专利名称：发根农杆菌转化植物发根培养植物寄生线虫的方法
技术领域：
本发明属于一种植物寄生线虫的培养方法，具体的说是一种利用发根农杆菌转化植物发根培养植物寄生线虫的方法。
背景技术：
植物寄生线虫是一类重要的病原生物，其中有许多是国际公认的毁灭性有害生物如松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、香蕉穿孔线虫(Radopholussimilis)、马铃薯白线虫(G.loboderapallida)和马铃薯金线虫(G.rostochiensis)等，全世界每年因植物寄生线虫危害而造成的经济损失超过1000亿美元。植物寄生线虫对植物的危害不仅表现在掠夺寄主植物营养以及取食活动所造成的机械损伤，更为重要的是其食道腺分泌物导致寄主植物发生一系列病理变化以及传播其它病原物或刺激和促进其它病原物的继发性侵染危害。
以我国北方薯区甘薯作物上最严重的病害甘薯茎线虫病为例，线虫侵入甘薯后，背食道腺分泌果胶酶、淀粉酶和蛋白酶等使甘薯细胞崩溃、组织腐烂，伴随着其它真菌和细菌加剧危害，常形成“糠心”或龟裂，使甘薯失去食用价值，一般发病田块减产20％～50％，重病田块基本上绝产无收。
由于20世纪40年代初期至50年代中期，杀线虫剂的发现和使用、一些毁灭性植物寄生线虫病害的发生和蔓延以及植物线虫与其它植物病原生物相互关系的揭示，人们逐步认识到植物寄生线虫危害给农林业造成的重大经济损失，从而使植物寄生线虫研究得到重视和发展。
为了很好地控制线虫病的发生和危害，必须发展和使用线虫的生化和生物控制剂，发展生化和生物控制剂首先要了解植物寄生线虫的生化和遗传特性。要做到这一点，必须培养得到大量的一致的线虫群体作为研究对象。植物寄生线虫、植物宿主和环境之间的关系是极其复杂的，并且难以评估在土壤中所发生的变化。因而建立一个植物寄生线虫有效的培养体系是植物线虫研究的重要技术平台。
围绕植物寄生线虫培养体系的研究已经取得一些重要进展。当前主要植物寄生线虫的培养方法采取(1)、寄主植物培养；(2)、愈伤组织或离体根上单外源培养；(3)在微生物上培养；(4)在特定成分的培养基上进行无外源培养。表明植物寄生线虫培养已由杂外源培养开始，过渡到单外源培养，现在发展到无外源培养。
由于绝大多数植物寄生线虫都不能进行无外源培养，寄主植物培养可以分离得到大量的线虫作为研究对象，缺点是由于植物寄生线虫、植物宿主关系的复杂性，研究其生化很困难；愈伤组织或离体根上单外源培养，是目前研究植物寄生线虫生化和遗传发育特性上常采用的方法，缺点在于培养的线虫群体数量小，不能继代培养，影响实验的连续性。这就要求尽快研究出植物寄生线虫的单外源高效连续培养体系。土壤是大多数线虫的家园。土壤有线虫传播的水分和线虫食物来源的植物根系。植物寄生线虫对植物根系有一定的趋向性，有很大一部分植物寄生线虫是以取食植物根系作为危害方式的。
发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)是属于根瘤菌科(Rhizobitaceae)农杆菌属(Agrobacterium)的革兰氏阴性菌，能侵染绝大多数的双子叶植物和少数单子叶植物及个别的裸子植物，诱发被感染植物的受伤部位长出发根(hairy root)。当发根农杆菌感染植物受伤部位时，Ri质粒所含有的T-DNA片段就转入植物的基因组。被感染的植物细胞能快速大量地繁殖，从而在形态学上表现出在被感染的部位长出发根。关于农杆菌刺激生根的机制，过去一直认为是一种“与植物生长素无关”，最近认为可能是通过一种间接的基因相互作用而导致类似生长素传导模式的作用机理。由于每一条毛状根起源于一个细胞，所以将每一条根作为一个克隆在含抗生素的培养基上培养，直到完全除菌。转化根在不加外源激素的培养基中可快速生长，分支多，向地性基本丧失。
近20年来，人们运用发根农杆菌转化有较高经济价值的植物，诱导产生发根(hairy root)，利用发根培养技术来生产和提取有用的次生代谢产物。发根生长速度快，具激素自主性，分化水平高，遗传特性稳定，合成能力较强，现已发展成为继细胞培养技术之后的又一新的培养技术。
发明内容
本发明是利用发根农杆菌转化植物发根培养植物寄生线虫，其主要技术体系是在无菌条件下，利用不加外源激素的培养基上使发根农杆菌转化植物发根快速生长，为植物寄生线虫生长、发育和繁殖提供足够的营养，完成线虫的连续培养。
本发明的技术方案如下发根农杆菌转化植物发根培养植物寄生线虫的方法，其特征在于包括以下步骤(1)、选取植物组织，并消毒；(2)、活化发根农杆菌；(3)、将发根农杆菌接种到植物组织上，诱发植物发根；(4)、将植物上生长的发根的根尖生长点部位转接到培养基上生长；再截取培养基上发根的根尖生长点部位转接到培养基上生长；如此重复，经过数代的连续根尖培养，得到无菌的植物发根；(5)、获得分离出来的线虫并消毒灭菌；(6)、植物寄生线虫在无菌条件下在培养无菌的植物发根的培养基上生长；(7)、将培养基放在清水中，线虫游离到清水中，实现分离。
所述的植物为胡萝卜，培养基为MSR培养基。
所述发根农杆菌转化植物发根培养植物寄生线虫的方法，其特征在于包括以下步骤(1)、选取干净去皮胡萝卜，用0.05％的次氯酸钠表面消毒，并用无菌蒸馏水冲洗，切成0.5-1cm厚，将胡萝卜片接种于1％水琼脂培养基中；(2)、将活化的发根农杆菌ATCC11325菌液，取一滴于胡萝卜切片中心处，2025℃培养，胡萝卜圆片上，位于木质部与韧皮部之间的形成层处陆续产生发根；(3)、选择生长迅速、粗壮的根，截取1～3厘米长的根尖生长点，转接到MSR培养基生长发根；(4)、待发根根尖长大后，再截取2～3厘米长的根尖生长点，转接到MSR培养基上生长；反复多次，经过数代连续根尖培养，得到纯净无菌的胡萝卜发根；(5)、分离得到寄主植物甘薯发病薯块上的甘薯茎线虫；(6)、将线虫表面用0.01-0.05％升汞消毒后，用无菌水冲洗，然后在无菌状态下接种到培养有发根的培养皿里的MSR培养基中，密封，然后放置于无光照的培养箱中20-25℃培养；(7)、将培养基放到清水中，或者将清水放到培养基中，线虫将游到清水中，分离出来。
在MSR培养基上面添加新鲜培养基，发根就进入上面的培养基又可以获得生长所需的养分。
附图
是本发明的工艺路线。
本发明的优点(1)、发根和线虫可以同时生长，培养的线虫数量大；(2)、发根上大量的侧根和丰富的根毛为线虫提供了适口的多取食位点；心(3)、培养体系是透明的，可以通过显微镜观察线虫的取食情况和生长发育情况；(4)、发根继代方便，可以连续培养；(5)培养的线虫分离方便。
本发明的用途(1)、利用该系统植物根系和植物寄生线虫的侵染关系，建立植物对植物寄生线虫抗性鉴定的体系。发根具有完整的正常根组织结构，符合植物内寄生线虫的生长环境。因此用此系统更能反映出植物寄生线虫和寄主相互作用的真实情况。
(2)、通过此培养方法，能够得到大量无菌线虫，可以直接用于接种和研究应用，避免了由于消毒所造成的线虫活力的下降。同时这种单寄主培养体系也可以用于线虫种质的保藏。
(3)、为研究工作提供大量一致的线虫群体。用于教学部门，便于学生观察了解线虫的形态特征，取食特性；进行植物寄生线虫生化和遗传发育特性的连续性研究；(4)、利用该体系筛选、鉴定杀线虫药剂和研究无外源培养提供技术资料。
(5)根系可以用来作为转基因的快速表达检测实验，这比用真实植物下种到盆里或地里周期短。
(6)研究植物线虫的一个关键是研究线虫与寄主细胞发生关系的直接部位，利用发根系统培养线虫的方法，可为很多高技术实验如微芯片研究和制作cDNA文库等提供大量实验材料。
具体实施例方式
由于发根农杆菌能侵染绝大多数的双子叶植物和少数单子叶植物及个别的裸子植物，诱发被感染植物的受伤部位长出发根，因而可以建立发根农杆菌能侵染的重要农作物、经济作物和果树等等发根体系。并应用于植物寄生线虫的培养和鉴定。以下以胡萝卜发根培养甘薯茎线虫为实施例，其过程如下一、胡萝卜发根的诱导将胡萝卜洗净，削去胡萝卜外表皮，用0.05％的次氯酸钠表面消毒20min，无菌蒸馏水冲洗5次，然后用手术刀切成0.5-1cm厚，将胡萝卜片接种于1％水琼脂培养基中(胡萝卜片底部浸渍在1％水琼脂培养基中，上表面露出)，将活化的发根农杆菌ATCC11325菌液，取一滴于胡萝卜切片中心处，25℃培养。经过10天培养，胡萝卜圆片上，位于木质部与韧皮部之间的形成层处陆续产生发根。15天后发根长大3cm左右。选择生长迅速、粗壮的根，截取2～3厘米长的根尖生长点，转接到MSR培养基(发根切口部位插在MSR培养基上)；待根尖长大后，再截取2～3厘米长的根尖生长点，转接到MSR培养基上生长；反复多次，经过数代连续根尖培养，以便除去发根表面可能带有的土壤农杆菌，得到纯净无菌的胡萝卜发根。
二、甘薯茎线虫的分离用浅盘法分离得到寄主植物甘薯发病薯块上的甘薯茎线虫。
三、发根培养线虫将线虫表面用0.01-0.05％升汞消毒20min后，用无菌水冲洗数次，然后按每皿100条的线虫量在无菌状态下接种到培养有发根的培养皿里的MSR培养基中，用封口胶带将培养皿盖封口，然后放置于无光照的培养箱中25℃培养。一个月后可以看到培养皿中繁殖了多于开始几倍的线虫。
四、发根培养基的更新利用发根向上生长的特性，在老培养基上面放置新鲜培养基，发根就进入上面的培养基又可以获得生长所需的养分，使得培养基地更新方便。
五、线虫的分离在发根和发根培养基上生长着大量无菌寄生线虫。线虫具有趋水性，将培养基放到清水中，或者将清水放到培养基中，线虫将游到清水中，分离出来。MSR培养基组分(mg/L)(Stephane Declerck 1989)
Stephane Declerck；Desire G.Strullu and Christian Plenchette Mycologia 90(4)1998，579
权利要求
1.发根农杆菌转化植物发根培养植物寄生线虫的方法，其特征在于包括以下步骤(1)、选取植物组织，并消毒；(2)、活化发根农杆菌；(3)、将发根农杆菌接种到植物组织上，诱发植物发根；(4)、将植物上生长的发根的根尖生长点部位转接到培养基上生长；再截取培养基上发根的根尖生长点部位转接到培养基上生长；如此重复，经过数代的连续根尖培养，得到无菌的植物发根；(5)、获得分离出来的线虫并消毒灭菌；(6)、植物寄生线虫在无菌条件下在培养无菌的植物发根的培养基上生长；(7)、将培养基放在清水中，线虫游离到清水中，实现分离。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的植物为胡萝卜，培养基为MSR培养基。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步骤(1)、选取干净去皮胡萝卜，用0.05％的次氯酸钠表面消毒，并用无菌蒸馏水冲洗，切成0.5～1cm厚，将胡萝卜片接种于1％水琼脂培养基中；(2)、将活化的发根农杆菌ATCC11325菌液，取一滴于胡萝卜切片中心处，20～25℃培养，胡萝卜圆片上，位于木质部与韧皮部之间的形成层处陆续产生发根；(3)、选择生长迅速、粗壮的根，截取1～3厘米长的根尖生长点，转接到MSR培养基生长发根；(4)、待发根根尖长大后，再截取2～3厘米长的根尖生长点，转接到MSR培养基上生长；反复多次，经过数代连续根尖培养，得到纯净无菌的胡萝卜发根；(5)、分离得到寄主植物甘薯发病薯块上的甘薯茎线虫；(6)、将线虫表面用0.01-0.05％升汞消毒后，用无菌水冲洗，然后在无菌状态下接种到培养有发根的培养皿里的MSR培养基中，密封，然后放置于无光照的培养箱中20~25℃培养；(7)、将培养基放到清水中，或者将清水放到培养基中，线虫将游到清水中，分离出来。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于在(6)步中，在MSR培养基上面添加新鲜培养基，发根就进入上面的培养基又可以获得生长所需的养分。
全文摘要
本发明公开了发根农杆菌转化植物发根培养植物寄生线虫的方法，在无菌条件下，利用不加外源激素的培养基上使发根农杆菌转化植物发根快速生长，为植物寄生线虫生长、发育和繁殖提供足够的营养，完成线虫的连续培养。通过此培养方法，能够得到大量无菌线虫，可以直接用于接种和研究应用。
文档编号C12N5/06GK1737123SQ20051003841
公开日2006年2月22日 申请日期2005年3月10日 优先权日2005年3月10日
发明者阮龙, 肖翔, 王钰, 刘兵, 吴跃进, 许安, 余增亮 申请人:中国科学院等离子体物理研究所