸镁 0.8-1.2，碳酸钙 0.2-0.4。
[0019]本发明的有益效果是:本发明的一种提高尼莫克汀发酵产量的方法，通过在发酵中后期单次或多次补加乙酸钠，实现了尼莫克汀产量的大幅度提升。在研宄的过程中，面对如何克服发酵液中乙酸钠含量高而对尼莫克汀的合成酶系产生抑制作用的困难时，其中的困惑是难以想象的，我们经过了长期的创造性研宄，克服种种困难，这个过程是艰难的但是其成功性的研宄对尼莫克汀的发展具有重大意义的。
[0020]从尼莫克汀的合成原理上讲，乙酸钠作为尼莫克汀的一种前体物质，其添加量对尼莫克汀的产量起到关键性的作用，乙酸钠被菌丝体利用后产生NaOH，使发酵液pH值升高，而发酵液PH值过高不仅不利于菌体的生长，而且抑制尼莫克汀的合成，从图1现有技术乙酸钠对尼莫克汀产量影响规律的研宄中表明乙酸钠添加量从0-0.2%时，尼莫克汀产量持续上升，当乙酸钠添加量超过0.2%时，菌体浓度下降，尼莫克汀的产量也急剧下降，原因在于发酵液中乙酸钠浓度升高对尼莫克汀的合成酶系产生抑制作用。而我们通过长期的研宄，打破常规，增加乙酸钠的添加量，本以为会因为高添加量的乙酸钠对尼莫克汀的合成酶系产生抑制作用，出乎意料的，尼莫克汀的产量不仅没有下降，反而有了大幅度的提升，克服了现有技术乙酸钠添加量超过0.2%尼莫克汀的产量急剧下降的技术偏见。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1是乙酸钠对尼莫克汀产量的影响规律
【具体实施方式】
[0022]本发明为解决现有技术中尼莫克汀的产量低、发酵结束时的产量有待提高的技术问题，提供利用一种可以提高尼莫克汀发酵产量的方法。下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0023]实施例1.1.5T发酵罐发酵过程中不补加乙酸钠
[0024]A、选取出发菌株:选取一株乙酸钠抗性产色链霉菌突变株，所述的一株乙酸钠抗性产色链霉菌突变株的分类名称为产色链霉菌(Streptomyces cyanneorisens)DC18-01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏编号为CGMCC N0.6217，保藏日期为2012年6月14日；
[0025]B、菌株斜面培养:将产色链霉菌(Streptomyces cyanneorisens)DC18-01接种于斜面培养基，于26-30°C、30% -60%湿度条件下培养96_144h，得到斜面菌种；
[0026]C、菌株种瓶培养:挖取2-5cm2步骤B制备的斜面菌种接种于种瓶培养基中，于26-30 0C，220-240rpm震荡培养24_30h，得到成熟种液；
[0027]D、种子罐培养:将步骤C得到的成熟种液以体积比0.05%接种量接种至种子罐培养基中，控制培养温度为27.5-28.5°C，罐压为0.03-0.05MPa，培养过程中的溶氧控制在25%以上，得到种瓶培养液；
[0028]E、发酵罐培养:在1.5T发酵罐中配置0.9T发酵培养基，120°C灭菌20min后冷却至27.5-28.5°C，将步骤D得到的种瓶培养液以体积比10%接种量接种至发酵培养基中，控制发酵罐温度为27.5-28.5°C，罐压为0.03-0.05MPa，发酵过程中溶氧控制在60%以上，葡萄糖浓度控制在0.5-2.0g/mL，在发酵260h停止补糖，当葡萄糖浓度低于0.2g/mL时停止发酵，制得含有尼莫克汀的发酵液，测定最后发酵产量为2560mg/L。
[0029]实施例2.1.5T发酵罐发酵过程中发酵开始后168h补加乙酸钠
[0030]A、选取出发菌株:选取一株乙酸钠抗性产色链霉菌突变株，所述的一株乙酸钠抗性产色链霉菌突变株的分类名称为产色链霉菌(Streptomyces cyanneorisens)DC18-01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏编号为CGMCC N0.6217，保藏日期为2012年6月14日；
[0031]B、菌株斜面培养:将产色链霉菌(Streptomyces cyanneorisens)DC18-01接种于斜面培养基，于26-30°C、30% -60%湿度条件下培养96_144h，得到斜面菌种；
[0032]C、菌株种瓶培养:挖取2-5cm2步骤B制备的斜面菌种接种于种瓶培养基中，于26-30 0C，220-240rpm震荡培养24_30h，得到成熟种液；
[0033]D、种子罐培养:将步骤C得到的成熟种液以体积比0.05%接种量接种至种子罐培养基中，控制培养温度为27.5-28.5°C，罐压为0.03-0.05MPa，培养过程中的溶氧控制在25%以上，得到种瓶培养液；
[0034]E、发酵罐培养:在1.5T发酵罐中配置0.9T发酵培养基，120°C灭菌20min后冷却至27.5-28.5°C，将步骤D得到的种瓶培养液以体积比10%接种量接种至发酵培养基中，控制发酵罐温度为27.5-28.5°C，罐压为0.03-0.05MPa，发酵过程中溶氧控制在60%以上，葡萄糖浓度控制在0.5-2.0g/mL，在发酵开始后168h补入10L浓度为10mg/L的乙酸钠溶液，在发酵260h停止补糖，当葡萄糖浓度低于0.2g/mL时停止发酵，制得含有尼莫克汀的发酵液，测定最后发酵产量为2980mg/L。
[0035]实施例3.12T发酵罐发酵过程中发酵开始后168h、216h补加乙酸钠A、选取出发菌株:选取一株乙酸钠抗性产色链霉菌突变株，所述的一株乙酸钠抗性产色链霉菌突变株的分类名称为产色链霉菌(Streptomyces cyanneorisens)DC18-01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏编号为CGMCC N0.6217，保藏日期为2012年6月14日；
[0036]B、菌株斜面培养:将产色链霉菌(Streptomyces cyanneorisens)DC18-01接种于斜面培养基，于26-30°C、30% -60%湿度条件下培养96_144h，得到斜面菌种；
[0037]C、菌株种瓶培养:挖取2-5cm2步骤B制备的斜面菌种接种于种瓶培养基中，于26-30 0C，220-240rpm震荡培养24_30h，得到成熟种液；
[0038]D、种子罐培养:将步骤C得到的成熟种液以体积比0.05%接种量接种至种子罐培养基中，控制培养温度为27.5-28.5°C，罐压为0.03-0.05MPa，培养过程中的溶氧控制在25%以上，得到种瓶培养液；
[0039]E、发酵罐培养:在12T发酵罐中配置7.5T发酵培养基，120°C灭菌20min后冷却至27.5-28.5°C，将步骤D得到的种瓶培养液以体积比10%接种量接种至发酵培养基中，控制发酵罐温度为27.5-28.5°C，罐压为0.03-0.05MPa，发酵过程中溶氧控制在60%以上，葡萄糖浓度控制在0.5-2.0g/mL,在发酵开始后168h和216h时分别补入50L和70L浓度为15mg/L的乙酸钠溶液，在发酵276h停止补糖，当葡萄糖浓度低于0.2g/mL时停止发酵，制得含有尼莫克汀的发酵液，测定最后发酵产量为3343mg/L。
[0040]实施例4.12T发酵罐发酵过程中发酵开始后156h、192h和228h补加乙酸钠
[0041]A、选取出发菌株:选取一株乙酸钠抗性产色链霉菌突变株，所述的一株乙酸钠抗性产色链霉菌突变株的分类名称为产色链霉菌(Streptomyces cyanneorisens)DC18-01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏编号为CGMCC N0.6217，保藏日期为2012年6月14日；
[0042]B、菌株斜面培养:将产色链霉菌(Streptomyces cyanneorisens)DC18-01接种于斜面培养基，于26-30°C、30% -60%湿度条件下培养96_144h，得到斜面菌种；
[0043]C、菌株种瓶培养:挖取2-5cm2步骤B制备的斜面菌种接种于种瓶培养基中，于26-30 0C，220-240rpm震荡培养24_30h，得到成熟种液；
[0044]D、种子罐培养:将步骤C得到的成熟种液以体积比0.05%接种量接种至种子罐培养基中，控制培养温度为27.5-28.5°C，罐压为0.03-0.05MPa，培养过程中的溶氧控制在25%以上，得到种瓶培养液；
[0045]E、发酵罐培养:在12T发酵罐中配置7.5T发酵培养基，120°C灭菌20min后冷却至27.5-28.5°C，将步骤D得到的种瓶培养液以体积比10%接种量接种至发酵培养基中，控制发酵罐温度为27.5-28.5°C，罐压为0.03-0.05MPa，发酵过程中溶氧控制在60%以上，葡萄糖浓度控制在0.5-2.0g/mL，在发酵开始后156h、192h和228h时分别补入60L、40L和60L浓度为20mg/L的乙酸钠溶液，在发酵264h停止补糖，当葡萄糖浓度低于0.2g/mL时停止发酵，制得含有尼莫克汀的发酵液，测定最后发酵产量为3690mg/L。
【权利要求】
1.一种提高尼莫克汀发酵产量的方法，其特征在于，包括以下步骤: A、选取出发菌株:选取一株乙酸钠抗性产色链霉菌突变株，所述的一株乙酸钠抗性产色链霉菌突变株的分类名称为产色链霉菌(Streptomyces cyanneorisens)DC18_01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏编号为CGMCC N0.6217，保藏日期为2012年6月14曰； B、菌株斜面培养:将产色链霉菌(Streptomycescyanneorisens)DC18-01接种于斜面培养基，于26-30°C、30% -60%湿度条件下培养96_144h，得到斜面菌种； C、菌株种瓶培养:挖取2-5cm2步骤B制备的斜面菌种接种于种瓶培养基中，于26-30 0C，220-240rpm震荡培养24_30h，得到成熟种液； D、种子罐培养:将步骤C得到的成熟种液以体积比0.05%接种量接种至种子罐培养基中，控制培养温度为27.5-28.5°C，罐压为0.03-0.05MPa，培养过程中的溶氧控制在25%以上，得到种瓶培养液； E、发酵罐培养:将步骤D得到的种瓶培养液以体积比10%接种量接种至发酵培养基中，控制发酵罐温度为27.5-28.5°C，罐压为0.03-0.05MPa，发酵液中的溶氧控制在60%以上，葡萄糖浓度控制在0.5-2.0g/mL，在发酵150h之后至少一次向发酵液中补加浓度为10-20mg/L的乙酸钠溶液，共补加1-2%体积比的乙酸钠，在发酵260_280h停止补糖，当葡萄糖浓度低于0.2g/mL时停止发酵，制得含有尼莫克汀的发酵液。
2.根据权利要求1所述的一种提高尼莫克汀发酵产量的方法，其特征在于:所述的步骤E发酵罐培养过程中在发酵开始后168h补入乙酸钠溶液。
3.根据权利要求1所述的一种提高尼莫克汀发酵产量的方法，其特征在于:所述的步骤E发酵罐培养过程中在发酵开始后168h、216h补入乙酸钠溶液。
4.根据权利要求1所述的一种提高尼莫克汀发酵产量的方法，其特征在于:所述的步骤E发酵罐培养过程中在发酵开始后156h、192h和228h补入乙酸钠溶液。
5.根据权利要求1所述的一种提高尼莫克汀发酵产量的方法，其特征在于:步骤B所述的斜面培养基成分及用量(g/100mL)为:葡萄糖0.3-0.5、麦芽糖0.1-0.15、酵母膏或酵母粉0.3-0.5、淀粉0.4-0.6、黄豆饼粉0.4-0.6、糊精0.4-0.6、磷酸氢二钾0.01-0.03、琼脂1-2。
6.根据权利要求1所述的一种提高尼莫克汀发酵产量的方法，其特征在于:步骤C所述的种瓶培养基成分及用量(g/100mL)为:葡萄糖0.5-2、糊精1-3、黄豆饼粉1_2、酵母膏或酵母粉1-2、硫酸镁0.05-0.2、磷酸氢二钾0.05-0.2。
7.根据权利要求1所述的一种提高尼莫克汀发酵产量的方法，其特征在于:步骤D所述的种子罐培养基成分及用量(g/100mL)为:葡萄糖2-3、黄豆饼粉1_2、酵母膏或酵母粉1-2、硫酸镁 0.05-0.2、磷酸氢二钾 0.05-0.2。
8.根据权利要求1所述的一种提高尼莫克汀发酵产量的方法，其特征在于:步骤E所述的发酵培养基的成分及用量(g/100mL)为:葡萄糖4-6，黄豆饼粉2.5-3.5，酵母粉.0.3-0.5，硫酸镁 0.8-1.2，碳酸钙 0.2-0.4。
【文档编号】C12R1/465GK104450823SQ201410787858
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月18日 优先权日:2014年12月18日
【发明者】李明, 杨丽锋 申请人:河北圣雪大成制药有限责任公司