本发明属于微生物诱变筛选
技术领域：
，具体涉及一种生长代谢性能增强的高产乳酸链球菌素突变菌株。
背景技术：
：乳酸链球菌素(Nisin)，是由某些乳酸乳球菌(LactococusLactis)在代谢过程中合成、分泌的具有很强杀菌作用的小肽。Nisin能够抑制大部分革兰氏阳性菌及其芽孢的生长和繁殖，如葡萄球菌属、链球菌属、乳酸球菌属、梭装芽孢杆菌属和芽孢杆菌属的细菌，特别对金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、肉毒杆菌抑制作用明显。因此，Nisin可显著的延长食品的保存时间或缩短杀菌所需的时间，在乳制品、肉制品、罐头食品及植物蛋白食品等的保藏于防腐方面都有很好的作用。自然界中分离得到的nisin生产菌株生物合成nisin的量一般较低，达不到工业化生产的要求，必须通过菌株改良，提高nisin的产量和细菌生长代谢性能。乳酸链球菌素发酵代谢过程中产物和副产物对细胞生长和代谢均会产生抑制。另一方面由于副产物乳酸的产生，pH是不断下降的，pH下降对细胞生长和代谢造成很大不利影响。当环境pH低于6.0产乳酸链球菌素细胞生长速率即开始减慢，pH低于4.5细胞停止生长。当初始培养pH低于5.5细胞不生长。而同时由于生产菌种细胞对乳酸链球菌素具有吸附作用，乳酸链球菌素的提取工艺一般需要将pH调至2.0-3.0低pH附近来进行解吸附。低pH有益于乳酸链球菌素的活性保持，但是靠近中性水平的pH有益于产乳酸链球菌素的菌种生长。这就出现菌种最适生长pH和产物活性最适pH相互矛盾的问题。而如果我们对菌种进行选育改造，选育在更低的最适生长pH或者生长能够耐受更低pH的突变菌株，获得生长pH与活性保持pH更加接近的突变菌株，或者在低pH环境生长和代谢性能增强的突变菌株，无疑其更加有利于乳酸链球菌素的发酵生产和提取。技术实现要素：本发明，根据上述思路，对乳酸链球菌素产生菌进行了育变选育，并提供了一种在低pH环境生长代谢性能增强的高产乳酸链球菌素突变菌株，来解决现有乳酸链球菌素发酵生产技术问题。一种生长代谢性能增强的高产乳酸链球菌素突变菌株，其特征在于，该突变菌株与野生菌相比，能够在更低的pH环境下生长并分泌产物乳酸链球菌素，更加适合工业化生产。所述突变菌株，其特征还有可以产生比野生菌更高的乳酸链球菌素。本发明的生长代谢性能增强的高产乳酸链球菌素突变菌株：在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期：2016年12月05日，登记号：CGMCCNo.13420，分类命名：乳酸乳球菌乳酸亚种，Lactococcuslactissubsp.Lactis，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。所述突变菌株是诱变后经双重筛选指标：Nisin抗性指标和受低pH指标筛选获得。为了实现本发明技术方案，采取如下步骤：(1)菌种诱变；(2)初筛：(3)复筛；(4)精筛(5)摇瓶验证实验。所述步骤(1)菌种诱变：a)菌种活化：将Lactococcuslactissubsp.LactisATCC11454冻干粉末接入小试管乳酸细菌培养基中进行活化后，转接至摇瓶乳酸细菌培养基中，28℃-35℃恒温箱中培养6-17h，连续传代3次后，接种新的乳酸细菌培养基，接种量为4-8％的装液量，装液量为10ml(摇瓶容量50ml)。将培养6-17h的种子培养物，取6ml，4000-6000r/min离心5-10min，菌体沉淀用生理盐水洗涤一遍；所述的乳酸细菌培养基，包括如下重量百分比的组分：K2HPO40.2～1％乙酸钠0.3～0.8％MgSO47H2O0.02～0.2％柠檬酸氨0.2～0.8％蔗糖4～10％蛋白胨0.6～1.0％酵母粉0.6～1.0％琼脂粉1.5～2.5％(仅固体乳酸细菌培养基添加)水余量b)诱变：物理诱变：取步骤(1)a获得的菌体沉淀中加入2-4ml0.1-0.2mol/L，pH4.6-5.5醋酸缓冲液，混匀制成菌悬液。菌悬液，醋酸缓冲液，亚硝酸钠以1∶1∶1体积比混匀。所述亚硝酸钠为浓度1-2mol/L的溶液。置于30-33℃水浴处理30-300S，取出加入16-20ml0.1-0.2mol/L，pH8.6磷酸缓冲液终止反应。4000-6000r/min离心5-10min，取菌体沉淀，补加生理盐水制成菌悬液。或\并进行化学诱变：在菌体沉淀中加入5-6ml的生理盐水，混匀倒入平皿中，将装有菌悬液的平皿放置在30W紫外灯下30cm处，处理前先开灯预热20-30min，稳定后开启磁力搅拌器，使菌悬液能够接受均匀照射，打开平皿盖，照射20-150S后盖上皿盖，加入2-3ml培养液，黑布包裹好，28-35℃培养1-2h；在红光下取出培养液，4000-6000r/min离心5-10min，取菌体沉淀，加入3-6ml生理盐水，制成菌悬液。所述步骤(2)初筛：取步骤(1)获得的菌悬液100ul涂布于初筛平板上进行初筛，倒置于28-35℃培养箱中培养1-3天；同时取步骤(1)获得的菌悬液100ul稀释10-3，10-4，10-5，10-6涂布空白平板作对照。所述初筛平板为含乳酸链球菌素10.5mg/mL-35mg/mL，pH4.0-5.5的步骤(1)a所述的的固体乳酸细菌培养基平板。所述步骤(3)复筛：将步骤(2)初筛平板上生长的单菌落，用无菌牙签逐一点种挑到复筛平板，通过比较单菌落抑菌透明圈的大小完成复筛过程；所述复筛平板为含1％-2％指示菌藤黄微球菌的步骤(1)a所述的固体乳酸细菌培养基平板。所述步骤(4)精筛：将步骤(3)复筛平板上抑菌圈大的优势菌株接种到小试管步骤(1)a所述的乳酸细菌培养基中进行发酵培养，并相应接种到步骤(1)a所述的固体乳酸细菌培养基平板进行保藏备份。琼脂扩散法测定乳酸链球菌素效价。根据效价大小，将高产菌株挑选出来并立即制成甘油管保存；所述步骤(5)摇瓶实验验证：将筛选获得的菌株在摇瓶中复苏，28-35℃、150-250r/min恒温摇床中培养18-24h，连续传代5次，测定每代的乳酸链球菌素效价，评价菌种性能稳定性。本发明所述的生长代谢性能增强的高产乳酸链球菌素突变菌株具有以下优势：1、突变菌株BQSW07在乳酸细菌培养基，当培养基pH下降到4.5时细胞仍能够继续生长，并代谢乳酸链球菌素；2、突变菌株BQSW07在乳酸细菌培养基，当初始pH为5.0时细胞仍能够正常生长，并最终达到野生菌的生长浓度。3、突变菌株BQSW07在同样培养条件下，细胞生长浓度更高，最终pH更低，积累的最终乳酸链球菌素产物浓度比野生菌更高。具体实施方式实施例1：步骤(1)菌种诱变：a)菌种活化：将Lactococcuslactissubsp.LactisATCC11454冻干粉末接入小试管乳酸细菌培养基中进行活化后，转接至摇瓶乳酸细菌培养基中，28℃恒温箱中培养6h，连续传代3次后，接种新的乳酸细菌培养基，接种量为4％的装液量，装液量为10ml(摇瓶容量50ml)。将培养6h的种子培养物，取6ml，4000r/min离心5min，菌体沉淀用生理盐水洗涤一遍；所述的乳酸细菌培养基，包括如下重量百分比的组分：K2HPO40.2％乙酸钠0.3％MgSO47H2O0.0％柠檬酸氨0.2％蔗糖4％蛋白胨0.6％酵母粉0.6％琼脂粉1.5％(仅固体乳酸细菌培养基添加)水余量b)诱变：物理诱变：取步骤(1)a获得的菌体沉淀中加入2ml0.1mol/L，pH4.6醋酸缓冲液，混匀制成菌悬液。菌悬液，醋酸缓冲液，亚硝酸钠以1∶1∶1体积比混匀。所述亚硝酸钠为浓度1mol/L的溶液。置于30℃水浴处理30S，取出加入16ml0.1mol/L，pH8.6磷酸缓冲液终止反应。4000r/min离心10min，取菌体沉淀，补加生理盐水制成菌悬液。所述步骤(2)初筛：取步骤(1)获得的菌悬液100ul涂布于初筛平板上进行初筛，倒置于28℃培养箱中培养1天；同时取步骤(1)获得的菌悬液100ul稀释10-3，10-4，10-5，10-6涂布空白平板作对照。每个初筛平板中约生长15个单菌落。所述初筛平板为含乳酸链球菌素10.5mg/mL，pH4.0的步骤(1)a所述的的固体乳酸细菌培养基平板。所述步骤(3)复筛：将步骤(2)初筛平板上生长的单菌落，用无菌牙签逐一点种挑到复筛平板，通过比较单菌落抑菌透明圈的大小完成复筛过程；所述复筛平板为含1％指示菌藤黄微球菌的步骤(1)a所述的固体乳酸细菌培养基平板。复筛筛选到30株优势菌株。所述步骤(4)精筛：将步骤(3)复筛平板上抑菌圈大的优势菌株接种到小试管步骤(1)a所述的乳酸细菌培养基中进行发酵培养，并相应接种到步骤(1)a所述的固体乳酸细菌培养基平板进行保藏备份。琼脂扩散法测定乳酸链球菌素效价。根据效价大小，将高产菌株挑选出来并立即制成甘油管保存；精筛筛选到3株优势菌株。所述步骤(5)摇瓶实验验证：将筛选获得的菌株在摇瓶中复苏，28℃、150r/min恒温摇床中培养18h，连续传代5次，测定每代的乳酸链球菌素效价，评价菌种性能稳定性。最终筛选到1株高产性能优势菌株。实施例2步骤(1)菌种诱变：a)菌种活化：将Lactococcuslactissubsp.LactisATCC11454冻干粉末接入小试管乳酸细菌培养基中进行活化后，转接至摇瓶乳酸细菌培养基中，35℃恒温箱中培养17h，连续传代3次后，接种新的乳酸细菌培养基，接种量为8％的装液量，装液量为10ml(摇瓶容量50ml)。将培养17h的种子培养物，取6ml，6000r/min离心5min，菌体沉淀用生理盐水洗涤一遍；所述的乳酸细菌培养基，包括如下重量百分比的组分：K2HPO41％乙酸钠0.8％MgSO47H2O0.2％柠檬酸氨0.8％蔗糖10％蛋白胨1.0％酵母粉1.0％琼脂粉2.5％(仅固体乳酸细菌培养基添加)水余量b)诱变：物理诱变：取步骤(1)a获得的菌体沉淀中加入4ml0.2mol/L，pH5.5醋酸缓冲液，混匀制成菌悬液。菌悬液，醋酸缓冲液，亚硝酸钠以1∶1∶1体积比混匀。所述亚硝酸钠为浓度2mol/L的溶液。置于33℃水浴处理300S，取出加入20ml0.2mol/L，pH8.6磷酸缓冲液终止反应。6000r/min离心5min，取菌体沉淀，补加生理盐水制成菌悬液。并进行化学诱变：在菌体沉淀中加入6ml的生理盐水，混匀倒入平皿中，将装有菌悬液的平皿放置在30W紫外灯下30cm处，处理前先开灯预热30min，稳定后开启磁力搅拌器，使菌悬液能够接受均匀照射，打开平皿盖，照射150S后盖上皿盖，加3ml培养液，黑布包裹好，35℃培养2h；在红光下取出培养液，6000r/min离心5min，取菌体沉淀，加入6ml生理盐水，制成菌悬液。所述步骤(2)初筛：取步骤(1)获得的菌悬液100ul涂布于初筛平板上进行初筛，倒置于35℃培养箱中培养3天；同时取步骤(1)获得的菌悬液100ul稀释10-3，10-4，10-5，10-6涂布空白平板作对照。平均每个初筛平板获得10个单菌落。所述初筛平板为含乳酸链球菌素35mg/mL，pH5.5的步骤(1)a所述的的固体乳酸细菌培养基平板。所述步骤(3)复筛：将步骤(2)初筛平板上生长的单菌落，用无菌牙签逐一点种挑到复筛平板，通过比较单菌落抑菌透明圈的大小完成复筛过程；复筛获得150个优势菌株。所述复筛平板为含2％指示菌藤黄微球菌的步骤(1)a所述的固体乳酸细菌培养基平板。所述步骤(4)精筛：将步骤(3)复筛平板上抑菌圈大的优势菌株接种到小试管步骤(1)a所述的乳酸细菌培养基中进行发酵培养，并相应接种到步骤(1)a所述的固体乳酸细菌培养基平板进行保藏备份。琼脂扩散法测定乳酸链球菌素效价。根据效价大小，将高产菌株挑选出来并立即制成甘油管保存；精筛获得4个高产突变菌株。所述步骤(5)摇瓶实验验证：将筛选获得的菌株在摇瓶中复苏，35℃、250r/min恒温摇床中培养24h，连续传代5次，测定每代的乳酸链球菌素效价，评价菌种性能稳定性。最后获得1个性能稳定高产突变菌株。实施例3本实施例是对实施例2中经过精筛获得的4株优势菌株，对这4株优势菌株进行生长和代谢性能的考察，并与未经诱变的出发菌株比较。表14株优势菌株生长和Nisin产量结果参数出发菌株BQSW04BQSW05BQSW07BQSW095OD600(nm)2.443.543.483.933.88pH4.504.134.064.084.05Nisin(U/mL)20438112712486807361由结果可知，筛选获得的突变菌株生长性能都比出发菌株要好，OD600是出发菌株的1.6倍。代谢性能也得到显著提高，突变菌株目标产物Nisin积累量是出发菌株的4.2倍。实施例4下表是对突变菌株BQSW07的生长性能和代谢过程的进一步分析，由结果可知，环境pH低于4.5后，菌株仍在生长，而对照菌株在pH到达4.5附近已不能生长。与生长状况同步，代谢Nisin的过程也得到延长，最终Nisin积累量得到有效提高。由此可知，本发明提供的突变菌株其生长性能和代谢性能得到提高。更加适合工业化生产。表2突变菌株BQSW07与对照菌株的生长和代谢性能比较实施例5本实施例是对突变菌株BQSW07生长代谢性能进一步分析：将突变菌株BQSW07种子液100ul涂布于pH4.0、pH4.5、pH5.0、pH5.5、pH6.0的固体平板，同时按4％的接种量接种至pH4.0、pH4.5、pH5.0、pH5.5、pH6.0液体培养基，30℃培养48h。下表是结果培养结果：表3不同初始pH平板上菌株生长情况表4不同初始pH液体发酵菌株生长情况由结果可知，突变菌株BQSW07可以在更低的初始pH环境下生长，细胞生长能力得到明显增强。当前第1页1 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