一株解淀粉芽孢杆菌、由其制备的抑菌剂及用途的制作方法

本发明属于微生物领域，更具体地，涉及一株解淀粉芽孢杆菌、由其制备的抑菌剂及用途。

背景技术：

我国是世界水产养殖大国，年养殖产量达5千多万吨，占世界总产量的71％。但是每年由水产病害造成的损失产量占15％以上，经济损失高达1500亿元。已知的水产养殖病害有100多种，病原种类有300多种，其中，细菌性病原种类占54.9％。而致病性弧菌、杀鲑气单胞菌是水产动物传染性疾病中最主要的病原菌。由弧菌引起的疾病，流行面积广，发病率高，给养殖业造成了巨大危害。鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、创伤弧菌(V.vulnificus)、杀鲑弧菌(V.salmonicida)等很多种弧菌可以引起鱼类病害，某些种类也会导致人或其他动物发病。另外，杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)也是水产养殖动物常见的病原菌。杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)主要感染鲑科鱼类发生疖疮病。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，在生产中感染导致暴发性出血病。

目前在水产动物疾病防治中主要使用广谱抗生素，据专家调查，中国每年生产抗生素原料大约21万吨，其中有9.7万吨抗生素用于畜牧水产养殖业，占抗生素年总产量的46.1％。虽然使用抗生素能够有效地控制养殖动物疾病的发生和蔓延，但在实际生产中存在盲目使用和药物滥用现象，水产养殖中的抗生素滥用有多方面的负面效应。第一，抗生素的盲目使用严重干扰养殖环境和水产动物肠道中有益微生物的正常生长和繁殖，破坏了微生态平衡。第二，水产养殖中，抗生素长期大量、不规范的使用导致水产动物对病原微生物的易感性，更严重的是导致病原菌的耐药性增强，出现大量耐药细菌、甚至超级细菌。第三，抗生素的使用还会导致其在水生动物体内残留、富集，最终将危害人类的健康。虽然水产品中抗生素的残 留量很低，但对人体健康的潜在危害甚为严重，而且影响深远。第四，抗生素药物残留也造成水产品质量降低，成为水产品销售量和出口贸易量的限制因素。

微生态制剂是现行抗生素及合成药物类饲料添加剂最有效的替代产品之一，具有制造成本低、工艺技术成熟的特点，因此它应该能够以其优越的、有利于人类健康和生态环境保护的产品性能，逐步替代抗生素。养殖生产上实际应用的微生态制剂包括：活菌体、死菌体、菌体成分、代谢产物及具有活性的生长促进物质等部分。因此，发现新的可应用于水产养殖的微生态制剂的菌株具有重要意义。

技术实现要素：

本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)V4，该菌株，可抑制病原性弧菌和病原性气单胞菌的生长和繁殖，从而减少由这些病原菌引起的水产动物传染性疾病的发生和蔓延，降低了水产动物的死亡率。

本发明的一个方面，提供了一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)V4，该菌株已于2014年12月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10149。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

所述的解淀粉芽孢杆菌，分离自海洋循环水养殖环境，该菌株具有以下特性：

菌株在2216E培养基上的菌落形态为：白色，半透明，光滑湿润菌落，稍隆起，圆形齐整菌落；革兰氏染色菌体紫色，为革兰氏阳性菌，杆状；碱性磷酸酶实验阳性；萘酚-AS-BI磷酸水解酶实验阴性；α-葡萄糖苷酶实验阳性；碳水化合物实验：甘露醇阳性；L-阿拉伯糖阳性；D-核糖阳性；D-木糖阳性；D-葡萄糖阳性；D-果糖阳性；D-甘露糖阳性；肌醇阳性；甘露糖醇阳性；山梨醇阳性；甲基-αD-吡喃葡萄糖苷阳性；N-乙酰葡萄糖胺阳性；苦杏仁苷阳性；ARBULIN阳性；七叶灵柠檬酸铁阳性；水杨苷阳性；D-纤维二糖阳性；D-麦芽糖阳性；D-乳糖阳性；D-蜜二糖阳性；D-蔗糖阳性；D-海藻糖阳性；D-棉籽糖阳性；淀粉阳性；糖原阳性；木糖醇阳性；D-龙胆二糖阳性；D-土伦糖阳性；葡萄糖酸钾阳性。

本发明的另一个方面，提供了以上所述的解淀粉芽孢杆菌V4在抑制病原性弧菌和病原性气单胞菌生长和/或繁殖的用途。

在上述技术方案中，所述病原性弧菌包括创伤弧菌、需钠弧菌、哈维氏弧菌和黑海弧菌，所述病原性气单胞菌包括嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌。

本发明还提供了一种抑菌剂，其活性成分为以上所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)V4。

上述抑菌剂的制备方法，包括如下步骤：

将以上所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)V4接入LB液体培养基中培养，培养条件为温度28～32℃，振荡速度180～210rpm，培养时间1～3天，获得的培养液即所述抑菌剂。

优选地，培养温度为30℃，振荡速度200rpm，培养时间2天。

在上述技术方案中，所述LB培养基包括如下成分：蛋白胨8～12质量份，酵母提取物和/或酵母浸膏4～6质量份，氯化钠8～12质量份，蒸馏水970～980质量份，NaOH调pH 7～7.5。

优选地，蛋白胨10质量份，酵母提取物和/或酵母浸膏5质量份，氯化钠10质量份，蒸馏水975质量份，用NaOH调pH 7.2。

本发明的再一个方面，提供一种预防和/或杀灭水产病原性弧菌和水产病原性气单胞菌的方法，向水体中接入以上所述的抑菌剂。

在上述技术方案中，所述病原性弧菌包括创伤弧菌、需钠弧菌、哈维氏弧菌和黑海弧菌，所述病原性气单胞菌包括嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌。

本发明的又一个方面，提供一种降低水产动物死亡率和饲料系数、提高增重率的方法，按0.1％～0.3％体积比向水产动物养殖水体中接入以上所述的抑菌剂。

本发明提供的解淀粉芽孢杆菌V4菌株和/或菌剂在养殖水体通常的育苗和养殖温度下即可产生拮抗病原性弧菌和病原性气单胞菌的细菌素，抑制创伤弧菌、需钠弧菌、哈维氏弧菌、黑海弧菌、嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌的生长和繁殖，能够起到有效地控制由病原性弧菌和病原性气单胞菌引起的水产动物传染性疾病的发生和蔓延的作用，降低了水产动物的死 亡率，促进水产动物的增重。

附图说明

图1解淀粉芽孢杆菌V4菌剂上清液对创伤弧菌(Vibrio vulnificus)生长的抑制；

图2解淀粉芽孢杆菌V4菌剂上清液对需钠弧菌(Vibrio natriegens)生长的抑制；

图3解淀粉芽孢杆菌V4菌剂上清液对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)生长的抑制；

图4解淀粉芽孢杆菌V4菌剂上清液对杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)生长的抑制；

图5解淀粉芽孢杆菌V4菌剂上清液对哈维氏弧菌(Vibrio harveyi PH4)生长的抑制；

图6解淀粉芽孢杆菌V4菌剂上清液对黑海弧菌(Vibrio ponticus)生长的抑制。

具体实施方式

以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。

实施例1菌株的物种鉴定

生物学特性：菌株在2216E培养基上的菌落形态为：白色，半透明，光滑湿润菌落，稍隆起，圆形齐整菌落；革兰氏染色菌体紫色，为革兰氏阳性菌，杆状；碱性磷酸酶实验阳性；萘酚-AS-BI磷酸水解酶实验阴性；α-葡萄糖苷酶实验阳性；碳水化合物实验：甘露醇阳性；L-阿拉伯糖阳性；D-核糖阳性；D-木糖阳性；D-葡萄糖阳性；D-果糖阳性；D-甘露糖阳性；肌醇阳性；甘露糖醇阳性；山梨醇阳性；甲基-αD-吡喃葡萄糖苷阳性；N-乙酰葡萄糖胺阳性；苦杏仁苷阳性；ARBULIN阳性；七叶灵柠檬酸铁阳性；水杨苷阳性；D-纤维二糖阳性；D-麦芽糖阳性；D-乳糖阳性；D-蜜二糖阳性；D-蔗糖阳性；D-海藻糖阳性；D-棉籽糖阳性；淀粉阳性；糖原阳性；木糖醇阳性；D-龙胆二糖阳性；D-土伦糖阳性；葡萄糖酸钾阳性。

分子生物学鉴定：序列表中16S rRNA基因的获得过程以及与现有菌种 的比对结果

菌株V4接入LB液体培养基中培养，培养条件为温度28～32℃，振荡速度180～210rpm，培养时间24小时，取1ml液体培养液于1.5ml离心管中，8000r/min离心5min，弃上清液，加入500μl ddH₂O，重悬细胞，将细胞悬液8000r/min离心5min，弃上清液，加入100μl ddH₂O重悬细胞，再将离心管放入沸水中煮10min，使细胞裂解，8000r/min离心5min后取上清2μl作为PCR模板，以27F、1492R分别作为上下游引物于50μl反应体系中扩增该菌株的16S rRNA基因。经基因测序后获得V4菌株的16S rRNA序列SEQ ID NO:1所示。

在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)的GenBank等数据库中搜索相近菌株的16S rRNA基因序列，用MEGA软件进行多序列对位排列，采用Neighbor-Joining法构建系统发育树，如下。

实施例2解淀粉芽孢杆菌V4菌剂上清液对创伤弧菌CZ-A2(Vibrio vulnificus)生长的抑制

1.解淀粉芽孢杆菌V4菌剂上清液的制备：

将解淀粉芽孢杆菌V4菌株接种到100mL的LB培养基中，30℃培养24h得到菌剂，将菌剂8000r/min离心10分钟，得到菌剂上清液，将该上清液用一次性针式过滤器过滤得到无菌发酵液。

LB培养基成分：蛋白胨10质量份，酵母浸膏5质量份，氯化钠10质量份，蒸馏水975质量份，pH 7.2。

2.菌剂上清液对创伤弧菌(Vibrio vulnificus)CZ-A2生长的抑制作用：

将创伤弧菌(Vibrio vulnificus)CZ-A2制备菌悬液，100μl菌悬液涂布LB固体平板，将直径6mm的无菌滤纸片置于平板表面，滴加10μl的解淀粉芽孢杆菌V4无菌发酵液于无菌滤纸片上，再将培养皿置于30℃培养箱中培养24小时。观察可见解淀粉芽孢杆菌V4对创伤弧菌产生的抑菌圈， 抑菌圈面积为220.71±6.61mm²(附图1)。

实施例3、解淀粉芽孢杆菌V4菌剂上清液对需钠弧菌(Vibrio natriegens FS-1)生长的抑制

1.解淀粉芽孢杆菌V4菌剂上清液的制备：

按实施例2中步骤1制作解淀粉芽孢杆菌V4菌剂上清液。

2.菌剂上清液对需钠弧菌(Vibrio natriegens FS-1)生长的抑制作用：

将需钠弧菌(Vibrio natriegens)制备菌悬液，100μl菌悬液涂布LB固体平板，将直径6mm的无菌滤纸片置于平板表面，滴加10μl的解淀粉芽孢杆菌V4无菌发酵液于无菌滤纸片上，再将培养皿置于30℃培养箱中培养24小时。观察可见解淀粉芽孢杆菌V4对需钠弧菌产生的抑菌圈,抑菌圈面积为50.24±3.6mm²(附图2)。

实施例4、解淀粉芽孢杆菌V4菌剂上清液对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)生长的抑制

1.解淀粉芽孢杆菌V4菌剂上清液的制备：

按实施例2中步骤1制作解淀粉芽孢杆菌V4菌剂上清液。

2.菌剂上清液对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)生长的抑制作用：

将嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)制备菌悬液，100μl菌悬液涂布LB固体平板，将直径6mm的无菌滤纸片置于平板表面，滴加10μl的解淀粉芽孢杆菌V4无菌发酵液于无菌滤纸片上，再将培养皿置于30℃培养箱中培养24小时。观察可见解淀粉芽孢杆菌V4对嗜水气单胞菌产生的抑菌圈,抑菌圈面积为176.625±5.18mm²(附图3)。

实施例5、解淀粉芽孢杆菌V4菌剂上清液对杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)生长的抑制

1.解淀粉芽孢杆菌V4菌剂上清液的制备：

按实施例2中步骤1制作解淀粉芽孢杆菌V4菌剂上清液。

2.菌剂上清液对杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)生长的抑制作 用：

将杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)制备菌悬液，100μl菌悬液涂布LB固体平板，将直径6mm的无菌滤纸片置于平板表面，滴加10μl的解淀粉芽孢杆菌V4无菌发酵液于无菌滤纸片上，再将培养皿置于30℃培养箱中培养24小时。观察可见解淀粉芽孢杆菌V4对杀鲑气单胞菌产生的抑菌圈,抑菌圈面积为240.41±4.57mm²(附图4)。

实施例6、解淀粉芽孢杆菌V4菌剂上清液对哈维氏弧菌(Vibrio harveyi PH4)生长的抑制

1.解淀粉芽孢杆菌V4菌剂上清液的制备：

按实施例2中步骤1制作解淀粉芽孢杆菌V4菌剂上清液。

2.菌剂上清液对哈维氏弧菌(Vibrio harveyi PH4)生长的抑制作用：

将哈维氏弧菌(Vibrio harveyi PH4)制备菌悬液，100μl菌悬液涂布LB固体平板，将直径6mm的无菌滤纸片置于平板表面，滴加10μl的解淀粉芽孢杆菌V4无菌发酵液于无菌滤纸片上，再将培养皿置于30℃培养箱中培养24小时。观察可见解淀粉芽孢杆菌V4对哈维氏弧菌产生的抑菌圈,抑菌圈面积为47.78±4.62mm²(附图5)。

实施例7、解淀粉芽孢杆菌V4菌剂上清液对黑海弧菌(Vibrio ponticus)生长的抑制

1.解淀粉芽孢杆菌V4菌剂上清液的制备：

按实施例2中步骤1制作解淀粉芽孢杆菌V4菌剂上清液。

2.菌剂上清液对黑海弧菌(Vibrio ponticus B8)生长的抑制作用：

将黑海弧菌(Vibrio ponticus B8)制备菌悬液，100μl菌悬液涂布LB固体平板，将直径6mm的无菌滤纸片置于平板表面，滴加10μl的解淀粉芽孢杆菌V4无菌发酵液于无菌滤纸片上，再将培养皿置于30℃培养箱中培养24小时。观察可见解淀粉芽孢杆菌V4对黑海弧菌产生的抑菌圈,抑菌圈面积为63.59±2.9mm²(附图6)。

实施例8、添加不同比例解淀粉芽孢杆菌V4菌剂对虹鳟生长及存活的 影响

1.解淀粉芽孢杆菌V4菌剂的制备

将解淀粉芽孢杆菌V4菌株接种到实施例2中所述成分的液体LB培养基中，30℃培养24h，所得培养液为解淀粉芽孢杆菌V4菌剂。

2.在道氏虹鳟养殖池中添加不同比例解淀粉芽孢杆菌V4制剂

按体积比0.1％～0.3％比例添加解淀粉芽孢杆菌V4制剂到道氏虹鳟养殖池中，设置对照组，监测道氏虹鳟的初始体重、末期体重、增重率、饲料系数、特定生长率、及死亡率。养殖45天后,与对照组相比，添加组能促进道氏虹鳟的增重，促进比例为17.08～71.22％。同时能降低饲料系数，最高比例达19.49％。同时，与对照组相比，添加组能降低道氏虹鳟的死亡率，比例为27.25～81.86％(见表1)。

表1