一种解淀粉芽孢杆菌RH9、筛选方法及用途与流程

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌rh9、筛选方法及用途。

背景技术：

抗菌肽对食品中的多种革兰氏阳性及阴性细菌均有较强的杀灭作用，能快速抑制微生物的生长，食用后易被体内蛋白酶水解消化且无毒副作用，在酸性条件下活性很强，具有良好的溶解性和稳定性，是极具发展前景的新型食品防腐剂。

伊枯草菌素a(iturina)及其同系物也属于抗菌肽，主要来源于芽孢杆菌属菌株的次生代谢产物，具有广谱抗病性和不易产生抗药性等优点，对植物和动物病原菌具有较高的抑制活性，尤其具有强烈的抗真菌活性。

解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)是一种可以分泌iturina等抗菌肽物质的芽孢杆菌。由于iturina对丝状霉菌有良好的抑制作用，不仅可以在农业上用于进行生物防治，而且在工业和环境保护上也有着广泛的应用潜力。但实际中，其并未在工业以及环境保护中广泛应用，究其原因，是因为它生产成本巨大，缺乏一种高产iturina的解淀粉芽孢杆菌。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明的目的是提供所述解淀粉芽孢杆菌rh9在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为cgmcc12489，保藏日期为2016年5月23日，该解淀粉芽孢杆菌rh9可以高产iturina，且生产iturina的成本较低。

本发明还提供了一种解淀粉芽孢杆菌rh9的筛选方法，包括以下步骤：

步骤1，原始菌株解淀粉芽孢杆菌rh3的活化；

步骤2，初级诱变

步骤2.1，将活化后的解淀粉芽孢杆菌rh3进行青霉素诱变，获得iturina产量高的第一正突变株和第二正突变株；

步骤2.2，将活化后的解淀粉芽孢杆菌rh3进行亚硝基胍诱变，获得iturina产量高的第三正突变株和第四正突变株；

步骤3，基因组改组

步骤3.1，原生质体制备与再生

利用第一正突变株制备第一正突变株的原生质体溶液；利用第二正突变株制备第二正突变株的原生质体溶液；利用第三正突变株制备第三正突变株的原生质体溶液；利用第四正突变株制备第四正突变株的原生质体溶液；

步骤3.2，原生质体融合

步骤3.2.1，将第一正突变株的原生质体溶液经紫外灭活处理得到第一紫外灭活溶液，将第二正突变株的原生质体溶液经紫外灭活处理得到第二紫外灭活溶液，将第三正突变株的原生质体溶液经紫外灭活处理得到第三紫外灭活溶液，将第四正突变株的原生质体溶液经紫外灭活处理得到第四紫外灭活溶液；

步骤3.2.2，将第一正突变株的原生质体溶液100℃灭活处理得到第一热灭活溶液，将第二正突变株的原生质体溶液100℃灭活处理得到第二热灭活溶液，将第三正突变株的原生质体溶液100℃灭活处理得到第三热灭活溶液，将第四正突变株的原生质体溶液100℃灭活处理得到第四热灭活溶液；

步骤3.2.3，将第一紫外灭活溶液、第二紫外灭活溶液、第三紫外灭活溶液、第四紫外灭活溶液、第一热灭活溶液、第二热灭活溶液、第三热灭活溶液和第四热灭活溶液等体积混合均匀，4℃离心并收集沉淀，得到原生质体混合物沉淀；

步骤3.2.4，将原生质体混合物沉淀重悬于smm缓冲液中，再加入相当于smm缓冲液9倍体积的40％peg6000，室温放置5min，得到重悬液，然后再加入与重悬液体积相同的smm缓冲液，混匀并4℃离心，并用smm缓冲液洗涤沉淀，得到洗涤后的沉淀物；

步骤3.2.5，将洗涤后的沉淀物重悬于smm缓冲液中，涂布rm培养基平板，37℃避光培养至长出单菌落；

步骤3.2.6，挑取步骤3.2.5的单菌落，根据琼脂柱法进行初筛，得到10株以上iturina产量高的初筛菌株；

步骤3.2.7，将10株以上iturina产量高的初筛菌株分别进行iturina发酵，复筛出2-4株iturina产量高的第一轮基因组改组菌株；

步骤3.2.8，利用第一轮基因组改组菌株制备第一轮基因组改组菌株的原生质体溶液；

然后以第一轮基因组改组菌株的原生质体溶液出发，采用步骤3.2.1-步骤3.2.7所述的方法，复筛出2-4株iturina产量高的第二轮基因组改组菌株；

步骤3.2.9，对2-4株iturina产量高的第二轮基因组改组菌株进行遗传稳定性试验分析和iturina发酵，选取其中iturina产量高且遗传稳定性高的一株第二轮基因组改组菌株，命名为解淀粉芽孢杆菌rh9。

优选的，步骤3.1的利用第一正突变株制备第一正突变株的原生质体溶液，具体按照以下步骤实施：制备第一正突变株的菌悬液，然后向第一正突变株的菌悬液中添加溶菌酶，并使溶液中溶菌酶的最终浓度为0.2mg/ml，之后37℃水浴15min，得到第一正突变株的原生质体溶液；

并且所述利用第二正突变株制备第二正突变株的原生质体溶液的步骤；利用第三正突变株制备第三正突变株的原生质体溶液的步骤；利用第四正突变株制备第四正突变株的原生质体溶液的步骤，与利用第一正突变株制备第一正突变株的原生质体溶液的步骤均相同。

优选的，步骤3.2.1的紫外灭活处理的条件为20w紫外灯，灭活60min。

优选的，步骤3.2.2的100℃灭活处理的时间为30min。

优选的，步骤3.2.3和步骤3.2.4中所述4℃离心的转速为2500rpm，时间为10min。

优选的，步骤3.2.4的smm缓冲液的配方为：

每升smm缓冲液中含有以下组分：蔗糖171.14g，mgcl2.6h2o4.07g，顺丁烯二酸2.32g，溶剂为双蒸水；smm缓冲液的ph为6.5。

优选的，步骤3.2.7的iturina发酵采用的容器是体积20l的发酵罐，采用的培养基为landy优化发酵培养基，且每升所述landy优化发酵培养基中含有以下组分：葡萄糖42.0g，l-谷氨酸钠14.0g，mgso40.5g，kcl0.5g，kh2po41.0g，feso40.15mg，mnso45.0mg，cuso40.16mg；landy优化发酵培养基的ph为7.0。

本发明还提供了一种解淀粉芽孢杆菌rh9在生产iturina中的应用。

本发明还提供了一种解淀粉芽孢杆菌rh9在生产含有iturina的产品中的应用。

本发明的目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌rh9，其产生的iturina在农业、工业和环境保护上都具有很好的应用前景。

本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌rh9的筛选方法，是以原生质体融合的方式对包含高产iturina性状的菌株进行多轮基因组随机重组，使各出发菌株的性状不断发生交换，再通过筛选得到高产iturina性状富集的突变菌株，并具有以下优点：

1、能够在未弄清代谢途径或关键酶的情况下，通过较小的工作量在较短时间内获得高产iturina的解淀粉芽孢杆菌rh9，2轮基因组重排与20轮传统诱变筛选的结果相当；

2、与其他分子育种技术相比，该方法简单，易于操作；

3、该方法基于原生质体融合，经基因组重排产生的高产iturina的解淀粉芽孢杆菌rh9不被认为是“转基因”，从而避免了公众对转基因生物使用的疑虑。

生物材料保藏信息说明

1、解淀粉芽孢杆菌rh3，已于2016年5月23日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc12488，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，分类命名为解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens。

2、解淀粉芽孢杆菌rh9，已于2016年5月23日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc12489，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，分类命名为解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens。

附图说明

图1为解淀粉芽孢杆菌rh3和解淀粉芽孢杆菌rh9抑菌实验对照图；

图2为解淀粉芽孢杆菌rh3和解淀粉芽孢杆菌rh9在20l的发酵罐中细胞的生长，葡萄糖消耗和iturina产量对照；

图3为ituc基因mrna表达量分析图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

本发明以下实施例中，若没有特殊说明，所用试剂皆可在市场上购买得到，若没有特殊说明，所涉及的方法皆为常规方法。

本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌rh9，所述解淀粉芽孢杆菌rh9在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为cgmcc12489。

基于同一种发明构思，本发明还提供了上述解淀粉芽孢杆菌rh9的筛选方法，包括以下步骤：

步骤1，原始菌株的活化

原始菌株为解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)rh3(以下简称rh3菌株)，按照常规方法对rh3菌株进行活化。

步骤2，初级诱变

步骤2.1，青霉素诱变

步骤2.1.1，将活化后的rh3菌株接种于100ml的bpy液体培养基中，37℃，180rpm培养12-14h，至对数生长期，得到对数期种子液。

步骤2.1.2，将对数期种子液稀释10^-4倍，然后将稀释度为10^-4倍对数期种子液、青霉素和bpy琼脂培养基按1∶1∶18的体积比例混合均匀，加入培养皿中，其中青霉素的效价为0.5u/ml，bpy琼脂培养基的温度为40-50℃，待bpy琼脂培养基凝固后，然后将平板倒置于37℃培养至有若干单菌落长出。

步骤2.1.3，挑取若干步骤2.1.2中的单菌落，制备菌株初筛平板，用琼脂柱法进行初筛，其中，初筛平板中青霉素和bpy琼脂培养基按1∶18的体积比例混合均匀，且青霉素的效价为0.5u/ml，观察抑菌圈大小。

步骤2.1.4，挑取步骤2.1.3中抑菌圈大的若干菌株，利用landy优化发酵培养基进行iturina发酵，利用甲醇提取iturina，hplc测定iturina含量，复筛出iturina产量较高的第一正突变株和第二正突变株。

需要说明的是，对数期种子液的稀释梯度以最终bpy平板上长出的菌落数在30-300个为准，通过显微镜计数，发现对于rh3菌株的对数期种子液以稀释10^-4倍为最佳。

步骤2.2，亚硝基胍(ntg)诱变

步骤2.2.1，将活化的rh3菌株培养至对数生长期，离心，洗涤，收集菌体，重悬于无菌水中，制备菌体浓度为10⁸cfu/ml的菌液。

步骤2.2.2，分别制备含有ntg浓度为100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml的pda液体培养基。

步骤2.2.3，取10ml步骤2.2.1的菌液，等分为5份，分别对应的接种至含有ntg浓度为100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml的pda液体培养基中，置于37℃下培养过夜(12-16h)，离心，洗涤，混匀后稀释适当倍数，涂布于pda平板上，37℃培养24h后观察抑菌圈大小；

或者将ntg固体颗粒直接均匀铺满涂布了步骤2.2.1的菌液的pda平板上，37℃培养24h后观察抑菌圈大小

步骤2.2.4，挑取步骤2.2.3中抑菌圈大的若干菌株，利用landy优化发酵培养基进行iturina发酵，利用甲醇提取iturina，hplc测定iturina含量，复筛出iturina产量较高的第三正突变株和第四正突变株。

步骤3，基因组改组(genomeshuffling)

步骤3.1，原生质体制备与再生

利用第一正突变株制备第一正突变株的原生质体溶液；利用第二正突变株制备第二正突变株的原生质体溶液；利用第三正突变株制备第三正突变株的原生质体溶液；利用第四正突变株制备第四正突变株的原生质体溶液：

步骤3.1.1，将第一正突变株于bpy液体培养基中培养至菌体浓度均达10⁶个/ml，得到第一正突变株菌悬液，并将第一正突变株菌悬液与bpy液体培养基按5∶95的体积比例混合，于37℃，180rpm振荡培养4h；4℃，4000rpm离心10min收集第一正突变株菌体；用无菌水重悬第一正突变株菌体至浓度为10⁷-10⁸cfu/ml，得到第一正突变株菌体菌悬液，适当稀释后涂布于pda培养基平板上，记录酶解前菌落数。

步骤3.1.2，向第一正突变株菌体菌悬液添加溶菌酶，并使溶菌酶的终浓度为0.2mg/ml；37℃水浴15min，得到第一正突变株菌体原生质体溶液，适当稀释后涂布于pda培养基平板上，记录未形成原生质体的菌落数。

步骤3.1.3，将原生质体溶液用smm缓冲液适当稀释后，涂布于再生pda培养基平板上，记录酶解后再生菌落数。

所述再生pda培养基为，向每升pda培养基内添加35.1gnacl。

需要说明的是，步骤3.1.1、步骤3.1.2和步骤3.1.3中所述的适当稀释是指以每个平板上最终长出的菌落数为30-300个为参考因素。

步骤3.1.4，计算第一正突变株的原生质体形成率和原生质体再生率。

原生质体形成率(％)＝(m-n)/m×100％

原生质体再生率(％)＝(r-n)/(m-n)×100％

其中：m：酶解前菌落数；n：未形成原生质体的菌落数；r：酶解后再生菌落数。

步骤3.1.2，采用步骤3.1.1-步骤3.1.2中所述的方法，利用第二正突变株制备第二正突变株的原生质体溶液。

步骤3.1.3，采用步骤3.1.1-步骤3.1.2中所述的方法，利用第三正突变株制备第三正突变株的原生质体溶液。

步骤3.1.4，采用步骤3.1.1-步骤3.1.2中所述的方法，利用第四正突变株制备第四正突变株的原生质体溶液。

步骤3.2，原生质体融合

步骤3.2.1，将第一正突变株的原生质体溶液经紫外灭活处理得到第一紫外灭活溶液，将第二正突变株的原生质体溶液经紫外灭活处理得到第二紫外灭活溶液，将第三正突变株的原生质体溶液经紫外灭活处理得到第三紫外灭活溶液，将第四正突变株的原生质体溶液经紫外灭活处理得到第四紫外灭活溶液，其中紫外灭活处理的条件为20w紫外灯，且紫外灯与原生质体溶液之间的距离为15cm，灭活时间为60min。

步骤3.2.2，将第一正突变株的原生质体溶液100℃灭活处理得到第一热灭活溶液，将第二正突变株的原生质体溶液100℃灭活处理得到第二热灭活溶液，将第三正突变株的原生质体溶液100℃灭活处理得到第三热灭活溶液，将第四正突变株的原生质体溶液100℃灭活处理得到第四热灭活溶液，其中100℃灭活处理的时间为30min。

步骤3.2.3，将第一紫外灭活溶液、第二紫外灭活溶液、第三紫外灭活溶液、第四紫外灭活溶液、第一热灭活溶液、第二热灭活溶液、第三热灭活溶液和第四热灭活溶液各取0.5ml(各溶液的体积相同)，混合均匀，4℃，2500rpm离心10min，收集沉淀，得到原生质体混合物沉淀。

步骤3.2.4，将原生质体混合物沉淀重悬于0.5mlsmm缓冲液中，再加入相当于smm缓冲液9倍体积(4.5ml)的40％peg6000，室温放置5min，得到重悬液，然后再加入与重悬液体积相同(加入5ml)的smm缓冲液，混匀，4℃，2500rpm离心10min，并用smm缓冲液洗涤沉淀，得到洗涤后的沉淀物。

其中，40％peg6000是指peg6000的体积浓度为40％。

步骤3.2.5，将洗涤后的沉淀物重悬于100μlsmm缓冲液中，适当稀释后涂布rm培养基平板，37℃避光培养至长出单菌落(培养时间为24h左右)。

步骤3.2.6，挑取若干步骤3.2.5的单菌落，分别于pda液体培养基中培养，然后根据琼脂柱法将培养液添加于pda培养基平板上，根据抑菌圈的大小进行初筛，其中以大肠杆菌为指示菌，得到10株以上iturina产量高的初筛菌株。

步骤3.2.7，将步骤3.2.6的10株以上的初筛菌株采用landy优化发酵培养基进行iturina发酵，利用甲醇提取iturina，hplc测定iturina含量，复筛出2-4株iturina产量高的第一轮基因组改组菌株。

其中iturina发酵使用的培养基为landy优化发酵培养基。

步骤3.2.8，采用步骤3.1.1-步骤3.1.2中所述的方法，利用第一轮基因组改组菌株制备第一轮基因组改组菌株原生质体溶液；

然后第一轮基因组改组菌株的原生质体溶液出发，采用步骤3.2.1-步骤3.2.7所述的方法，复筛出2-4株iturina产量高的第二轮基因组改组菌株。

步骤3.2.9，对2-4株iturina产量高的第二轮基因组改组菌株进行遗传稳定性试验分析，并利用hplc检测iturina产量，选取其中iturina产量高且遗传稳定性高的一株第二轮基因组改组菌株，命名为解淀粉芽孢杆菌rh9，以下简称rh9菌株。

图1为rh3菌株和rh9菌株抑菌实验对照图，其中图1a为rh3菌株的抑菌圈，图1b为rh9菌株的抑菌圈，由图1可知，rh9菌株的抑菌圈明显大于rh3菌株的抑菌圈，说明rh9的iturina产量有显著提高。

rh9菌株产iturina的hplc分析，包括：

制备rh9菌株种子液，rh9菌株种子液按体积分数5％的接种量接种于landy优化发酵培养基中，在32℃，150rpm下培养36h，得到iturina发酵液；将iturina发酵液以4℃，5000rpm离心20min，除去菌体，收集上清液；用6mol/l的hcl将上清液调节到ph＝2，然后静置过夜，静置过夜时间为12-16h；4℃，5000rpm离心20min，收集沉淀，加入5ml甲醇，后用naoh中和至ph＝7，获得iturina粗提物。经过高效液相色谱(hplc，agilent1100series)分析，结果如表1所示，与rh3菌株相比，rh9菌株的iturina产量从39.31mg/l提高到119.1mg/l，提高了3.03倍。

表1hplc测定rh3菌株和rh9菌株的iturina产量

rh3菌株和rh9菌株在发酵罐中发酵性能比较：

为了进一步检验rh9菌株高产iturina，rh3菌株和rh9菌株分别在20l发酵罐中，以初始葡萄糖浓度为42g/l进行iturina发酵，图2为rh3菌株和rh9菌株在20l的发酵罐中细胞的生长，葡萄糖消耗和iturina产量对照；

rh9菌株iturina的产量最高浓度为359.1mg/l，是rh3菌株的6.65倍。rh9菌株在同等条件下也表现出比rh3菌株较好的菌体增长和更快速的葡萄糖消耗。

图3为ituc基因mrna表达量分析图，利用荧光定量pcr研究iturina合成酶基因ituc在高产突变菌株与出发菌株转录水平上表达量的差异，2^-δδct相对定量法分析显示，rh3菌株中酶基因ituc的相对表达量是rh9菌株中酶基因ituc的相对表达量的8.97倍。

需要说明的是，本发明所述的smm缓冲液起到渗透压稳定剂的作用，其配方为：

每升所述smm缓冲液中含有以下组分：蔗糖171.14g，mgcl2.6h2o4.07g，顺丁烯二酸2.32g，溶剂为双蒸水；smm缓冲液的ph为6.5，115℃，20min。

需要说明的是rh9的培养条件如下：

斜面培养基：pda培养基(1l)配方：马铃薯洗净去皮，切成1cm×1cm×1cm小丁，称取200-300g，煮沸半小时，八层纱布过滤取汁，加入20.0g葡萄糖，蒸馏水定容至1000ml，再加入15-20g琼脂，121℃，20min，自然ph。

斜面培养方法：37℃培养24h。

种子培养基：bpy培养基(1l)配方：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，葡萄糖10.0g，nacl5.0g，溶剂为水，ph7.0，121℃，20min。

种子液培养方法：每100ml种子培养基中接种2环接斜面菌种，32℃，150rpm培养36h。

发酵培养基：landy优化发酵培养基(1l)配方：葡萄糖42.0g，l-谷氨酸钠14.0g，mgso40.5g，kcl0.5g，kh2po41.0g，feso40.15mg，mnso45.0mg，cuso40.16mg，溶剂为水，ph7.0，115℃，20min。

发酵培养方法：种子液按体积分数5％的接种量接种于发酵培养基中，32℃，150rpm培养36h。

需要说明的是，对rh9菌株进行测序，序列如下：

cagctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtctgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttatggagccagccgccgaaggtggacagatgatg

将测得的序列于ncbi中http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi进行同源性搜索比对，并使用blastn2.2.31系统在genbank中进行同源性搜索，发现序列相似度最高的为解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciensbab128)，序列相似度为100％，表明该菌株属于解淀粉芽孢杆菌属。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。