专利名称：在西藏八角莲发根中表达外源目的基因的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学、生理学、育种学以及基因工程等领域，涉及一种构建同时携带诱导发根质粒和外源基因表达载体的工程化农杆菌和利用转基因技术获得西藏八角莲转基因发根的方法，也即建立基于西藏八角莲发根的外源基因表达系统的方法。具体涉及工程化农杆菌(同时携带诱导发根质粒和外源基因表达载体)的构建和农杆菌遗传转化西藏八角莲，并获得表达外源基因的西藏八角莲发根的具体程序。
背景技术：
植物次生代谢产物具有极其复杂的化学结构，至今仍没有找到有效的或经济的合成方法。相对于常规细胞培养，发根培养系统具有生长快速、不需外源植物激素、向培养液释放部分代谢产物等优点。由于Ri质粒转化的发根生长快，易于培养，能产生有效成分，可能具有表达完整的代谢通路，为药用植物次生代谢产物的工业化生产提供了广阔前景。随着研究的深入发现，有的次生代谢产物在发根中产量仍然很低，甚至根本就不能产生。这在很大程度上是由于次生代谢产物生物合成涉及多个酶促反应步骤，但每个反应步骤在目标产物的生物合成中的贡献可能不同，其中有的是反应的限速步骤，也即目标产物生物合成的瓶颈。限速反应步骤的存在使得目标产物的积累十分有限，自有采用代谢工程方法在植物组织中过量表达编码限速酶的基因，打破生物合成途径中的瓶颈，才会推动代谢流往目标产物方向流动。采用这种过量表达限速酶基因，从而打破反应瓶颈，达到显著提高目标次生代谢产物的目的，在东莨菪碱、叶酸和青蒿素前体等方面都取得了巨大成功。这些工作都是基于合适的外源基因表达系统而实现的。基于发根的外源基因表达系统是近年来兴起的新型表达系统，在次生代谢工程方面有重要的应用价值和产业化前景。
目前，虽然国内外采用发根农杆菌遗传转化药用植物获得生产次生代谢产物的发根的相关研究较多，但对遗传转化西藏八角莲获得产鬼臼毒素发根和在西藏八角莲发根中表达外源基因的研究仍是空白。西藏八角莲为我国西藏所特有的小檗科植物，含有重要的抗癌(或抑癌)药物成分鬼臼毒素和脱氧鬼臼毒素，对于皮肤癌、宫颈癌有显著疗效，其衍生物对乳癌、子宫癌、结肠癌有一定的治愈功效，具有重要的药用价值和开发利用前景。本发明将构建同时携带诱导发根质粒和外源基因表达载体的工程化农杆菌和利用转基因技术获得西藏八角莲转基因发根，建立基于西藏八角莲发根的外源基因表达系统。该方法为以后将鬼臼毒素生物合成途径中的关键酶基因导入西藏八角莲发根中过量表达，实现其次生代谢工程以及开展产鬼臼毒素植物的分子育种奠定了基础。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种构建同时携带诱导发根质粒和外源基因表达载体的工程化农杆菌的方法，该方法将诱导发根的质粒和外源基因表达载体导入卸甲根癌农杆菌C58C1中，从而获得工程化的农杆菌；在本发明的另一方面，还提供了一种用上述工程化农杆菌遗传转化西藏八角莲，获得表达外源基因的西藏八角莲发根的方法。在实例中该宿主细胞是西藏八角莲。
本发明的技术方案如下一种构建同时携带诱导发根质粒和外源基因表达载体的工程化农杆菌的方法，设计思路是首先在卸甲根癌农杆菌C58C1(含诱导发根的质粒pRiA4)中导入植物高效表达载体，也即外源基因表达载体p1304，从而获得工程化农杆菌。其步骤如下(1)培养C58C1(携带pRiA4)；(2)制备C58C1(携带pRiA4)感受态细菌；(3)外源基因表达载体p1304对C58C1(携带pRiA4)的转化；(4)同时携带pRiA4和p1304的C58C1单克隆的筛选与鉴定。
然后用上面构建的工程菌遗传转化西藏八角莲细胞、组织、器官、植株，通过筛选与分子检测获得转基因西藏八角莲发根。其步骤如下(1)西藏八角莲无菌外植体的获得；(2)活化工程化农杆菌；(3)工程化农杆菌浸染西藏八角莲；(4)工程化农杆菌与西藏八角莲的共培养；(5)西藏八角莲的除菌培养；(6)在适合的条件下培养西藏八角莲转基因发根与继代培养；(7)西藏八角莲转基因发根的分子检测。
在本发明中，术语“在适合的条件下培养西藏八角莲转基因发根”是指对经过鉴定的西藏八角莲转基因发根离体培养，获得其后代。
在本发明中，我们采用基因工程技术构建了同时携带发根诱导质粒pRiA4和外源基因表达载体p1304的工程菌C58C1，用该工程菌遗传转化西藏八角莲，在西藏八角莲发根中实现外源基因的表达，建立了基于西藏八角莲发根的外源基因表达系统，为将鬼臼毒素生物合成途径中的关键酶基因导入西藏八角莲，实现其次生代谢工程以及开展产鬼臼毒素植物的分子育种奠定了基础。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如《分子克隆》(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1构建同时携带发根诱导质粒pRiA4和外源基因表达载体p1304的工程菌C58C11携带发根质粒pRiA4的农杆菌C58C1(农杆菌C58C1是按照1991年由Mozo和Hooykaas建立的方法制备)感受态细胞的制备(1)摇农杆菌至菌液0.D600＝0.5，将菌液冰浴30min；(2)取菌于1.5ml EP管中，4℃5000rpm离心5min，去上清；(3)用抽滤灭菌的0.1M CaCl2(预冷)400ul悬浮菌体(用移液枪轻轻打匀)；(4)冰上放置30min，5000rpm离心5min，去上清；5)用50-100ul预冷的0.1M CaCl2悬浮菌体，4℃保存10h备用。
注C58C1是根癌农杆菌，经“卸甲”改造后，保留辅助质粒，导入pRiA4质粒，具利福平抗性(40mg/L)，改造后的C58C1不再使植物产生冠瘿组织，而是产生发根。
2、同时携带发根质粒pRiA4和外源基因表达载体的工程化农杆菌C58C1的构建(1)一管50-100ul的感受态，加5-10ul质粒p1304，轻轻混匀；(2)冰上放置5min，液氮中放置8min；(3)放入37℃水浴中热激5min；(4)加入400-800ul无抗生素的YEB液体培养基(或LB培养基)，轻轻混匀；振荡培养活化(28℃，200rpm，4-5h)；(5)室温离心(4000rpm，10min)，去上清，余下200ul菌液重悬菌体混匀；(6)将200ul重悬活化菌液均匀涂布到加相应抗生素的YEB固体培养基平板上卡那霉素抗性(Kan′) 100ug/ml利福平抗性(Rif′) 40ug/ml(7)28℃培养箱中倒置培养1-2天至菌落大小适中，挑选抗性单菌落在含相应抗生素的YEB液体培养基中培养。菌液达到一定浓度后做目的基因(潮霉素抗性基因)的PCR检测，潮霉素抗性基因(812bp)的检测使用引物fhygr5’-CGATTTGTGTACGCCCGACAGTC-3’和rhygr5’-CGATGTAGGAGGGCGTGGATATG’-3，退火温度，58℃。对于转化的C58C1还要检测pRiA4质粒上携带的rolB和rolC基因(检测方法与在大肠杆菌中检测目的基因方法类似)。rolB正向引物为frolb5，-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3’，反向引物为rrolb5’-GAAGGTGCAAGCTACCTC TC-3’；rolC正向引物为frolc5’-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3’，反向引物为rrolc5’-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3’。能够同时获得潮霉素抗性基因片段、rolB和rolC基因片段的单克隆菌落为构建好的工程菌，同时携带发根质粒pRiA4和外源基因表达载体的工程化农杆菌C58C1，命名为C58C1-pRiA4-p1304；(8)该工程菌可以用于在西藏八角莲发根中实现外源目的基因的表达。
实施例2西藏八角莲无菌外植体的获得方法一利用外植体建立西藏八角莲无菌外植体采取西藏八角莲根状茎萌发出来的幼芽，流水冲洗1小时；然后用2％(M/V)NaClO溶液浸泡10分钟，用无菌水冲洗3次；再用0.1％(M/V)升汞(HgCl2)溶液浸泡15分钟，用无菌水冲洗6次；然后接种在添加无菌丛生芽诱导培养基中(培养基盛于150ml的三角瓶中，于121℃灭菌20分钟)，该培养基配方为MS基本培养基，添加植物生长调节物2.0mg/L BA(苄基腺嘌呤)，0.3mg/L NAA(萘乙酸)，30g/L蔗糖和0.6g/L PVP(聚乙烯比咯烷酮)调节培养基pH值为5.8，再添加5％琼脂粉。在光照培养箱中培养西藏八角莲的幼芽，培养条件为250℃，12小时光照，光照强度为55μmol.m2.s1。40天后，即可获得无菌的西藏八角莲无菌外植体，等到叶片长到3cm×3cm大小时可用于遗传转化。
方法二利用西藏八角莲种子在无菌条件下萌发获得无菌外植体采取西藏八角莲成熟的种子，用2％(M/V)NaClO溶液浸泡20分钟，用无菌水冲洗3次；再用0.1％(M/V)升汞(HgCl2)溶液浸泡30分钟，用无菌水中洗6次；在无菌条件下去除其坚硬的种皮；将西藏八角莲胚接种在种子萌发培养基上(培养基盛于150ml的三角瓶中，于121℃灭菌20分钟)，该培养基配方为MS基本培养基，添加植物生长调节物1.0mg/L BA(苄基腺嘌呤)，0.1mg/L 2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)，30g/L蔗糖和0.6g/L PVP(聚乙烯吡咯烷酮)调节培养基pH值为5.8，再添加5％琼脂粉。在光照培养箱中培养西藏八角莲的幼芽，培养条件为25℃，黑暗条件下培养。待种子萌动后，改变培养条件为25℃，12小时光照，光照强度为25μmol.m2.s1。等到叶片长到3cm×3cm大小时可用于遗传转化。
实施例3工程化农杆菌遗传转化西藏八角莲获得发根1、用本发明中所述方法构建的工程菌C58C1-pRiA4-p1304遗传转化西藏八角莲。使用前自冰箱取出，接种于50ml YEB液体培养(添加卡那霉素和利福平分别达到终浓度为100mg/L、40mg/L)，28℃，200rpm振荡培养两次；2、第二次活化OD600达0.3时，加100μmol/mL乙酰丁香酮，继续28℃，200rpm振荡培养，OD600达0.6时，室温下4000rpm离心10分钟；3、弃上清，菌体用MS液体培养基(100μmol/mL乙酰丁香酮)悬浮，稀释到原体积的5倍，在28℃，200rpm振荡培养，使菌液浓度达到的OD600＝0.3左右；称转化液；可用于西藏八角莲的遗传转化；1、2、3个步骤称为活化农杆菌；4、取无菌西藏八角莲顶芽、侧芽、叶、茎、根等植物不同部位，将茎切成1cm小段，或将叶片切成2cm2左右，用无菌的解剖刀划以“+”字形伤口，放入上述转化液中，侵染10分钟后取出，用无菌卫生纸吸干，接入添加100μmol/mL乙酰丁香酮的MS固体培养基中共培养2天，培养条件为25℃，黑暗条件下培养。该步骤称农杆菌与西藏八角莲的共培养。
5、共培养结束后转移至无植物生长调节物的MS固体培养基(添加250mg/L头孢菌素以达到除菌的目的)中培养，培养条件为25℃，黑暗条件下培养。10天后，在西藏八角莲受伤的部位开始出现发根。该步骤称为西藏八角莲的除菌培养。
6、待从西藏八角莲转化外植体上诱导出的发根长到2cm左右是，分别切下单条的发根，接种在无植物生长调节物的1/2MS固体培养基上(添加250mg/L头孢菌素以达到除菌的目的；同时添加50mg/L潮霉素用于筛选获得西藏八角蓬转基因发根)继代培养；部分西藏八角莲发根在无植物生长调节物的1/2MS(50mg/L潮霉素)固体培养基上生长的表现出发根特有的形态学特征生长十分迅速、分枝很多、生长失去向地性；其中部分褐化甚至死亡。以后每25天继代培养一次，继代5次后，农杆菌可以去除杆菌；然后仅在1/2MS固体培养基(50mg/L潮霉素)上继代培养方可。最后在含50mg/L潮霉素生长正常的发根为转基因发根。
实施例4西藏八角莲转基因发根的分子检测1、西藏八角莲转基因发根基因组DNA的提取，方法如下1)取少量绝对无菌的西藏八角莲发根，放入1.5ml的Eppendorf管中，加500微升抽提buffer；2)用小玻棒充分研磨后放于60℃水浴50min，其间经常颠倒混匀；3)12000rpm，室温离心10分钟；4)取上清液，加500ul饱和酚[Tris-HCl(pH8.0)饱和，吸取下层]，轻轻混匀，4℃静置5分钟至分层；5)12000rpm，室温离心10min；6)吸上清(约250微升)，加2倍体积的无水乙醇(-20℃储存)，充分混匀，室温静置至DNA析出；
7)8000rpm，4℃离心5分钟；8)用75％的乙醇洗2次，稍离心，吸净残余乙醇，室温放置，使乙醇挥发完全。
9)加50ul TE(100ug/ml RNaseA，50mM Tris.Cl，10mM EDTA，pH8.0)，溶解DNA。37℃水浴1小时。
10)加40ul氯仿/异戊醇(24∶1)，轻轻混匀，静置5分钟至分层。
11)12000rpm，室温离心10分钟。
12)吸取上清(约35ul)到新Eppendorf管中，-20℃保存，用于PCR检测。抽提缓冲液配方如下100mM Tris-HCl(pH8.0)2.5％(v/v)巯基乙醇500mM NaCl20mM EDTA1.5％(w/v)SDS2、西藏八角莲发根中rolB和rolC基因的PCR检测，方法如下诱发并维持发根形态的rolB和rolC基因是来源于发根农杆菌的Ri质粒上。rolB基因检测使用的上游引物为frolb(5’-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3’)，下游引物为rrolb(5’-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3’)；rolC基因检测使用的上游引物为(5’-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3’)，下游引物为rrolc(5’-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3’)；检测潮霉素抗性基因的上游引物fhygr5’-CGATTTGTGTACGCCCGACAGTC-3’和下游引物为rhygr5’-CGATGTAGGAGGGCGTGGATATG’-3，PCR程序为94℃5min→34循环(94℃ for 50 sec→58℃ for 50 sec→72℃ for 1.5min)→72℃ 6min，潮霉素抗性基因片段大小为812bp。检测rolB和rolC的PCR程序为94℃ 5min→34循环(94℃ for 40 sec→56℃ for 40 sec→72℃ for lmin)→72℃ 6min。阳性对照为相应的工程菌，西藏八角莲的天然叶片作为阴性对照。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和紫外检测。rolb的扩增条带大小为423bp，rolc为626bp。
权利要求
1.一种利用基因工程技术在西藏八角莲发根中表达外源目的基因的方法，首先，构建同时携带诱导发根质粒和外源基因表达载体的工程化农杆菌，采用在含诱导发根的质粒pRiA4的卸甲根癌农杆菌C58C1中导入植物高效表达载体，也即外源基因表达载体p1304，从而获得工程化农杆菌，其步骤如下(1)培养携带pRiA4的卸甲根癌农杆菌C58C1；(2)制备携带pRiA4的卸甲根癌农杆菌C58C1感受态细菌；(3)外源基因表达载体p1304对携带pRiA4的卸甲根癌农杆菌C58C1进行转化；(4)对同时携带pRiA4和p1304的C58C1单克隆的筛选与鉴定；然后，采用转基因技术，用工程化农杆菌遗产转化西藏八角莲的细胞、组织、器官、植株，获得西藏八角莲转基因发根，其步骤如下(1)西藏八角莲无菌外植体的获得；(2)活化工程化农杆菌；(3)工程化农杆菌浸染西藏八角莲；(4)工程化农杆菌与西藏八角莲的共培养；(5)西藏八角莲的除菌培养；(6)西藏八角莲转基因发根的获得与继代培养；(7)西藏八角莲转基因发根的分子检测。
全文摘要
本发明提供了一种利用基因工程技术在西藏八角莲发根中表达外源目的基因的方法。涉及包含工程化农杆菌的构建和遗传转化西藏八角莲，获得表达外源基因的西藏八角莲发根的方法。其过程是用工程化农杆菌遗传转化西藏八角莲，获得了西藏八角莲发根，通过筛选获得表达外源目的基因的西藏八角莲发根，经分子检测确认携带外源目的基因的转化发根。本方法建立了基于西藏八角莲发根的高效外源基因表达系统，为将鬼臼毒素生物合成途径中的关键酶基因导入西藏八角莲，实现其次生代谢工程以及开展产鬼臼毒素植物的分子育种奠定了基础。
文档编号C12N1/21GK1928097SQ20061005411
公开日2007年3月14日 申请日期2006年3月6日 优先权日2006年3月6日
发明者兰小中, 郑维列, 李春燕 申请人:西藏农牧学院