本发明属于促植物生长
技术领域：
，具体涉及酿酒葡萄根内生菌根癌土壤杆菌的筛选方法及其应用。
背景技术：
：植物体是由多细胞构成的有机体，构成植物体的各器官间在生长上表现出相互依赖和相互制约的相关性。植物的地上部分和地下部分有维管束的联络，存在着营养物质与信息物质的大量交换。地上部分的生长和活动需要根系提供水分、矿物质元素、氮素以及根中合成的植物激素、氨基酸等。促进植物快速生长有利于植物将无机碳转化为有机碳，在有限的时间内提高植物代谢物和农产品的产量。植物的快速生长受遗传因子和环境条件影响。为了保证植物正常生长，植物提供适宜的阳光、水份、温度和土壤。为了使促进植物快速生长，通常人为的提供植物生长的营养元素，通常将营养元素施加到土壤中，利于根部吸收，还可以通过叶面喷施营养液，达到快速吸收的目的。除了遗传因子和环境条件对植物生长有影响外，植物生长激素的调节和控制也能够促进植物生长。例如，吲哚乙酸、萘乙酸、6-苄基氨基嘌呤等生长激素能促进植物生根，乙烯利和萘乙酸等促进花芽形成，2,4-D具有促进果实膨大、早熟的作用。植物生长调节剂的施用方法有溶液喷洒法、浸泡法、涂抹法、土壤浇灌法等。目前，没有关于酿酒葡萄根内生菌有促进植物生长的报道。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供酿酒葡萄根内生菌的筛选方法及其应用，所述酿酒葡萄根内生菌具有促进植物生长的作用。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了酿酒葡萄根内生菌根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的筛选方法，包括以下步骤：1)将酿酒葡萄根段接种到分离培养基上，培养长出菌落；2)将所述步骤1)长出的菌落转接到新鲜的分离培养基上，分离至纯种。优选的，所述步骤1)中培养的温度为25～30℃，所述培养的时间为2～5d。优选的，所述菌落形态为菌落呈乳白色，羽状、有凸起，易挑起。优选的，分离培养基包括营养肉汤培养基。本发明提供的所述酿酒葡萄根内生菌或者所述筛选方法得到的酿酒葡萄根内生菌在促进酿酒葡萄植物生长中的应用。优选的，所述促进酿酒葡萄植物生长包括通过酿酒葡萄根内生菌分泌吲哚乙酸到酿酒葡萄根际的土壤中。优选的，所述促进酿酒葡萄植物生长还包括通过降解磷来达到促进植物生长的目的。所述降解磷的种类包括有机磷和无机磷。优选的，所述酿酒葡萄根的葡萄树的种类为包括红葡萄品种和白葡萄品种。优选的，所述红葡萄品种包括A03山葡萄、N08梅鹿辄、Q02左优红、H07北冰红或E05赤霞珠；所述白葡萄品种包括F01霞多丽、J02威代尔、F06威代尔、F02贵人香或F07白玉霓。本发明提供了酿酒葡萄根内生菌根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的筛选方法，包括以下步骤：1)将酿酒葡萄根段接种到分离培养基上，培养长出菌落；2)将所述步骤1)长出的菌落转接到新鲜的分离培养基上，分离至纯种。本发明提供的筛选方法，步骤简单，重复性好，成本低，菌种易得。本发明提供的根癌土壤杆菌为革兰氏阳性菌，是从酿酒葡萄根中分离纯化得到的内生菌，菌落乳白色，羽状、有凸起，易挑起，可分解色素；经16SrDNA序列测定及系统发育分析所述根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)分类学上为α-变形菌纲土壤杆菌属。生理生化实验表明能分解葡萄糖产酸和分解明胶，但无法分解淀粉，吲哚实验均为阴性。本发明提供的所述筛选方法得到的酿酒葡萄根内生菌酿酒葡萄根内生菌根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)在促进酿酒葡萄植物生长中的应用。通过所述酿酒葡萄根内生菌酿酒葡萄根内生菌根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)XZ11菌株与植物联合作用，实现了所述酿酒葡萄根内生菌实现促进酿酒葡萄植物生长。进一步的，本发明提供的所述应用，通过筛选得到的酿酒葡萄根内生菌菌株具有产吲哚乙酸活性兼具解磷特性，能够将植株难以吸收利用的P转化为可利用形态，提高植株对P的利用率，同时内生菌分泌的吲哚乙酸被植物吸收利用，促进植物快速生长，且对植物具有较好的定殖和适应力，更为后续的定植机制、生物学特性、生态学和资源调查以及微生物菌肥的开发应用等一系列工作奠定基础。具体实施方式本发明提供了酿酒葡萄根内生菌根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的筛选方法，包括以下步骤：1)将酿酒葡萄根段接种到分离培养基上，培养长出菌落；2)将所述步骤1)长出的菌落转接到新鲜的分离培养基上，分离至纯种。本发明中，所述酿酒葡萄根段优选从酿酒葡萄根。所述酿酒葡萄根的来源优选从甘肃省兰州市紫轩葡萄园区采集，得到酿酒葡萄根。所述酿酒葡萄根的葡萄树的种类优选为包括红葡萄品种和白葡萄品种。本发明中，所述红葡萄品种优选包括A03山葡萄、N08梅鹿辄、Q02左优红、H07北冰红或E05赤霞珠；所述白葡萄品种优选包括F01霞多丽、J02威代尔、F06威代尔、F02贵人香或F07白玉霓。其中A03山葡萄为8年份，J02威代尔为6年份，其余品种均为3年份。所述酿酒葡萄根的采集时间为酿酒葡萄成熟期。本发明中，所述酿酒葡萄根在切段前优选采用70～75％乙醇溶液进行浸泡1～2min后，用有效氯含量为2～3％的NaClO溶液处理2～3min，再用无菌水清洗3～5次。本发明中，所述酿酒葡萄根段的长度优选为1～2cm。本发明中，所述酿酒葡萄根段优选采用无菌解剖刀切断。本发明中，所述接种优选将酿酒葡萄根段的切面向下。本发明中，所述分离培养基包括营养肉汤培养基。所述营养肉汤培养基的配方优选为牛肉膏3g/L蛋白胨10g/LNaCl5g/L琼脂20g/L。本发明中，所述培养的温度为25～30℃，更优选为27℃；所述培养的时间为2～5d；更优选为3～4d。本发明中，为了确保酿酒葡萄根表面消毒彻底，设置对照实验。所述对照实验具体为取最后一次清洗用水1涂布于PDA培养基上，28℃培养，若无菌生长则说明酿酒葡萄根表面消毒彻底，能够用于后续实验，若有菌落生长，说明消毒不彻底，继续消毒后再次涂布，直至得到消毒彻底的酿酒葡萄根。得到长出菌落后，本发明将长出的菌落接种到新鲜的分离培养基上，分离至纯种。本发明中，所述接种的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的接种的技术方案即可。本发明中，所述接种到新鲜的分离培养基上的菌落优选根据菌落的形态选择接种。所述菌落的形态优选为菌落乳白色，羽状、有凸起，易挑起，可分解色素。本发明中，所述分离至纯种的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的分离至纯种的技术方案即可。本发明提供的根癌土壤杆菌为革兰氏阳性菌，经16SrDNA序列测定及系统发育分析所述根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)分类学上为α-变形菌纲土壤杆菌属。生理生化实验表明能分解葡萄糖产酸和分解明胶，但无法分解淀粉，吲哚实验均为阴性。本发明中，所述酿酒葡萄根内生菌根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)优选进行生理生化实验。所述生理生化实验包括甲基红实验，淀粉实验，明胶液化实验和吲哚实验。本发明中，所述酿酒葡萄根内生菌根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)优选采用16SrDNA序列进行分子鉴定。本发明中，所述分子鉴定的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的分子鉴定的技术方案即可。本发明提供的所述的酿酒葡萄根内生菌的筛选方法，所述筛选方法操作简单，步骤简洁，重复性好。本发明提供的所述酿酒葡萄根内生菌或者所述筛选方法得到的酿酒葡萄根内生菌在促进酿酒葡萄植物生长中的应用。本发明中，所述促进酿酒葡萄植物生长优选包括通过酿酒葡萄根内生菌分泌吲哚乙酸到酿酒葡萄根际的土壤中。本发明中，所述促进酿酒葡萄植物生长优选还包括通过降解磷来达到促进植物生长的目的。本发明中，所述磷包括有机磷和无级磷。下面结合实施例对本发明提供的酿酒葡萄根内生菌及其筛选方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1筛选方法从甘肃省兰州市紫轩葡萄园区中采集成熟期酿酒葡萄根。先用自来水将采集的葡萄根表面冲洗干净，于无菌环境下晾干水分。取酿酒葡萄根，在70％乙醇中浸泡1min后，用有效氯含量为3％的NaClO溶液处理2min，再用无菌水清洗3-4次。为确保酿酒葡萄根表面消毒彻底，取最后一次清洗水1mL涂布于PDA培养基上，28℃培养，无菌生长，则将清洗的根段用于后续实验。用无菌解剖刀将根切成约2cm长段，切面向下，将每个部位的组织块分别置于NB培养基、改良高氏一号和马丁氏-孟加拉红培养基上，3次重复，28℃培养5d。培养期间，长出了菌落乳白色，羽状、有凸起，易挑起，可分解色素的菌落。将长出的菌落转接到新鲜的分离培养基上，并划线分离至纯种。将从不同分离培养基上获得的菌种转移至PDA斜面培养基上，28℃，2d后，4℃保存。得到的筛选菌命名为XZ11-1菌株。实施例2筛选方法从甘肃省兰州市紫轩葡萄园区中采集成熟期酿酒葡萄根。先用自来水将采集的葡萄根表面冲洗干净，于无菌环境下晾干水分。取酿酒葡萄根，在75％乙醇中浸泡1.5min后，用有效氯含量为2.5％的NaClO溶液处理1.5min，再用无菌水清洗4次。为确保酿酒葡萄根表面消毒彻底，取最后一次清洗水1mL涂布于PDA培养基上，27℃培养，无菌生长，则将清洗的根段用于后续实验。用无菌解剖刀将根切成约1cm长段，切面向下，将每个部位的组织块分别置于NB培养基、改良高氏一号和马丁氏-孟加拉红培养基上，4次重复，30℃培养2d。培养期间，长出了菌落乳白色，羽状、有凸起，易挑起，可分解色素的菌落。将长出的菌落转接到新鲜的分离培养基上，并划线分离至纯种。将从不同分离培养基上获得的菌种转移至PDA斜面培养基上，28℃，5d后，4℃保存。得到的筛选菌命名为XZ11-2菌株。实施例3筛选方法从甘肃省兰州市紫轩葡萄园区中采集成熟期酿酒葡萄根。先用自来水将采集的葡萄根表面冲洗干净，于无菌环境下晾干水分。取酿酒葡萄根，在75％乙醇中浸泡2min后，用有效氯含量为3％的NaClO溶液处理1min，再用无菌水清洗5次。为确保酿酒葡萄根表面消毒彻底，取最后一次清洗水1mL涂布于PDA培养基上，27℃培养，无菌生长，则将清洗的根段用于后续实验。用无菌解剖刀将根切成约1.5cm长段，切面向下，将每个部位的组织块分别置于NB培养基、改良高氏一号和马丁氏-孟加拉红培养基上，4次重复，30℃培养3d。培养期间，长出了菌落乳白色，羽状、有凸起，易挑起，可分解色素的菌落。将长出的菌落转接到新鲜的分离培养基上，并划线分离至纯种。将从不同分离培养基上获得的菌种转移至PDA斜面培养基上，28℃，3d后，4℃保存。得到的筛选菌命名为XZ11-3菌株。实施例4～6将实施例1～3筛选得到的XZ11-1、XZ11-2和XZ11-3菌株分别进行培养得到三株筛选菌，分别用AxyPrep细菌DNA制备试剂盒(AXYGEN)提取得到的三株筛选菌DNA。并将其作为PCR反应模板。利用引物27F和1492R扩增待测菌株的16SrDNA基因序列(引物信息见表1)，并进行DNA测序。表116SrDNA基因引物信息表PCR扩增反应体系：PCR反应参数：94℃预变性5min；94℃，30s，58℃，45s，72℃，80s，共35个循环；72℃×7min；4℃保存。检测：PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。测序：送至甘肃金博研生物科技有限公司测定。将测序结果进行正反向拼接，得到的序列采用MAGE5.0比对，发现三条序列完全相同，如SEQIDNo.1序列所示，通过将SEQIDNo.1序列在NCBI中进行blast比对，结果发现所述SEQIDNo.1序列与Agrobacteriumtumefaciens相似度100％，因此可以确定三株筛选菌分类学上为α-变形菌纲，土壤杆菌属，根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)。实施例7～9将实施例1～3筛选得到的XZ11-1、XZ11-2和XZ11-3菌株分别进行淀粉实验分别得到实施例7～9检测结果。具体为将菌株接种在淀粉琼脂培养基中，所述淀粉琼脂培养的配方为3g牛肉膏，10g蛋白胨，5gNaCl，20g可溶性淀粉，20g琼脂，pH7.2-7.4，1×105Pa灭菌20min。30℃，48h后，滴加少量碘液于平板上并铺满，所述的碘液为1.0g碘，2.0g碘化钾和300.0mL蒸馏水配制而成，若菌落周围出现透明圈，说明能分解淀粉，为阳性，用“+”表示，反之，用“—”表示。实施例1～3筛选得到的XZ11-1、XZ11-2和XZ11-3菌株淀粉实验结果见表2。实施例10～12将实施例1～3筛选得到的XZ11-1、XZ11-2和XZ11-3菌株分别进行明胶液化实验得到实施例10～12检测结果。将XZ11-1、XZ11-2和XZ11-3菌株穿刺分别接种在明胶培养基中，明胶培养基的配方为5g蛋白胨，120g明胶，pH7.2-7.4，1×105Pa灭菌20min。在30℃条件进行180r/min培养，24h后，置于冰水中观察固化情况，若液化则不再凝固为阳性，用“+”表示，反之，用“—”表示。实施例1～3筛选得到的XZ11-1、XZ11-2和XZ11-3菌株淀粉实验结果见表2。实施例13～15将实施例1～3筛选得到的XZ11-1、XZ11-2和XZ11-3菌株分别进行吲哚实验得到实施例13～15检测结果。将XZ11-1、XZ11-2和XZ11-3菌株分别接种于10mL的蛋白胨水培养液中，30℃，180r/min，24-48h后，加入1mL乙醚，充分振荡，静置至乙醚层浮于培养液上，加入10滴吲哚试剂，乙醚层变玫瑰红，表明有吲哚存在为阳性，用“+”表示，反之，用“—”表示。实施例1～3筛选得到的XZ11-1、XZ11-2和XZ11-3菌株吲哚实验结果见表2。实施例16～18将实施例1～3筛选得到的XZ11-1、XZ11-2和XZ11-3菌株分别进行甲基红实验得到实施例16～18检测结果。将XZ11-1、XZ11-2和XZ11-3菌株分别接种于10mL的葡萄糖蛋白胨培养液中，所述的葡萄糖蛋白胨培养液的配方为3g牛肉膏，10g蛋白胨，5gNaCl，20g可溶性淀粉，20g琼脂，pH7.2-7.4，1×105Pa灭菌20min。30℃，180r/min，36h后，滴加3～4滴甲基红试剂，若培养液变红，判定菌株能分解葡萄糖产酸为阳性，用“+”表示，反之，用“—”表示。实施例1～3筛选得到的XZ11-1、XZ11-2和XZ11-3菌株甲基红实验结果见表2。表2XZ11-1、XZ11-2和XZ11-3菌株生理生化实验结果实施例淀粉实验明胶液化实验吲哚实验甲基红实验实施例7—---实施例8—---实施例9—---实施例10-+--实施例11-+--实施例12-+--实施例13--—-实施例14--—-实施例15--—-实施例16---+实施例17---+实施例18---+注：阴性用“—”表示，阳性用“+”表示，为参与反应部分用“-”表示。实施例19～21磷降解实验包括有机磷降解实验和无机磷降解实验。采用溶磷圈法进行定性测试：将实施例1～3分离获得的内生菌点接种于有机磷筛选培养基上，30℃，7d后，观察是否存在溶P透明圈，有则说明该菌株具有溶有机磷能力，若观察不存在溶P透明圈则说明该菌株不具有溶有机磷能力。有机磷筛选培养基按照如下配方进行配制：10g蔗糖，0.3gNaCl，0.3gMgSO4·7H2O，0.03gFeSO4·7H2O，5gCaCO3，0.3gKCl，0.5g(NH4)2SO4，0.6g卵磷脂，0.03gMnSO4·4H2O，20g琼脂，pH7-7.2，1×105Pa灭菌20min。采用修改后的平板溶磷圈法进行定性测试：将实施例1～3分离获得的分离得到的内生菌点接种到无机磷筛选培养基上，30℃，7d后，观察是否存在溶P透明圈，有则说明该菌株具有溶无机磷能力，若观察不存在溶P透明圈则说明该菌株不具有溶无机磷能力。无机磷筛选培养基按照如下配方进行配制：10g葡萄糖，0.3gNaCl，0.3gKCl，0.03gFeSO4·7H2O，5gCa3(PO4)2，0.3gMgSO4·7H2O，0.5g(NH4)2SO4，0.03gMnSO4·4H2O，20g琼脂，pH7，1×105Pa灭菌20min。结果表明实施例1～3分离获得的分离得到的内生菌对有机磷降解和无机磷降解结果均存在溶P透明圈，说明实施例1～3分离获得的分离得到的内生菌均有溶无机磷的能力，同时也具有溶有机磷能力。实施例22～24吲哚乙酸分泌菌株定性筛选实验将实施例1～3分离得到的内生菌接种到含有100mg/LL-色氨酸的LB培养基中，30℃，180r/min，48h后，取2mL菌液于白色陶瓷杯中，以2mL50mg/LIAA标准液为阳性对照，再加2mLSalkowski显色液，摇匀，室温避光反应30min，若颜色变红表示该菌株能分泌IAA吲哚乙酸，否则表示该菌株不能分泌IAA吲哚乙酸。通过以IAA标准液作为阳性对照，与Salkowski显色液进行定性试验，确定实施例1-3分离得到的三个菌株均能利用L-色氨酸分泌IAA，说明实施例1-3分离得到的三个菌株为分泌吲哚乙酸的菌株。由以上实施例可知，从甘肃省兰州市紫轩葡萄园区中采集得到的成熟期酿酒葡萄根，从酿酒葡萄根中分离筛选得到的内生菌为根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)。本发明提供的所述酿酒葡萄根内生菌或者所述筛选方法得到的酿酒葡萄根内生菌通过酿酒葡萄根际内生菌分泌吲哚乙酸到酿酒葡萄根际的土壤中和降解磷在促进酿酒葡萄植物生长中的应用。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3