本发明属于微生物保藏
技术领域：
，更具体地说，涉及一种高盐有机工业废水处理微生物菌剂保护剂及其应用。
背景技术：
：当前，我国针对一些地区水环境质量差、环境隐患多等问题颁布实施了《水污染防治行动计划》，狠抓工业污染防治是其中重要的一环。有机工业废水是较为典型的工业废水类型之一，其废水特征主要包括高有机污染物、高盐度、难生物降解，这导致常规生物处理方法难以对其实现高效处理。针对这一问题，有研究表明通过向工业废水生物处理系统中投加从自然界中筛选的优势菌种或通过基因组合技术产生的高效菌种，可有效改善生物处理系统的处理效果，因此对有机工业废水处理微生物菌剂的研发日益增多(如中国专利申请号201510719262.8，申请日为2015年10月28日，发明创造名称为：一株青霉素钠降解菌PC-2及其应用，其提供一株青霉素钠降解菌，可用于青霉素生产废水的处理)。由于微生物菌剂是活菌制剂，因此菌剂中菌种会出现失活或者衰亡的现象，严重影响其生产使用及销售运输，制约了其在工业废水处理方面的应用。目前，活菌的保藏方法多为真空冷冻干燥法(如中国专利申请号201410051136.5，申请日为2014年02月14日，发明创造名称为：一种食品工业喜盐菌种的低盐亚低温冷藏方法，其提供了一种工业喜盐菌种的冷冻干燥保藏方法，其将喜盐菌种和含有2％的NaCl(即100mL液体中含有NaCl的量为2g)的保藏液放入安瓿瓶中混合均匀，然后置于-60℃冷冻1d，使保存液充分冷冻凝固，再将冷冻后的含菌种的安瓿瓶放入低温冷冻干燥机内抽真空，待安瓿瓶内的保藏液完全干燥，在强火焰下迅速封口，置于8℃条件下保存。中国专利申请号200810190852.6，申请日为2008年12月31日，发明创造名称为：一种菌种保藏方法，其提供了一种根霉菌丝的冷冻干燥保藏方法，包括以下步骤：(1)将需要保藏的菌种接种到灭过菌的麸皮培养基中；培养基配方为50-60％麸皮、35-45％粉碎后的谷壳、1-2％硝酸钠、1-2％尿素、1-2％米粉、0.2-1％生物素营养添加剂，加入上述混合物相同重量的去离子水，混合均匀即可；(2)当菌丝长到需要的菌龄时，不需分离出菌丝制成菌悬液，直接将冻干液立即加入安瓿管中与培养物混合均匀；冻干液配方为10-20克脱脂牛奶、0.2-0.5克琼脂粉、0.2-0.5克还原型谷胱甘肽、0.1-0.5克阿拉伯胶、0.5-1克叔丁醇，用去离子水定容到100毫升；(3)然后以2℃/分钟的降温速率降温，冷冻干燥；(4)冻干后对盛菌的安瓿管抽真空，然后封口；以及(5)将所得到的管置入低温下保藏。)，通过这些方法虽然可长时间保藏微生物菌剂，但是方法相对繁琐，对设备及技术要求相对较高，且成本相对偏高。常见的保藏方法还有石蜡油低温保藏法、甘油管冷冻保藏法、液氮超低温保藏法等，但仍然是以低温(冷冻)的方式保藏，微生物菌剂使用过程中需要较长时间的复苏期。此外，也有一些微生物菌剂常温保藏方法，通常都是将微生物菌剂直接装瓶，或者简单的通过矿油封面进行保藏，这些方法保藏虽然操作方便、成本低廉，但其保藏有效期短，易染菌且性能退化迅速。微生物菌剂的保藏方法直接影响着了其成本和效果，成为推广应用的技术瓶颈，因此提供一种高效经济可行的长效保藏技术与方法显得尤为重要。技术实现要素：1.要解决的问题针对现有的微生物菌剂保藏方法存在方法繁琐、要求低温或保藏有效期短、易染菌且性能退化迅速的问题，本发明的目的之一是提供一种高盐有机工业废水处理微生物菌剂保护剂，其由抗氧化剂、缓冲剂、营养剂和抑制剂组成，使得微生物菌剂可以在常温下进行保藏，且保藏的微生物菌剂不易染菌，性能稳定。2.技术方案为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：一种高盐有机工业废水处理微生物菌剂保护剂，其由抗氧化剂、缓冲剂、营养剂和抑制剂组成。更进一步地，所述的抗氧化剂成分为抗坏血酸和柠檬酸，其中抗坏血酸在保护剂中的添加浓度为0.003％～0.03％，柠檬酸在保护剂中的添加浓度为0.005％～0.1％。更进一步地，所述的缓冲剂成分为磷酸盐缓冲液与甘油，其体积配比为(1～4):1，其中磷酸盐缓冲液浓度为0.05mol/L。更进一步地，所述的营养剂成分为有机工业废水特征污染物与复合营养液，其中特征污染物在保护剂中的添加浓度为0.02％～0.2％，复合营养液在保护剂中的添加浓度为0.1％～0.6％。更进一步地，所述的高盐有机工业废水为盐度高于1％、COD浓度高于2000mg/L的工业废水。更进一步地，所述的复合营养液的组成成分及各组分的质量分数为：0.8～3‰氯化铁、0.08～0.3‰硼酸、0.01～0.03‰硫酸铜、0.09～0.36‰碘化钾、0.1～0.3‰氯化锰、2.5～10‰氯化钙、0.03～0.12‰钼酸钠、0.06～0.24‰硫酸锌、0.08～0.3‰氯化钴、5～20‰硫酸镁、35～140‰氯化铵、5～20‰EDTA-4Na，余量为水。更进一步地，所述的复合营养液的制备方法为：按比例将各组分物质溶入适量水中，在25～40℃条件下超声溶解，然后定容。更进一步地，所述的复合营养液的pH为6.5～7.8。更进一步地，所述的抑制剂成分为硫酸钠和氯化钠中的一种或两种，其中硫酸钠或氯化钠在保护剂中的添加浓度为1％～5％；硫酸钠和氯化钠在保护剂中的添加浓度为1％～5％，两者的质量配比为(1:9)～(9:1)。更进一步地，上述的高盐有机工业废水处理微生物菌剂保护剂在微生物菌剂保藏领域中的应用。3.有益效果相比于现有技术，本发明的有益效果为：(1)本发明的高盐有机工业废水处理微生物菌剂保护剂，其由抗氧化剂、缓冲剂、营养剂和抑制剂等组成，抗氧化剂成分为抗坏血酸与柠檬酸，其可对微生物菌剂快速脱氧，从而减缓菌株衰亡，以维持微生物菌剂长时间保藏后仍有较高活性；缓冲剂成分为磷酸盐缓冲液与甘油，其可使维持微生物菌剂体系稳定，进一步提高菌株存活率；营养剂成分为有机工业废水特征污染物与复合营养液，其可降低微生物菌剂降解性能受环境变化的影响；抑制剂成分为硫酸钠或氯化钠或硫酸钠和氯化钠，防止微生物菌剂受到杂菌污染，菌剂保护剂中有效成分根据菌剂特性按一定浓度添加至菌剂中，并置于室温保藏；(2)本发明的保护剂可使高盐有机工业废水处理微生物菌剂在常温下保藏，相较于冷藏保藏及低温干燥保藏，本保藏方法成本低廉、使用方便，可有效减少保藏和运输成本，进一步保障微生物菌剂在高盐有机工业废水处理的实际应用；(3)本发明的保护剂针对高盐有机工业废水特征，使用廉价的硫酸钠或氯化钠或硫酸钠和氯化钠作为抑制剂减少杂菌污染，相较于其他抑制剂而言，成本低廉，保护效果好，实用价值高；(4)本发明的保护剂具有营养剂成分，可有效保持菌剂性能、延长菌剂使用寿命并减少微生物菌剂所需复苏时间，可满足微生物菌剂应用于高盐有机工业废水处理系统的需要，具有较高的实用价值。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。本发明的微生物菌剂保护剂主要对针对处理高盐有机工业废水的微生物菌剂研究的，高盐一般定义为废水中盐度高于1％，高有机一般定义为废水中COD浓度高于2000mg/L，高盐有机废水定义即为符合两者定义的工业废水。该类工业废水中的特征污染物包括但不仅限于本发明中指出的青霉素、苯酚、苯二甲酸这些。包含其他特征污染物的高盐有机工业废水的处理微生物菌剂保护剂基于的原理与本发明一致，也适用于本发明的技术方案。实施例1青霉素废水处理微生物菌剂室温保藏(1)青霉素废水处理微生物菌剂存活率按2％(V/V)的比例将青霉素废水处理微生物菌剂种子液接种至1升发酵培养液中(发酵培养液配方为：蛋白胨10g，牛肉膏6g，硫酸钠40g，加生理盐水定容至1000mL，调节pH值至6.5)，在温度为30℃和震荡速度为150r/min条件下避光振荡培养至稳定期。通过平板计数法对稳定期发酵液进行活菌数量测定，并对发酵液进行稀释，使其活菌数量为1010cfu/ml。然后，将稀释后的发酵液在5000rpm下离心20分钟后，弃掉剩余发酵液，留下菌种，最后将1L微生物菌剂保存剂分别按表1中的配方含量加入菌种中，得到青霉素废水处理微生物菌剂。通过平板计数法对菌剂进行活菌计数，比较上述青霉素废水处理微生物菌剂不同保藏条件和时间下菌种的存活率。配方中的复合营养液由0.8‰氯化铁、0.08‰硼酸、0.01‰硫酸铜、0.09‰碘化钾、0.1‰氯化锰、2.5‰氯化钙、0.03‰钼酸钠、0.06‰硫酸锌、0.08‰氯化钴、5‰硫酸镁、35‰氯化铵、5‰EDTA-4Na、水组成，按比例将各组分物质溶入适量水中，在30℃条件下超声溶解，然后定容至1000mL，pH调节至6.5。结果如表1所示，可以发现加入保护剂后，微生物菌剂存活率明显上升，由29.8～64.8％提高为78.4～98.2％。表1不同保藏条件和时间下菌种的存活率结果(2)青霉素废水处理微生物菌剂处理效果将上述保存半年及一年的微生物菌剂用于青霉素废水处理，按2％(V/V)的比例将青霉素废水处理微生物菌剂接种于青霉素废水液体培养基中(硫酸铵2g，磷酸二氢钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.2g，青霉素0.2g，加生理盐水定容至1000mL，调节pH值至7.0-7.3)，分别于24h、48h、96h取样测定青霉素浓度，考察不同保藏条件和时间下微生物菌剂对青霉素废水的处理效果。结果如表2所示，可以发现加入保护剂后，微生物菌剂仍保持较好的处理效果，96h后青霉素去除率仍能达到90％。表2不同保藏条件和时间下菌剂的青霉素处理效果(以去除率计，％)序号24h48h96h序号24h48h96h1-0.5Y36.268.892.71-1Y28.958.978.82-0.5Y32.266.291.62-1Y27.654.274.63-0.5Y35.367.992.13-1Y30.456.376.24-0.5Y38.269.693.34-1Y32.363.379.35-0.5Y44.376.296.75-1Y36.772.287.76-0.5Y45.878.897.36-1Y38.273.290.27-0.5Y19.838.254.87-1Y12.324.837.2注：1～7与表1中1～7号保护剂配方一致，0.5Y表示保存半年的菌剂，1Y表示保存一年的菌剂。(3)青霉素废水处理微生物菌剂染菌情况按(1)中保护剂配方配制保存菌剂，将菌剂置于敞口三角瓶中，在温度为30℃和震荡速度为150r/min条件下放置7d，通过测定菌剂浑浊度(OD660)观察菌剂杂菌污染情况，其中不大于0.01为未染菌，0.01～0.1为轻度染菌，0.1～0.5为中度染菌，大于0.5为中度染菌。具体结果如表3所示，可以发现加入保护剂后，微生物菌剂受杂菌污染程度明显降低。表3微生物菌剂保藏染菌实验结果序号1d2d4d7d1未染菌未染菌轻度染菌轻度染菌2未染菌未染菌未染菌轻度染菌3未染菌未染菌未染菌轻度染菌4未染菌未染菌未染菌轻度染菌5未染菌未染菌未染菌未染菌6未染菌未染菌未染菌未染菌7轻度染菌中度染菌重度染菌重度染菌注：1～7与表1中1～7号保护剂配方一致。根据上述结果可以发现，6号配方的微生物菌剂保护剂保藏效果最好，其次为5号。实施例2苯酚废水处理微生物菌剂室温保藏按1％(V/V)的比例将苯酚废水处理微生物菌剂种子液接种至1升发酵培养液中(发酵培养液配方为：蛋白胨10g，牛肉膏6g，氯化钠10g，苯酚0.1g，加生理盐水定容至1000mL，调节pH值至7.3)，在温度为35℃和震荡速度为120r/min条件下避光振荡培养至稳定期。通过平板计数法对稳定期发酵液进行活菌数量测定，并对发酵液进行稀释，使其活菌数量为1010cfu/ml。然后，将稀释后的发酵液在8000rpm下离心10分钟后，弃掉剩余发酵液，留下菌种，最后在菌种中加入1L配方为5和6号(实施例1的表1中的序号)的微生物菌剂保存剂(与实施例1的表1中的5号和6号配方不同的是，将配方中的青霉素换成苯酚)，得到酚废水处理微生物菌剂。配方中的复合营养液由3‰氯化铁、0.3‰硼酸、0.03‰硫酸铜、0.36‰碘化钾、0.3‰氯化锰、10‰氯化钙、0.12‰钼酸钠、0.24‰硫酸锌、0.3‰氯化钴、20‰硫酸镁、140‰氯化铵、20‰EDTA-4Na、水组成，按比例将各组分物质溶入适量水中，在40℃条件下超声溶解，然后定容至1000mL，pH调节至7.0。按1％(V/V)将按上述方法得到的苯酚废水处理微生物菌剂接种于苯酚废水液体培养基中(硫酸铵2g，磷酸二氢钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.2g，苯酚0.3g，加生理盐水定容至1000mL，调节pH值至7.0)按1％(V/V)的比例将添加5和6号配方保护剂(实施例1的表1中的序号，与实施例1的表1中的5号和6号配方不同的是，将配方中的青霉素换成苯酚)的苯酚废水处理微生物菌剂接种于苯酚废水液体培养基中(硫酸铵2g，磷酸二氢钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.2g，苯酚0.3g，加生理盐水定容至1000mL，调节pH值至7.0)，分别于24h、48h、96h取样测定苯酚浓度，考察不同保藏条件和时间下微生物菌剂对苯酚废水的处理效果。结果如表4所示，可以发现加入保护剂后，微生物菌剂仍保持较好的处理效果，96h后苯酚去除率仍能达到90％左右。表4不同保藏条件和时间下菌剂的苯酚处理效果(以去除率计，％)注：5.6.7与表1中5.6.7号保护剂配方基本一致，所不同的是将青霉素替换为苯酚。实施例3苯二甲酸废水处理微生物菌剂室温保藏按2％(V/V)的比例将苯二甲酸废水处理微生物菌剂种子液接种至1升发酵培养液中(发酵培养液配方为：蛋白胨10g，牛肉膏6g，氯化钠10g，苯二甲酸0.3g，加生理盐水定容至1000mL，调节pH值至7.3)，在温度为35℃和震荡速度为120r/min条件下避光振荡培养至稳定期。通过平板计数法对稳定期发酵液进行活菌数量测定，并对发酵液进行稀释，使其活菌数量为1010cfu/ml。然后，将稀释后的发酵液在5000rpm下离心30分钟后，弃掉剩余发酵液，留下菌种，最后在菌种中加入1L配方为5和6号(实施例1的表1中的序号，与实施例1的表1中的5号和6号配方不同的是，将配方中的青霉素换成苯二甲酸)的微生物菌剂保存剂，得到苯二甲酸废水处理微生物菌剂。配方中的复合营养液由1.5‰氯化铁、0.15‰硼酸、0.02‰硫酸铜、0.018‰碘化钾、015‰氯化锰、5‰氯化钙、0.06‰钼酸钠、0.12‰硫酸锌、0.15‰氯化钴、10‰硫酸镁、70‰氯化铵、10‰EDTA-4Na组成，按比例将各组分物质溶入适量水中，在25℃条件下超声溶解，然后定容至1000mL，pH调节至7.2。按1％(V/V)将按上述方法得到的苯二甲酸废水处理微生物菌剂接种于苯二甲酸废水液体培养基中(硫酸铵2g，磷酸二氢钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.2g，苯二甲酸1g，加生理盐水定容至1000mL，调节pH值至7.2)，分别于24h、48h、96h取样测定苯二甲酸浓度，考察不同保藏条件和时间下微生物菌剂对苯二甲酸废水的处理效果。结果如表4所示，可以发现加入保护剂后，微生物菌剂仍保持较好的处理效果，96h后苯二甲酸去除率仍能达到90％左右。表5不同保藏条件和时间下菌剂的苯二甲酸处理效果(以去除率计，％)注：5.6.7与表1中5.6.7号保护剂配方基本一致，所不同的是将青霉素替换为苯二甲酸。当前第1页1 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