专利名称：一种中国被毛孢发酵菌粉提取物的制备及其在防治肾衰竭上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药技术领域。具体涉及中国被毛孢发酵菌粉提取物的制备方法及其 在防治肾衰竭上的应用。
背景技术：
冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis (Berk) G. H. Sung，J. M. Sung，Hywel-Jones & Spatafora)系中国著名中药材。该药材是真菌寄生于蝙蝠蛾幼虫后的产物。冬虫夏草的 “草”是该菌的繁殖器官-子座，虫尸内的菌丝体是它的菌核。这种既有“虫”又有“草”的 冬虫夏草，目前尚不能人工栽培。但从冬虫夏草中分离的真菌，已能用现代生物工程技术进 行发酵培养，所得产品为该菌的发酵菌粉。该真菌的拉丁学名为中国被毛孢(Hirsutella sinensis Liu, Guo, Yuet Zeng),俗禾尔冬虫夏草菌(Yang QY et al Chinese Journal of Grassland, Vol. 32，supp. 79-85,2010)。
目前，已用中国被毛孢发酵菌粉开发成《百令胶囊》中成药，它具有和天然冬虫夏 草相似的补肺益肾功效(中华人民共和国药典2010年版p. 681-682，2010)。
肾衰竭(renal failure)是一类由多种因素引起的肾功能低下疾病。包括急性肾 衰竭(ARF)和慢性肾衰竭(CRF)。肾衰竭的特征性检验指标，是患者的血清肌酐(SCr)和血 尿素氮(BUN)含量异常升高；另外，其肾衰竭相关因子，如转化生长因子(TGFi31)、金属蛋 白酶组织抑制物I(TIMP-I)、纤溶酶原激活抑制物I(PAI-I)和内皮素(ET)等的mRNA表达 水平明显上调(J Am Soc Nephrol. 2006，17 :2484-2494.，2005. 16 :133-143)。肾衰竭患者 的肾结构都有不同程度的变性，肾功能部分或全面低下。包括肾小球及肾小管间质纤维化， 滤过率降低；肾上皮细胞线粒体变形，浓缩尿液能力丧失，体内毒素和代谢物潴溜等。肾功 能严重丧失者必需施行肾移植或血透析治疗。但肾移植存在排异风险，血透析常有并发症， 两者又给患者带来沉重的经济负担。
《百令胶囊》的主要成分为中国被毛孢发酵菌粉。该产品对多种肾脏疾病有明確的 冶疗效果。如它能使IgA肾病患者的血尿转阴(中医研究，第15卷，第4期，26-27,2002)； 也能明显改善慢性肾炎患者的血肌酐、尿素氮和蛋白尿等指标(中国综合临床，第22卷，第 6期，514-515，2006)。但《百令胶囊》内含物的溶解性差，服用剂量大，每日需吞服45颗。 同时，其发酵菌粉中常混杂有蚕蛹粉等高脂类成分，易氧化产膻，保存期短。此外，《百令胶 囊》作为中成药，无重金属限量要求，有碍于在国际保健食品市场上推广。发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种中国被毛孢发 酵菌粉提取物，使其重金属含量低、溶解性好、产品不易氧化，服用剂量小，能用于肾衰竭的 预防和治疗的中成药或保健食品。
本发明提供一种中国被毛孢发酵菌粉提取物。该品由冬虫夏草发酵菌粉提取。其3理化特性为褐色粉末，能全溶于水或乙醇。用中国国家药典委员会推荐的中药指纹图谱测 定，本提取物的HPLC色谱峯和天然冬虫夏草的叠合一致，两者的相似率大于90% ；本提取 物的虫草腺苷、虫草酸和虫草多糖含量均比原发酵菌粉高2 10倍。经食品卫生检测，本 发明提取物无农药检出，其汞、铅、砷、镉、铬、镍、饧、铜等重金属含量均低于国际食品卫生 相应标准。
本发明所用的生产原料-冬虫夏草发酵菌粉，可通过市售得到，质量标准应达到 中华人民共和国药典2010年一部第681-682页《百令胶囊》项下要求。该品的生产种为中 国被毛孢(又名中华被毛孢)，拉丁学名为Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yu & Zeng。
本发明的另一目的是提供了上述中国被毛孢发酵菌粉提取物的制备方法先将中 国被毛孢发酵菌粉加溶剂湿润0. 5 1. 0小時。然后经回流提取提取1 2次，每次提取 時间为1 4小時，固液分离得提取液1。殘渣再加溶剂回流提取，固液分离，得提取液2。 合并提取液1和2，经减压浓缩得浓缩液，浓缩液再经干燥即得。
提取所用的溶剂为水或乙醇，水为无离子水，其电导率小于20ys/cm，乙醇为食用 级，浓度为10% 90%。溶剂的加量为发酵菌粉的5 15倍(w/w)。用水提取的温度为 950C 100°C，用乙醇提取的温度为80°C 90°C。殘渣再用水或乙醇再提取1 2次，每次 提取時间为1 4小時。提取液减压浓缩的真空条件为0. 1 0. 09Mpa，温度为60 80°C， 所得浓缩液的比密度为1. 04 1. 10。浓缩液经低温冷冻干燥或喷雾干燥，即得本提取物。
本发明又一目的是提供了上述一种中国被毛孢发酵菌粉提取物在制备预防和治 疗肾衰竭药物中的应用。
本发明提取物经药理活性检验，具有显著的抗肾衰竭活性，0.2 1.0g/Kg剂量 的提取物能显著降低肾衰竭鼠的血肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)含量，改善由庆大霉素导 致的肾组织变性；逆转由马兜铃酸导致的肾小管上皮细胞增殖抑制，下调肾衰竭关键因子 (TGF^ U TIMP-U PAI-U ET)的mRNA表达。结果显示可用于肾衰竭疾病的预防和治疗。
本发明中国被毛孢发酵菌粉提取物的重金属含量均低于国际食品卫生标准，也无 农药殘留，能全溶于水或乙醇，提取物也不含培养基殘渣，产品不易氧化产膻，保存期长。本 提取物中的功效比中国被毛孢发酵菌粉高2 10倍，服用剂量可大大减小，便于患者应用， 可用于肾衰竭疾病的预防和治疗。
本发明中国被毛孢发酵菌粉提取物可作为活性成份与药用辅料制成的颗粒剂，胶 囊齐U、片剂，也可制成口含片、口服液和酊剂等剂型。
图1.中国被毛孢发酵菌粉提取物和天然冬虫夏草的色谱指纹图谱，图中上为天 然冬虫夏草，下为中国被毛孢发酵菌粉提取物，示两者的HPLC色谱峯基本叠合一致。
图2.正常对照组肾单位结构正常，肾小球毛细血菅完好，球囊腔清晰可见，肾小 管上皮细胞未见变性或坏死。间质未见出血或炎细胞浸润。HEX200
图3.模型组肾单位结构基本正常，肾小球血管轻度充血，球囊腔内有血浆纤维 蛋白渗出。肾小管上皮中度空泡或水肿变性，见中度灶性坏死，中度灶性血红蛋白或颗粒管 型。间质有轻度充血或炎细胞浸润。HE X 200
图4.受试药(发酵菌粉提取物)高剂量组肾单位结构基本正常，肾小球血管轻度充血其内细胞未见增多，囊腔内未见血浆纤维蛋白渗出。肾小管上皮轻度空泡或水肿变 性，见轻度灶性坏死，轻度灶性血红蛋白或颗粒管型。间质未见充血或炎细胞浸润。HEX 200具体实施方式
以下实施例所用的中国被毛孢发酵菌粉通过市售得到，质量标准应达到中华人民 共和国药典2010年一部第681-682页《百令胶囊》项下要求。
实施例1.中国被毛孢发酵菌粉提取物的制备
中国被毛孢发酵菌粉lOOKg，加无离子水(其电导率为15 μ/cm)
lOOOKg，浸润半小时后，在中药提取罐中回流提取3小时，提取温度95 100°C， 固液分离后得提取液-1。残渣再加500Kg无离子水，在95 100°C下回流提取2小时，抽 滤后得提取液-2。合并提取液-1和提取液_2，在旋转式薄膜真空器下减压浓缩得浓缩液。 浓缩液的比密度为1. 04。将上述浓缩液，置零下18°C冷冻M小时，然后在冷冻干燥机上冷 冻干燥。冷阱温度零下^°C，真空度30mtOr，干燥M-36小时后即得中国被毛孢发酵菌 粉的水提取物20 30Kg，编号为HsW。
另取中国被毛孢发酵菌粉lOOKg，用90%医用酒精取代无离子水，按上述提取、浓 缩和干燥，得中国被毛孢发酵菌粉的醇提取物10 MKg，编号为HsE。
实施例2中国被毛孢发酵菌粉提取物和中国被毛孢发酵菌粉的检测比较
将中国被毛孢发酵菌粉和实施例1制备的中国被毛孢发酵菌粉提取物(HsW)作虫 草腺苷(以腺苷计)、虫草酸(以甘露醇计)和虫草多糖(以葡聚糖计)的比较测定。结果 提取物比发酵菌粉的含量分别提高6. 7,8. 6和3. 0倍。表1
将上述提取物再作农药残留和重金属含量测定。结果本品未见农药检出，其重金 属含量亦低于国际食品卫生限量标准。表2
用国家药典委员会推荐的中药指纹图谱测定，本提取物的HPLC色谱峯和天然冬 虫夏草的色谱峯基本叠合一致，两者的相似率大于90%。图1
表1.中国被毛孢发酵菌粉提取物(HsW)活性成分测定中国被毛孢发酵活性成分实施例1提取物_mm_
虫草腺苷 mg/100g4.127.4虫草酸 g/100g1.714.6虫草多糖 g/100g7. 522. 7
表2.中国被毛孢发酵菌粉提取物(HsW)农药残留和重金属含量测定
权利要求
1.一种中国被毛孢发酵菌粉提取物，其特征在于，所述提取物为褐色粉末，能全溶于水 或乙醇；提取物的HPLC色谱峯和天然冬虫夏草的叠合一致。
2.如权利要求1所述中国被毛孢发酵菌粉提取物的制备方法，其特征在于，该提取物 的原料为中国被毛孢发酵菌粉；提取方法为先向原料加溶剂湿润0. 5 1. 0小時，然后经回 流提取1 2次，每次提取時间为1 4小時，提取液通过离心或抽滤固液分离得提取液1 ； 殘渣再加溶剂回流提取，提取液通过离心或抽滤固液分离，得提取液2，合并提取液1和2， 经减压浓缩得浓缩液，浓缩液再经干燥得中国被毛孢发酵菌粉提取物。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述溶剂为水或乙醇，溶剂的加量为原料中 国被毛孢发酵菌粉的重量配比为5 15倍w/w。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述溶剂水为无离子水，其电导率小于 20μ s/cm，提取温度为95°C 100°C。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述溶剂乙醇为食用级，浓度为10% 90%，用乙醇提取的温度为80°C 90°C。
6.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述分离提取液1后的固体殘渣用水或乙醇 再回流提取1 2次，每次提取時间为1 4小時，回流提取后固液分离得提取液2，合并提 取液1和2，减压浓缩時的真空条件为0. 1 0. 09Mpa，温度为60 80°C。
7.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述浓缩液的比密度为1.04 1. 10。
8.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述浓缩液经低温冷冻干燥或喷雾干燥得 提取物。
9.如权利要求1所述中国被毛孢发酵菌粉提取物在制备预防和治疗肾衰竭药物中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述药物为中国被毛孢发酵菌粉提取物作 为活性成份与药用辅料制成的颗粒剂，胶囊剂、片剂、口含片、口服液或酊剂。
全文摘要
本发明提供了一种中国被毛孢发酵菌粉提取物。本提取物的重金属含量均低于国际食品卫生标准，也无农药殘留，能全溶于水或乙醇，提取物也不含培养基殘渣，产品不易氧化产膻，保存期长。本提取物具有显著的抗肾衰竭活性，0.2～1.0g/Kg剂量的提取物能显著降低肾衰竭鼠的血肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)含量，改善由庆大霉素导致的肾组织变性；逆转由马兜铃酸导致的肾小管上皮细胞增殖抑制，下调肾衰竭关键因子(TGFβ1、TIMP-1、PAI-1、ET)的mRNA表达等功效，比中国被毛孢发酵菌粉高2～10倍，服用剂量可大大减小，便于患者应用，可用于肾衰竭疾病的预防和治疗。本发明中国被毛孢发酵菌粉提取物可作为活性成份与药用辅料制成颗粒剂，胶囊剂、片剂，也可制成口含片、口服液和酊剂等剂型。
文档编号A23L1/28GK102038719SQ20101053057
公开日2011年5月4日 申请日期2010年11月3日 优先权日2010年11月3日
发明者杨庆尧 申请人:上海芝草生物技术有限公司