一种提高马齿苋多糖的方法及该方法制备的发酵液的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高马齿苋多糖含量的方法，它包括如下步骤：(1)取马齿苋干粉，添加5～20倍重量的水，混匀，再加入硝酸铵和硫酸锌至终浓度分别为2％和0.5％，灭菌；(2)按照2～10％的接种量接种枯草芽孢杆菌菌液，于100～250r/min、37℃下发酵培养2～6天，离心，过滤，得滤液，即可。本发明还提供了前述方法制备的发酵液。本发明方法制备的马齿苋发酵液中马齿苋多糖含量高，可制成各种制剂，临床应用前景优良。
【专利说明】一种提高马齿苋多糖的方法及该方法制备的发酵液
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种发酵马齿苋提高多糖含量的方法及该方法制备的发酵液。
【背景技术】
[0002]马齿苋属马齿苋科的一年生肉质草本植物，又名长命菜、五行草、瓜子菜等，除高寒地区外世界各地均有分布。我国的马齿苋资源十分丰富，对马齿苋的利用有着悠久的历史，在南北朝时期对其功能就有记载。在我国现行的国家法定标准中，马齿苋收载于《中国兽药典》二部，具有清热解毒，凉血止痢的功效。现代药理研究表明马齿苋具有抗衰老、治疗糖尿病、降血脂、预防冠心病、预防高血压、预防肥胖症、抑制肿瘤细胞生长及提高机体免疫能力的功能。马齿苋含有丰富的多糖，在9月初含量最高，可达11.6%，主要由阿拉伯糖、木糖、果糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖等组成。研究表明，马齿苋多糖是马齿苋的主要功能成分之一。
【发明内容】
[0003]本发明提供了一种提高马齿苋多糖含量的发酵方法以及该方法制得的发酵液。
[0004]一种发酵马齿苋的方法，它包括如下步骤:
[0005](1)取马齿苋干粉，添加5?20倍重量的水，混匀，再加入硝酸铵和硫酸锌至终浓度分别为2%和0.5%，灭菌；
[0006](2)按照2?10%的接种量接种枯草芽孢杆菌菌液，于100?250r/min、37°C下发酵培养2?6天，离心，过滤，得滤液，即可。
[0007]步骤(1)中，马齿苋干粉的粒径不大于60目。
[0008]步骤(1)中，所述水的添加量是马齿苋干粉重量的10倍。
[0009]步骤⑴中，装量为30%。装量，是指将水添加到发酵容器中时，水体积与容器体积的比值。
[0010]步骤(2)中，所述接种量为8%。
[0011]步骤(2)中，所述转速为200r/min。
[0012]步骤⑵中，所述发酵培养的时间是4天。
[0013]步骤(2)中，发酵时，装量为30%。
[0014]步骤⑵中，所述枯草芽孢杆菌菌液中，枯草芽孢杆菌的浓度为lX107-lX109cfu/mlo
[0015]所述枯草芽孢杆菌菌液按照如下方法制备:取枯草芽孢杆菌，接种到液体肉汤培养基中，于150r/min、37°C下培养24h，即得。
[0016]本发明还提供了前述发酵提取方法制得的提取液。其中的马齿苋多糖含量以原生药计为21.46%。将该发酵液离心，过滤，得滤液，滤液制成各种口服制剂，包括为散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、微囊剂、颗粒剂、饼剂或液体药剂。
[0017]综上，本发明方法可以提高马齿苋多糖的含量，制得的发酵液马齿苋多糖含量高，临床应用前景优良。
[0018]下面通过【具体实施方式】对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1装量优选结果；
[0020]图2料水比优选结果；
[0021]图3转速优选结果；
[0022]图4发酵时间优选结果；
[0023]图5接种量优选结果。
【具体实施方式】
[0024]枯草芽孢杆菌粉，购自购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号1.1661。
[0025]液体肉汤培养基，每升包含如下成分:蛋白胨1g牛肉膏3g氯化钠5g蒸馏水100mL, ρΗ7.4。
[0026]实施例1本发明发酵方法
[0027]一、实验方法
[0028]I 材料
[0029]枯早牙抱杆囷，购自购自中国普通微生物囷种保减中心，编号1.1661 ；
[0030]马齿苋，60°C烘干，粉碎，过60目筛。
[0031]2实验方法
[0032]2.1菌种活化
[0033]在无菌条件下，将购回的菌粉按说明书比例，用事先灭菌的蒸馏水充分溶解，接种菌溶液到琼脂培养基上，置于电热恒温培养箱中于37°C下活化12h。
[0034]2.2种子液的制备
[0035]挑取菌落转接到装有10mL液体肉汤培养基的250mL三角瓶中上，盖上封口膜，置于电热恒温振荡培养箱中于150r/min，37°C下培养24 h，得菌液浓度为107_9cfu/ml的枯草芽孢杆菌菌液，备用。
[0036]2.3发酵条件
[0037]称取7.5g的马齿苋干粉于250ml三角瓶，加75ml蒸馏水，混匀，按质量体积比加入硝酸氨2%，硫酸锌0.5%，121°C高压灭菌20 min，按照8%的接种量添加枯草芽孢杆菌种子液，37°C,200rpm摇床发酵4天，离心，过滤，得滤液，即可。
[0038]3、检测
[0039]用苯酚硫酸法测定多糖含量，含量以每g原生药计。
[0040]4、检测结果
[0041]经检测，制备得到的发酵液马齿苋多糖含量为21.46%。
[0042]也就是说，以马齿苋为原料，采用本发明发酵方法发酵，每Ig马齿苋可以制备得到0.2146g马齿苋多糖，是马齿苋所含天然多糖的1.85倍。
[0043]实验结果说明，本发明发酵方法可以有效提高马齿苋多糖的含量。
[0044]实施例2本发明发酵提取方法的参数筛选
[0045]一、实验方法
[0046]1 材料
[0047]枯草芽孢杆菌，购自购自中国普通微生物菌种保藏中心，编号1.1661 ；
[0048]马齿苋，60°C烘干，粉碎，过60目筛。
[0049]2实验方法
[0050]2.1菌种活化
[0051]在无菌条件下，将购回的菌粉按说明书比例，用事先灭菌的蒸馏水充分溶解，接种菌溶液到琼脂培养基上，置于电热恒温培养箱中于37°C下活化12h。
[0052]2.2种子液的制备
[0053]挑取菌落转接到装有100mL肉汤液体培养基的250 mL三角瓶中上，盖上封口膜，置于电热恒温振荡培养箱中于150r/min, 37°C下培养24 h,得菌液浓度为107_9cfu/ml的枯草芽孢杆菌菌液，备用。
[0054]2.3发酵条件
[0055]称取马齿苋干粉，加适量蒸馏水浸泡，按质量体积比加入硝酸氨2 %，硫酸锌0.5%，121°C高压灭菌20 min，添加枯草芽孢杆菌种子液，37°C、200rpm摇床发酵。
[0056]2.3.1不同装量对多糖含量的影响
[0057]取等量马齿苋干粉于250ml三角瓶中，分别添加50ml、75ml、100ml、125ml、150ml不等的蒸馏水，灭菌。接种种子液于37°C温度下摇床培养数日。
[0058]2.3.2不同料水比对多糖含量的影响
[0059]分别以1:5,1:10, 1:15，1:20等料水比浓度30%装量进行发酵。
[0060]2.3.3不同转速对多糖含量的影响
[0061]采用100，150, 200, 250 r/min 不同转速发酵。
[0062]2.3.4不同发酵时间对多糖含量的影响
[0063]分别发酵2、3、4、5、6 d后测定溶液多糖含量。
[0064]2.3.5不同接种量对多糖含量的影响
[0065]将制备好的枯草芽胞杆菌种子液种按照4^6^8^10% (V/V)的接种量在无菌条件下添加然后发酵。
[0066]二、实验结果
[0067]2.3.1不同装量对多糖含量的影响
[0068]如图1所示，装量为75ml时，明显优于其他比例，即本发明发酵方法，装量优选为75/250 = 30%。
[0069]2.3.2不同料水比对多糖含量的影响
[0070]如图2所示，料水比1:10时，多糖含量最高，即本发明发酵方法的料水比优选为1:10。
[0071]2.3.3不同转速对多糖含量的影响
[0072]如图3所示，转速200r/min时多糖含量最高，即本发明发酵方法的转速优选为200r/mino
[0073]2.3.4不同发酵时间对多糖含量的影响
[0074]如图4所示，结果随发酵时间的增加，发酵后马齿苋多糖的含量先增加后降低，之后趋于平稳，且发酵时间在4 d时，马齿苋发酵后多糖的含量较高，因此本发明发酵方法的发酵时间优选为4 d。
[0075]2.3.5不同接种量对多糖含量的影响
[0076]如图5所示，测定发酵后多糖的含量，结果在接菌量小于8%时随着接种量的增力口，发酵后多糖的含量逐渐升高，当接菌量高于8%后，发酵后多糖含量逐渐降低，说明接菌量为8%最佳，因此本发明发酵方法的接种量优选为8%。
[0077]实验结果说明，本发明发酵方法中，装量优选为30% ;料水比优选为1:10 ;转速优选为200r/min ;发酵时间优选为4 d ;接种量优选为8%。
[0078]综上，本发明方法可以使马齿苋多糖含量提高，制得的发酵液可以制成多种制剂，临床应用前景优良。
【权利要求】
1.一种发酵马齿苋提高多糖含量的方法，其特征在于:它包括如下步骤: (1)取马齿苋干粉，添加5?20倍重量的水，混匀，再加入硝酸铵和硫酸锌至终浓度分别为 2% (w/v)和 0.5% (w/v)，灭菌； (2)按照2?10%的接种量接种枯草芽孢杆菌菌液，于100?250r/min、37°C下发酵培养2?6天，离心，过滤，得滤液，即可。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(I)中，马齿苋干粉的粒径不大于60目。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(I)中，所述水的添加量是马齿苋干粉重量的10倍；步骤(I)中，装量为30%。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(2)中，所述接种量为8%(v/v)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(2)中，所述枯草芽孢杆菌菌液中，枯草芽孢杆菌的浓度为I X 17-1 X 109cfu/ml。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述枯草芽孢杆菌菌液按照如下方法制备:取枯草芽孢杆菌，接种到液体肉汤培养基中，于150r/min、37°C下培养24h，即得。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(2)中，所述转速为200r/min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(2)中，所述发酵培养的时间是4天。
9.权利要求1?8任意一项所述发酵方法制得的发酵液。
10.根据权利要求9所述的发酵液，其特征在于:其马齿苋多糖的含量以原生药计为.21.46%。
【文档编号】C12P19/04GK104404103SQ201410788002
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月17日 优先权日:2014年12月17日
【发明者】李超, 杨海涵, 房春林 申请人:成都乾坤动物药业有限公司