一株赤潮藻裂解细菌YWL1及其应用的制作方法

本发明涉及环境微生物领域，尤其是涉及一株具有溶藻活性的赤潮藻裂解细菌YWL1及其应用。

背景技术：

在海洋和淡水水体中，由于富营养化程度的加剧，藻类过量繁殖形成赤潮和水华，从而影响和改变水体的理化性质，并且能直接或间接引起食藻动物的大量死亡。传统的治理方法如机械除藻，高频电磁脉冲以及利用除草剂等方法，常受到成本和环境安全性问题等诸多因素的限制。相比之下，生物控藻技术成本低、安全性好，其中溶藻细菌因其较高的除藻性能，成为防治赤潮和水华的一个新方向。

所谓溶藻细菌（algae-lysing bacteria），是一类以直接或间接方式抑制藻类生长、或杀死藻类、溶解藻细胞的细菌的统称。1924年，Ceitler报道一种黏细菌Polyangium parasitium寄生在刚毛藻（Cladophora）上，使其死亡。国内外文献中报道的溶藻细菌有：黏细菌、噬胞菌属、弧菌、腐生螺旋体属、假单胞菌、鞘氨醇单胞菌属、交替单胞菌、交替假单胞菌等。溶藻细菌的作用方式一般分为两种：①直接溶藻，即直接进攻宿主，它需要细菌与溶藻细胞直接接触，甚至侵入藻细胞内；②间接溶藻，即间接进攻宿主，主要包括细菌同藻竞争有限营养或细菌分泌胞外物质溶藻。

作为水生生态系统中生物种群结构和功能的一个重要组成部分，溶藻细菌对赤潮和水华的控制、维持藻类生物量的平衡具有非常重要的作用，它们对浮游植物的溶解作用也可能是调节水生生态系统中初级生产力的一个重要因素。赤潮和水华的突然消亡可能与溶藻细菌的感染有关。溶藻细菌作为赤潮和水华防治的生物，能够作为一种高效溶藻微生物控制甚至杀死藻细胞，恢复生态平衡，具有巨大的开发价值。

溶藻菌对藻的抑制和溶藻作用具有宿主特异性，针对我国海域特有赤潮藻株分离溶藻菌具有重要的现实和科学意义。中肋骨条藻Skeletonema costatum是在全球近岸海域分布极广的广温广盐性的浮游硅藻，是我国赤潮的优势种，在黄、东、南海均有该种赤潮记录。中肋骨条藻SCXMBO2株和SKSPXS0711株分别是中国东海宁波海域和厦门海域赤潮优势藻。迄今，尚无有关此两株藻的溶藻菌的分离及应用的报道。产毒圆海链藻（Thalassiosira rotula）和塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense）是广泛存在于海洋中的产毒藻，亦是我国沿海重要的赤潮原因藻。获得能够同时裂解赤潮原因藻中肋骨条藻、产毒圆海链藻和塔玛亚历山大藻的细菌，对于赤潮的生物防治非常重要。迄今，尚无能够同时裂解这三种赤潮原因藻的细菌的报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一株可安全、高效、快速、特异抑制海水中中肋骨条藻（SCXMBO2和SKSPXS0711）、产毒圆海链藻和塔玛亚历山大藻的赤潮藻裂解细菌YWL1及其应用，该裂解细菌使中肋骨条藻SCXMBO2藻叶绿素a浓度减少率达76.14%、使产毒圆海链藻和塔玛亚历山大藻藻液的OD680减少65.38%和57.25%。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一株赤潮藻裂解细菌，该细菌为YWL1株，分类命名为海杆菌（Marinobacter sp.），于2015 年5 月25 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10857。

该菌的生物学特征如下：该细菌为过氧化氢酶阳性，不可以利用蔗糖、麦芽糖、淀粉作为碳源，无运动性，菌体形态为棒状，有鞭毛，无芽孢，菌落为淡黄色半透明，表面光滑湿润，边缘规则，无晕环，直径约1 mm；该菌株在UV下处理30分钟后死亡，其最高耐受温度为40℃，最适生长条件为：pH=6.0-8.5，温度20-40℃。

上述赤潮藻裂解细菌的应用，其对产毒圆海链藻（Thalassiosira rotula）、塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense）和东海赤潮优势藻中肋骨条藻SCXMBO2、SKSPXS0711具有强溶藻作用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开了一株赤潮藻裂解细菌及其应用，将其用于控制在特定环境下由于中肋骨条藻、圆海链藻或塔玛亚历山大藻爆发性增值或高度聚集而引起的赤潮，此裂解细菌可用于抑制中肋骨条藻(SCXMBO2、SKSPXS0711)、产毒圆海链藻（Thalassiosira rotula）和塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense）的生长，并杀死这些赤潮藻。具有成本低，经济效益高；对生态环境无破坏；培养大量赤潮藻裂解细菌YWL1株较为容易，操作简单。权衡社会、经济和环境效益等综合因素，是一种新型的治理赤潮的技术，具有良好的发展前景。

综上所述，本发明提供一株赤潮藻裂解菌YWL1及其应用，该YWL1可高效、快速降解海水中中肋骨条藻，产毒圆海链藻和塔玛亚历山大藻，该菌10天能使中肋骨条藻藻叶绿素a浓度减少76.14%；使产毒圆海链藻和塔玛亚历山大藻藻液的OD680减少率达65.38%和57.25%。

附图说明

图1为Marinobacter sp. YWL1负染图；

图2为UV以及不同pH、温度对Marinobacter sp. YWL1的影响；

图3为Marinobacter sp. YWL1最适储存温度图；

图4为中肋骨条藻SCXMBO2培养液。右为被YWL1感染10 d后的藻液；左为未添加YWL1的同期藻液；

图5为显微镜下Marinobacter sp. YWL1对中肋骨条藻、产毒圆海链藻、塔玛亚历山大藻的溶藻作用。a：被YWL01感染的中肋骨条藻SKSPXS0711；b：未添加YWL1的中肋骨条藻SKSPXS0711；c：被YWL01感染的产毒圆海链藻；d：未添加YWL01的产毒圆海链藻；e：被YWL1感染的塔玛亚历山大藻；f：未添加YWL01的塔玛亚历山大藻；

图6为Marinobacter sp. YWL1对中肋骨条藻SCXMBO2叶绿素a浓度的影响。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

一、实验方法

藻叶绿素a浓度测定方法

取5 mL 藻液，6000 g离心15 min后去上清，加入5 mL 体积分数为90%的乙醇水溶液或者体积分数为90%的丙酮水溶液，在4℃冰箱内避光放置。24 h后7000 g 离心10 min，上清液用分光光度计检测在663nm和645 nm时的吸光度，用体积分数为90%的乙醇水溶液或者体积分数为90%的丙酮水溶液调零。藻叶绿素a浓度利用以下公式计算得到：

a=(12.7D₆₆₃-2.59D₆₄₅)*V/A

a 代表藻叶绿素a浓度，V为加入的体积分数为90%的乙醇水溶液或者体积分数为90%的丙酮水溶液体积，A为藻细胞重量(g)。藻细胞裂解，藻叶绿素a浓度下降。

二、具体实施例

实施例1

Marinobacter sp. YWL1的分离与鉴定

现场采集宁波赤潮高发海域表层海水。配制固体海水LB培养基，取上述水样划线分离细菌，得到多株纯菌。将分离到的纯菌分别接种于液体海水LB培养基中扩大培养，培养温度为37℃。固体海水LB培养基的成分为：10 g/L胰化蛋白胨，5g/L酵母提取物，15g/L琼脂，加人工海水至1L，调pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌30min。液体海水LB培养基配方则不加琼脂。

扩大培养的纯菌经5000 ×g离心20min得到细菌沉淀，用加30 mg/L硅酸盐的f/2培养基清洗细菌三次，最后用等体积的含30 mg/L硅酸盐的f/2培养基重悬细菌。菌悬液分别与指数生长期的中肋骨条藻NMBguh004-2共培养7天（菌液：藻液的体积比为1:4），培养温度为20℃，光照强度2500 LX，光暗比(L/D)12 h:12 h，得到新鲜菌液。将含30 mg/L硅酸盐的f/2培养基与处于指数生长期的中肋骨条藻SCXMBO2株藻液按菌液：藻液的体积比1:4混合后作为对照组。分别用肉眼、光学显微镜、藻叶绿素a浓度变化和电镜观察藻生长情况，判断所分离的细菌是否具有裂解中肋骨条藻的能力，最后得到一株中肋骨条藻高效裂解菌YWL1，该菌16S rDNA与海杆菌HP15的16S rRNA基因序列的相似性最高，为97.63%，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。 将其命名为海杆菌（Marinobacter sp.）YWL1，于2015 年5 月25 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10857，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。

其中f/2培养基的成分为：硝酸钠75 mg/L，磷酸二氢钠 5mg/L，六水合三氯化铁3.15 mg/L，EDTA - Na₂ 4.36 mg/L，五水硫酸铜10 mg/L，七水硫酸锌22 mg/L，六水氯化钴10 mg/L，四水氯化锰18 mg/L，二水钼酸钠6.3 mg/L，维生素B₁₂ 1 mg/L，维生素H 1 mg/L，维生素B₁ 200 mg /L，加人工海水至1L。

实施例2

用电子显微镜观察Marinobacter sp. YWL1的形态

取实施例1所分离纯化的YWL1菌液滴于铜网格上，以2wt%乙酸铀酰溶液（W/V）进行负染，再置于电子显微镜（日立H-7650）下观察中肋骨条藻裂解细菌的形态。结果如图1所示，YWL1为棒状（58 nm × 229 nm），有鞭毛，无芽孢。

实施例3

紫外线以及不同pH、温度对Marinobacter sp. YWL1的影响

（1）紫外线UV对Marinobacter sp. YWL1稳定性的影响

取实施例1分离纯化得到的YWL1新鲜菌液，经5000 ×g离心20min得到细菌沉淀，用含30 mg/L硅酸盐的f/2培养基清洗细菌三次，最后用含30 mg/L硅酸盐的f/2培养基重悬细菌。取上述菌悬液在UV（300 LX）下处理30分钟。用实施例1中所述的对照组作为对照。在实验组、对照组中分别取100μL菌液涂布于固体海水LB培养基中培养，培养条件同实施例1。24小时后，分别对实验组和对照组的菌落数计数。

结果表明，如图2所示，YWL1菌液在强UV下照射30分钟，菌落数减少率为100%。说明细菌在强UV下照射30分钟后，可使细菌死亡，然而，自然界紫外线正常情况下不会到达此强度。

（2）Marinobacter sp. YWL1的耐受温度及最适储存温度的探究

取实施例1分离纯化得到的含中肋骨条藻裂解细菌YWL1的新鲜菌液，经5000 ×g离心20min得到细菌沉淀，用含30 mg/L硅酸盐的f/2培养基清洗细菌三次，最后用含30 mg/L硅酸盐的f/2培养基重悬细菌。取上述菌悬液分别在40℃、45℃水浴锅中处理30分钟，在-80℃、-40℃、-20℃、4℃、20℃、37℃冰箱内放置7天。用实施例1中所述的对照组作为对照，实验组和对照组均无需黑暗处理。在实验组、对照组中分别取100μL菌液涂布于固体海水LB培养基中培养，培养条件同实施例1。24小时后，分别对实验组和对照组的菌落数计数。

结果表明，如图2所示，菌悬液分别至于40℃、45℃水浴锅中处理30分钟后，菌落数减少率分别为6.67%、98.89%。说明该细菌在40℃环境下其活性均较稳定，在45℃下无法正常生存。如图3所示菌液分别在-80℃、-40℃、-20℃、4℃、20℃、37℃冰箱内放置7天后，菌落数减少率分别为97.44%、100%、100%、12.30%、14.87%、95.38%。说明该细菌的最适储存温度为4℃、20℃。

（3）不同pH对Marinobacter sp. YWL1稳定性的影响

取实施例1分离纯化得到的含中肋骨条藻裂解细菌YWL1的新鲜菌液，经5000 ×g离心20min得到细菌沉淀，用含30 mg/L硅酸盐的f/2培养基清洗细菌三次，最后用含30 mg/L硅酸盐的f/2培养基重悬细菌。测菌液原始pH值并记录，随后用NaOH和HCl将菌液相应调制pH 4.5、pH 5、pH 6、pH 8.5、pH 10、pH 10.5并分别处理30分钟作为实验组，30分钟后将实验组菌液pH调回原始pH。用实施例1中所述的对照组作为对照，实验组和对照组均无需黑暗处理。在实验组、对照组中分别取100μL菌液涂布于固体海水LB培养基中培养，培养条件同实施例1。24小时后，分别对实验组和对照组的菌落数计数。

结果表明，如图2所示，菌悬液在pH 4.5、pH 5、pH 6、pH 8.5、pH 10、pH 10.5处理30 min后菌落减少率分别为98.89%、93.33%、11.67%、13.33%、95.56%、98.89%。说明该细菌无法在强酸强碱环境下生存，在pH 6、pH 8.5环境下其活性均较稳定。

实施例4

Marinobacter sp. YWL1溶藻范围测试

选用19株海洋藻种（表1）进行溶藻细菌YWL1的溶藻范围分析。取处于指数生长期的藻种按4:1的体积比分别与溶藻细菌YWL01共培养，培养条件同上述实施例1，设置三个平行组。对照组为不含细菌YWL01 的藻液。共培养第0、4、10 d均摇匀取样，测藻液的OD₆₈₀值。同时，每天用照相机记录实验组和对照组藻液颜色变化情况以及光学显微镜下观察藻细胞形态。14 d后，与对照组比较，若无明显变化，则基本判定细菌YWL01无法感染该藻。该实验重复三次进行。

结果，YWL1可以感染中肋骨条藻SCXMBO2、SKSPXS0711、产毒圆海链藻（Thalassiosira rotula）和塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense）（表1）。感染后，与对照组相比，藻细胞裂解明显，无完整的细胞结构，光合色素变少。感染期间，对照组藻液OD₆₈₀值一直处于上升状态，实验组藻液OD₆₈₀值虽然感染初期高于对照组（这是由于加入了菌悬液，导致实验组藻OD₆₈₀初始值比对照组高），但是感染后期藻液OD₆₈₀值逐渐下降，最终均低于对照组。

如图4所示，中肋骨条藻SCXMBO2培养液。右为被YWL1感染10 d后的藻液；左为未添加YWL1的同期藻液，被感染的藻液颜色明显淡于同期对照藻液；如图5所示，显微镜下Marinobacter sp. YWL1对中肋骨条藻、产毒圆海链藻、塔玛亚历山大藻的溶藻作用。a：被YWL01感染的中肋骨条藻SKSPXS0711；b：未添加YWL1的中肋骨条藻SKSPXS0711；c：被YWL01感染的产毒圆海链藻；d：未添加YWL01的产毒圆海链藻；e：被YWL1感染的塔玛亚历山大藻；f：未添加YWL01的塔玛亚历山大藻。图4b、d、f分别显示未感染YWL01的中肋骨条藻、产毒圆海链藻和塔玛亚历山大藻具有完整的、轮廓清晰的细胞形态；而图4a、c、e分别显示感染YWL01的中肋骨条藻、产毒圆海链藻和塔玛亚历山大藻的细胞裂解、破碎。

而其他15株赤潮藻无论从藻细胞形态还是从藻液OD₆₈₀值来看，均无溶藻现象。

表1藻种与溶藻结果

Tab. 3.1 Susceptibility of algealgal blooming

注：“+”为有溶藻现象， “-”为无溶藻现象。

实施例5

Marinobacter sp. YWL1的生化鉴定

（1）过氧化氢酶实验

取1 ml新鲜培养的YWL1细菌菌液（实施例1提供），使用CAT可见光试剂盒（南京建成生物工程研究所）按说明提取过氧化氢酶。若提取到过氧化氢酶，则说明该菌可以利用过氧化氢，无则反之。结果表明，如表2说明所示该细菌存在过氧化氢酶，利用过氧化氢。

（2）淀粉酶实验

取1 ml新鲜培养的YWL1细菌菌液（实施例1提供），使用二糖酶（淀粉酶）试剂盒（南京建成生物工程研究所）按说明提取淀粉酶。若提取到淀粉酶，则说明该菌可以利用淀粉，无则反之。结果表明，如表2所示，说明该细菌不存在淀粉酶，不可以利用淀粉。

（3）麦芽糖酶实验

取1 ml新鲜培养的YWL1细菌菌液（实施例1提供），使用二糖酶(麦芽糖酶)试剂盒（南京建成生物工程研究所）按说明提取麦芽糖酶。若提取到麦芽糖酶，则说明该菌可以利用麦芽糖，无则反之。结果表明，如表2所示，说明该细菌不存在麦芽糖酶，不可以利用麦芽糖。

（4）蔗糖酶实验

取1 ml新鲜培养的YWL1细菌菌液（实施例1提供），使用二糖酶(蔗糖酶)试剂盒（南京建成生物工程研究所）按说明提取蔗糖酶。若提取到蔗糖酶，则说明该菌可以利用蔗糖，无则反之。结果表明，如表2所示，说明该细菌不存在蔗糖酶，不可以利用蔗糖。

（5）革兰氏染色测定实验

染液: 结晶紫染色液、脱色液、95%乙醇、沙黄复染液、稀石碳酸复红液（均由本实验室提供）。

染色方法：在涂片上滴加一滴蒸馏水，用接种环将YWL1细菌涂于水滴中，并轻轻搅匀，酒精灯烘干；再将涂片固定于酒精灯火焰上方，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗；滴加革兰氏碘液，作用1min后，水洗；接着滴加95wt%酒精水溶液脱色，约30s，或将酒精滴满整个涂片，立即倾去，再用酒精滴满整个涂片，脱色10s，水洗；滴加复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。若所染菌呈红色则为革兰氏阴性菌，若所染菌呈紫色则为革兰氏阳性菌。结果表明，表2所示，说明该细菌为革兰氏阴性菌。

表2 Marinobacter sp. YWL1的生化特性

注：“+”: 阳性; “-“: 阴性。

实施例6

Marinobacter sp. YWL1对中肋骨条藻、产毒圆海链藻和塔玛亚历山大藻藻华的抑制应用

取实施例1所分离纯化的Marinobacter sp. YWL1菌液按1：4的比例分别添加到中肋骨条藻、产毒圆海链藻和塔玛亚历山大藻藻华液中，对照组添加含有30 mg/L硅酸盐的f/2培养基。在第0、4、10 d分别取5 mL 藻液提取叶绿素a，检测实验组和对照组的叶绿素a浓度或OD680值的变化。

对于中肋骨条藻，结果如图4所示，与对照组相比，裂解液的藻叶绿素a浓度在第10天具有显著性影响 (P < 0.05)。对照组藻叶绿素a浓度从0.096 mg/L 稳定上升至 0.285 mg/L。而实验组，前四天缓慢上升至0.186 mg/L，随后到第10天下降至0.068 mg/L，与对照组相比下降了76.14%，对中肋骨条藻具有很好的裂解作用。

通过相同实验方法得到Marinobacter sp. YWL1使产毒圆海链藻和塔玛亚历山大藻藻液的OD680减少65.38%和57.25%，控藻效果明显。

综上所述，上述赤潮藻裂解菌海杆菌YWL1株可用于特异性地抑制东海赤潮优势藻中肋骨条藻和产毒赤潮藻圆海链藻、塔玛亚历山大藻的生长并杀死这些藻。其对中肋骨条藻（SCXMBO2和SKSPXS0711）具有强裂解作用，使藻液由褐色变成白色；对产毒赤潮藻圆海链藻和塔玛亚历山大藻均具有强烈裂解作用，使藻液颜色变淡至无色。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

序 列 表

<110> 宁波大学

<120> 一株赤潮藻裂解细菌YWL1及其应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1266

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 中肋骨条藻高效裂解菌YWL1基因

<400> 1

GGGCTGGCGG CAGCTTACAC ATGCAGTCGA GCGGTAACAG GGGGTGCTTG CACCCCGCTG

ACGAGCGGCG GACGGGTGAG TAATGCATAG GAAACTGCCC AGTAGTGGGG GATAGCCCGG

GGAAACCCGG ATTAATACCG CGTACGCCCT TCGGGGGAAA GCAGGGGATC TTCGGACCTT

GCGCTATTGG ATGTGCCTAT GTCGGATTAG CTAGTTGGTG GGGTAAAGGC CTACCAAGGC

GACGATCCGT AGCTGGTCTG AGAGGATGAT CAGCCACATC GGGACTGAGA CACGGCCCGA

ACTCCTACGG GAGGCAGCAG TGGGGAATAT TGGACAATGG GGGCAACCCT GATCCAGCCA

TGCCGCGTGT GTGAAGAAGG CTTTCGGGTT GTAAAGCACT TTCAGTGAGG AGGAAAACTC

TGCGACTAAT ACTCGTAGGG CTTGACGTTA CTCACAGAAG AAGCACCGGC TAACTCCGTG

CCAGCAGCCG CGGTAATACG GAGGGTGCAA GCGTTAATCG GAATTACTGG GCGTAAAGCG

CGCGTAGGTG GTTTGATAAG CGAGATGTGA AAGCCCCGGG CTTAACCTGG GAACGGCATT

TCGAACTGTC AGGCTAGAGT ATGGTAGAGG GTAGTGGAAT TTCCTGTGTA GCGGTGAAAT

GCGTAGATAT AGGAAGGAAC ACCAGTGGCG AAGGCGGCTA CCTGGACCAA TACTGACACT

GAGGTGCGAA AGCGTGGGGA GTAAACAGGA TTAGATACCC TGGTAGTCCA CGCCGTAAAC

GATGTCTACT AGCCGTTGGG ACTCTTGAAG TCTTAGTGGC GCAGCTAACG CACTAAGTAG

ACCGCCTGGG GAGTACGGCC GCAAGGTTAA AACTCAAATG AATTGACGGG GGCCCGCACA

AGCGGTGGAG CATGTGGTTT AATTCGACGC AACGCGAAGA ACCTTACCTG GCCTTGACAT

GCAGAGAACT TTCCAGAGAT GGATTGGTGC CTTCGGGAAC TCTGACACAG GTGCTGCATG

GCGTCGTCAG CTCGTGTCGT GAGATGTTGG GTAAGTCCCG TACGAGCGCA ACCCCTATCC

CTAGTGCTAG CAGTTCGGCT GAGAACTCTA GGGAGACTGC CGTGACAACC GGAGAAGGTG

GGGGGATGAA CGTCAGGTCA TCATGACTTA CGGCCAGGCT ACCCACTGGC TCAATGGTGG

CCAAGCGTCA ACCCGAGGGG ACACTCATAC ACTGTATCCG ATGCACTGCA ACTGACTGCG

TGGACT 1266