一种具有降解苯胺能力的鞘氨醇杆菌及其应用的制作方法

本发明属于环境微生物及废水处理领域，具体涉及一种具有降解苯胺能力的鞘氨醇杆菌及其应用。

背景技术：

据报道苯酚、苯胺等的生产量和使用量占芳烃总量的90％以上，其中作为化工行业中最重要中间体之一的苯胺，应用十分广泛：染料工业中可用于制造酸性嫩黄、直接橙S、直接桃红、靛蓝、分散黄棕、阳离子桃红FG和活性艳红X-SB等染料，还可用于制造金光红、大红粉、酚菁红、油溶黑等有机颜料；橡胶制造工业中是橡胶助剂的重要原料，可用于制造防老剂、促进剂、抗氧剂、稳定剂等；医药行业可作为磺胺药的原料；也是农药行业的重要中间体，可制造杀菌剂、杀虫剂和除草剂；苯胺在其他行业也具有重要作用，如可作为生产香料、塑料、清漆、胶片等的中间体；还可作为炸药中的稳定剂、汽油中的防爆剂。随着我国经济的发展，对苯胺的需求量也快速增长，苯胺产量由2005年的49万吨增长到2015年的178万吨。近年随着以苯胺为主要原料的MDI的需求量快速增长，也极大的拉动了苯胺的需求量。

苯胺因其毒性大、难降解、具有致癌、致畸、致突变的“三致”特性，已被美国EPA列为优先控制的129种污染物之一，同时也属于我国水中优先控制污染物黑名单中的一种有机污染物。工业上应用十分广泛的苯胺会随着工业废水进入自然环境及地下水中，因苯胺亦属于高毒高残留物质，极易危害生物健康。苯胺可与动物体内血红蛋白结合成高铁血红蛋白而引起高铁血红蛋白血症，还会引起肝脏、肾脏、心血管等脏器损害；每年大约有30 000t苯胺被排放到环境中，该物质可通过生物富集、皮肤接触等途径进入人体，严重威胁环境安全及人类健康。生物降解相比于传统的物理吸附法和化学处理法，具有高效、成本低、不会产生二次污染等优势，已成为降解苯胺的最佳方法。特别是微生物具有来源广、易培养、繁殖速度快等优势，已引起人们的广泛关注。目前还没有一种利用鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)菌株降解苯胺废水的方法。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供一种具有降解苯胺能力的鞘氨醇杆菌及其应用。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

一种具有降解苯胺能力的鞘氨醇杆菌，鞘氨醇杆菌的16SrDNA鉴定属于鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)，申请人将其编号为BA-4；已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，邮政编码：100101，保藏编号：CGMCC No.：13428；它为短杆状，属于革兰氏阴性菌；在牛肉膏蛋白胨固体培养基上形成圆形的淡黄色菌落，表面湿润，边缘整齐，易挑取。

本发明所述的具有降解苯胺能力的鞘氨醇杆菌来源于山东省曲阜市某污水沟污泥，经苯胺驯化、分离、纯化获得，并可利用苯胺作为其生长的唯一碳源和氮源。本发明所述的鞘氨醇杆菌经16SrDNA鉴定属于鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)，在NCBI上经BLAST比对后，与菌株Sphingobacterium sp.F159(登录号为KJ848476.1)的同源性达到99％。

一种具有降解苯胺能力的鞘氨醇杆菌在降解苯胺的应用。

所述的，降解苯胺的具体方法为：将鞘氨醇杆菌悬浮于含苯胺水中，在温度为28-38℃、pH为6-9条件下摇床培养72h。

所述的，鞘氨醇杆菌的接种量为2％。

优选的，降解苯胺的具体方法为：将鞘氨醇杆菌悬浮于含苯胺水中，在温度为30℃、pH为7条件下摇床培养72h。

所述的，含苯胺水中苯胺的初始浓度不大于350mg/L。

优选的，含苯胺水中苯胺的初始浓度为350mg/L。

本发明的有益效果：本发明的鞘氨醇杆菌Sphingobacterium sp.BA-4用于污水体系中苯胺的降解，不仅具有很高的降解速率和耐受浓度，且无二次污染，使用安全，具有广阔的应用前景。

菌种保藏信息

保藏时间：2016年12月07日，

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，

保藏编号：CGMCC No.13428，

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101

分类命名：鞘氨醇杆菌Sphingobacterium sp.

附图说明

图1为本发明的鞘氨醇杆菌Sphingobacterium sp.BA-4的照片；

其中：a为菌落照片，b为革兰氏染色显微镜照片；

图2为本发明鞘氨醇杆菌Sphingobacterium sp.BA-4的系统发育树图；

图3为不同苯胺浓度下本发明的鞘氨醇杆菌Sphingobacterium sp.BA-4对苯胺的降解曲线。

具体实施方式

下面列举具体实施方式对本发明作进一步说明，但不因此而限制本发明的内容。

实施例1

一种具有降解苯胺能力的鞘氨醇杆菌，鞘氨醇杆菌的16SrDNA鉴定属于鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)，申请人将其编号为BA-4；已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，邮政编码：100101，保藏编号：CGMCC No.：13428；它为短杆状，属于革兰氏阴性菌；在牛肉膏蛋白胨固体培养基上形成圆形的淡黄色菌落，表面湿润，边缘整齐，易挑取。

本发明所述的具有降解苯胺能力的鞘氨醇杆菌来源于山东省曲阜市某污水沟污泥，经苯胺驯化、分离、纯化获得，并可利用苯胺作为其生长的唯一碳源和氮源。本发明所述的鞘氨醇杆菌经16SrDNA鉴定属于鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)，在NCBI上经BLAST比对后，与菌株Sphingobacterium sp.F159(登录号为KJ848476.1)的同源性达到99％。

一种具有降解苯胺能力的鞘氨醇杆菌在降解苯胺的应用。

所述的，降解苯胺的具体方法为：将鞘氨醇杆菌悬浮于含苯胺水中，在温度为38℃、pH为6条件下摇床培养72h。

所述的，鞘氨醇杆菌的接种量为2％。

所述的，含苯胺水中苯胺的初始浓度为300mg/L。

实施例2

一种具有降解苯胺能力的鞘氨醇杆菌，鞘氨醇杆菌的16SrDNA鉴定属于鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)，申请人将其编号为BA-4；已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，邮政编码：100101，保藏编号：CGMCC No.：13428；它为短杆状，属于革兰氏阴性菌；在牛肉膏蛋白胨固体培养基上形成圆形的淡黄色菌落，表面湿润，边缘整齐，易挑取。

本发明所述的具有降解苯胺能力的鞘氨醇杆菌来源于山东省曲阜市某污水沟污泥，经苯胺驯化、分离、纯化获得，并可利用苯胺作为其生长的唯一碳源和氮源。本发明所述的鞘氨醇杆菌经16SrDNA鉴定属于鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)，在NCBI上经BLAST比对后，与菌株Sphingobacterium sp.F159(登录号为KJ848476.1)的同源性达到99％。

一种具有降解苯胺能力的鞘氨醇杆菌在降解苯胺的应用。

所述的，降解苯胺的具体方法为：将鞘氨醇杆菌悬浮于含苯胺水中，在温度为30℃、pH为7条件下摇床培养72h。

所述的，鞘氨醇杆菌的接种量为2％。

所述的，含苯胺水中苯胺的初始浓度为350mg/L。

实施例3

一种具有降解苯胺能力的鞘氨醇杆菌，鞘氨醇杆菌的16SrDNA鉴定属于鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)，申请人将其编号为BA-4；已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，邮政编码：100101，保藏编号：CGMCC No.：13428；它为短杆状，属于革兰氏阴性菌；在牛肉膏蛋白胨固体培养基上形成圆形的淡黄色菌落，表面湿润，边缘整齐，易挑取。

本发明所述的具有降解苯胺能力的鞘氨醇杆菌来源于山东省曲阜市某污水沟污泥，经苯胺驯化、分离、纯化获得，并可利用苯胺作为其生长的唯一碳源和氮源。本发明所述的鞘氨醇杆菌经16SrDNA鉴定属于鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)，在NCBI上经BLAST比对后，与菌株Sphingobacterium sp.F159(登录号为KJ848476.1)的同源性达到99％。

一种具有降解苯胺能力的鞘氨醇杆菌在降解苯胺的应用。

所述的，降解苯胺的具体方法为：将鞘氨醇杆菌悬浮于含苯胺水中，在温度为28℃、pH为9条件下摇床培养72h。

所述的，鞘氨醇杆菌的接种量为2％。

所述的，含苯胺水中苯胺的初始浓度为200mg/L。

Sphingobacterium sp.BA-4的分离、纯化和鉴定

Sphingobacterium sp.BA-4是从山东省曲阜市某污水沟污泥取样，经初筛和复筛得到的一株革兰氏阴性菌。具体步骤如下：

一、初筛

(1)富集培养：从山东省曲阜市某污水沟采集的污泥5g接种于45ml牛肉膏蛋白胨培养基(内含数粒小玻璃珠)，于30℃、150r/min摇床中培养24h。

(2)分离纯化：在无菌环境下，用移液枪取步骤(1)获得的菌液0.5ml加至4.5ml无菌水中，充分混匀，制备成10^-1的菌液；再吸取该稀释菌液0.5ml加入到4.5ml无菌水中，充分混匀，制备成10^-2的菌液；同样的方法依次制备成梯度为10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的菌液；分别取稀释梯度为10^-4、10^-5、10^-6的菌液200μl，涂布于苯胺浓度为50mg/L的固体筛选培养基(其配方为K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、琼脂20g、蒸馏水1000ml，pH 7.2±0.2，)上，倒置于30℃培养箱中培养48h；培养完成，挑取平板上形态、大小不同的单菌落划线于纯化培养基(其配方为蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、琼脂20g、蒸馏水1000ml，pH 7.2±0.2)，倒置于30℃培养箱中培养24h；多次重复上一步骤，直至获得纯菌落，接种于斜面培养基(其配方为蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、琼脂20g、蒸馏水1000ml，pH 7.2±0.2)，于4℃冰箱中保存。

二、复筛

(1)菌株活化：在无菌环境下，挑取初筛步骤(2)获得的纯菌落一环，接种于活化培养基(其配方为蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、琼脂20g、蒸馏水1000ml，pH 7.2±0.2)，倒置于30℃培养箱中培养24h。

(2)种子培养：在无菌环境下，将菌株活化步骤获得的活化菌株以2％(V/V)接种量接种于种子培养基(其配方为蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、琼脂20g、蒸馏水1000ml，pH 7.2±0.2)中，于30℃、150r/min摇床中培养24h。

(3)发酵降解：将步骤(2)种子培养获得的种子液以2％(V/V)接种量接种于40ml苯胺浓度为50mg/L的发酵培养基(其配方为K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸馏水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min摇床中培养72h。

(4)离心：将步骤(3)发酵降解获得的发酵液用12000r/min离心10min，获得上清液。

(5)苯胺浓度检测：取步骤(4)离心获得的上清液1ml，参照《水和废水监测分析方法》第四版中N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法测定发酵液中苯胺浓度含量。分别计算各菌株发酵液中的苯胺浓度，根据苯胺降解率复筛得出具有降解苯胺能力的Sphingobacterium sp.BA-4。Sphingobacterium sp.BA-4的照片如图1所示。

Sphingobacterium sp.BA-4的16SrDNA鉴定

通过16SrDNA序列分析，确定BA-4菌属于鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)，具体步骤如下：

一、提取基因组DNA

(1)菌株活化：在无菌环境下，挑取复筛步骤获得的具有降解苯胺能力的纯菌落一环，接种于5ml活化培养基(其配方为蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml，pH7.2±0.2)，置于30℃、150r/min摇床中震荡培养24h。

(2)提取基因组DNA：使用北京索莱宝科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒，提取活化后的苯胺降解菌BA-4的基因组DNA。

(3)检验基因组DNA片段：将步骤(2)获得的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳，以检验是否提取出目的基因组DNA。琼脂糖凝胶配方为：琼脂糖0.25mg、1×TAE 25ml、Gelred2.5μl。电泳条件为：120V、20min。

二、PCR产物纯化

(1)PCR扩增：使用细菌通用引物27F、1492R，50μl PCR体系对目的基因片段进行扩增。50μl PCR体系和PCR反应条件分别如表1和表2所示。

细菌通用引物27F、1492R序列如下：

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；

1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

表1 50μl PCR体系

表2 PCR反应条件

(2)检验PCR产物：将步骤(1)获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，以检验获得的PCR产物的纯度。琼脂糖凝胶配方为：琼脂糖0.25mg、1×TAE 25ml、Gelred 2.5μl。电泳条件为：120V、20min。

(3)纯化PCR产物：使用康宁生命科学(吴江)有限公司的AxyPrep PCR产物纯化试剂盒，纯化步骤(1)获得的PCR产物。

三、测序比对

(1)测序：将PCR产物纯化步骤(3)获得的PCR纯化产物寄送至山东省济南市力戈科技有限公司进行测序。

(2)序列比对：将步骤(1)获得的菌株序列在NCBI上进行核苷酸序列BLAST比对后，发现与菌株Sphingobacterium sp.F159(登录号为KJ848476.1)的同源性达到99％，图2为该菌的系统发育树图，故该苯胺降解菌属于鞘氨醇杆菌属，将该菌命名为Sphingobacterium sp.BA-4。

Sphingobacterium sp.BA-4菌株驯化

(1)菌株活化：在无菌环境下，分别挑取复筛步骤获得的苯胺降解菌BA-4纯菌落一环，接种于5ml活化培养基(其配方为蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml，pH7.2±0.2)，置于30℃、150r/min摇床中震荡培养24h，得活化种子液；

(2)将活化种子液以2％(V/V)接种量接种于40ml苯胺浓度为50mg/L的发酵培养基(其配方为K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸馏水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min摇床中培养72h；取该驯化菌液10ml用12000r/min离心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法测定上清液中苯胺浓度含量；

(3)将步骤(2)获得的驯化菌液以2％(V/V)接种量接种于40ml苯胺浓度为100mg/L的发酵培养基(其配方为K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸馏水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min摇床中培养72h；取该驯化菌液10ml用12000r/min离心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法测定上清液中苯胺浓度含量；

(4)将步骤(3)获得的驯化菌液以2％(V/V)接种量接种于40ml苯胺浓度为150mg/L的发酵培养基(其配方为K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸馏水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min摇床中培养72h；取该驯化菌液10ml用12000r/min离心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法测定上清液中苯胺浓度含量；

(5)将步骤(4)获得的驯化菌液以2％(V/V)接种量接种于40ml苯胺浓度为200mg/L的发酵培养基(其配方为K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸馏水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min摇床中培养72h；取该驯化菌液10ml用12000r/min离心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法测定上清液中苯胺浓度含量；

(6)将步骤(5)获得的驯化菌液以2％(V/V)接种量接种于40ml苯胺浓度为250mg/L的发酵培养基(其配方为K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸馏水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min摇床中培养72h；取该驯化菌液10ml用12000r/min离心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法测定上清液中苯胺浓度含量；

(7)将步骤(6)获得的驯化菌液以2％(V/V)接种量接种于40ml苯胺浓度为300mg/L的发酵培养基(其配方为K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸馏水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min摇床中培养72h；取该驯化菌液10ml用12000r/min离心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法测定上清液中苯胺浓度含量；

(8)将步骤(7)获得的驯化菌液以2％(V/V)接种量接种于40ml苯胺浓度为350mg/L的发酵培养基(其配方为K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸馏水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min摇床中培养72h；取该驯化菌液10ml用12000r/min离心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法测定上清液中苯胺浓度含量；

(9)将步骤(8)获得的驯化菌液以2％(V/V)接种量接种于40ml苯胺浓度为400mg/L的发酵培养基(其配方为K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸馏水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min摇床中培养72h；取该驯化菌液10ml用12000r/min离心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法测定上清液中苯胺浓度含量；

(10)将步骤(9)获得的驯化菌液以2％(V/V)接种量接种于40ml苯胺浓度为450mg/L的发酵培养基(其配方为K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸馏水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min摇床中培养72h；取该驯化菌液10ml用12000r/min离心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法测定上清液中苯胺浓度含量。

由驯化和图3发现：Sphingobacterium sp.BA-4能高效降解浓度小于350mg/L的苯胺，可在72h完全降解浓度为350mg/L的苯胺。之后随着苯胺浓度的增大，其降解效果逐渐降低。

温度对Sphingobacterium sp.BA-4降解苯胺的影响

选用Sphingobacterium sp.BA-4能完全降解苯胺的最大浓度350mg/L为初始苯胺浓度，在培养基pH 7.0的条件下，研究温度对Sphingobacterium sp.BA-4降解苯胺的影响。

(1)种子液制备：将Sphingobacterium sp.BA-4菌株驯化步骤(8)获得的驯化菌液以2％(V/V)接种量接种于40ml苯胺浓度为350mg/L的发酵培养基(其配方为K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸馏水1000ml，pH 7.0，)中，于30℃、150r/min摇床中培养72h，作为种子液备用；

(2)将步骤(1)获得的种子液以2％(V/V)接种量接种于40ml苯胺浓度为350mg/L的发酵培养基(其配方同步骤(1))中，分别置于24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃的150r/min摇床中培养72h；分别取不同温度条件下培养的菌液10ml用12000r/min离心10min后，分别取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法测定上清液中苯胺浓度含量。

当苯胺初始浓度为350mg/L、培养基pH 7.0的条件下，苯胺降解菌BA-4能在28-38℃范围内对苯胺进行有效降解，在30℃时可将苯胺完全降解。温度大于或小于30℃时，该菌株对苯胺的降解率均有不同程度的下降。

酸碱度对Sphingobacterium sp.BA-4降解苯胺的影响

选用Sphingobacterium sp.BA-4能完全降解苯胺的最大浓度350mg/L为初始苯胺浓度，在培养温度为30℃的条件下，研究酸碱度对Sphingobacterium sp.BA-4降解苯胺的影响。

(1)种子液制备：将Sphingobacterium sp.BA-4菌株驯化步骤(8)获得的驯化菌液以2％(V/V)接种量接种于40ml苯胺浓度为350mg/L的发酵培养基(其配方为K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸馏水1000ml，pH 7.0，)中，于30℃、150r/min摇床中培养72h，作为种子液备用；

(2)按步骤(1)中发酵培养基配方配制发酵培养基后，分别以2mol/L的NaOH溶液、1mol/L的HCl溶液调节培养基的酸碱度，分别配置成pH＝5、pH＝6、pH＝7、pH＝8、pH＝9、pH＝10的发酵培养基，121℃灭菌20min待用；

(3)分别将步骤(1)获得的种子液以2％(V/V)接种量接种于酸碱度不同(步骤(2)所示)的40ml苯胺浓度为350mg/L的发酵培养基中，置于30℃、150r/min摇床中培养72h；分别取不同酸碱度条件下培养的菌液10ml用12000r/min离心10min后，分别取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法测定上清液中苯胺浓度含量。

当苯胺初始浓度为350mg/L、培养温度为30℃的条件下，苯胺降解菌BA-4能在pH＝6-9范围内对苯胺进行有效降解，在pH＝7时可将苯胺完全降解。当酸碱度大于或小于pH＝7时，该菌株对苯胺的降解率均有不同程度的下降。