一种采用复合微生物菌剂用于高羊茅抗低温的方法
【专利摘要】本发明公开了一种风干污泥菌剂应用于高羊茅抗低温的方法。它包括施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液或施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌200倍稀释液。本发明的研制结果表明，施加施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌的复合菌剂能够显著提高高羊茅株高、地上生物量和叶绿素含量，提高其抗寒性。施加微生物菌剂后的高羊茅返青要比空白对照早5天左右，并且返青后的草坪外观综合指标也显著高于空白对照。这充分显示了该复合微生物菌剂在实际中的应用潜力。
【专利说明】一种采用复合微生物菌剂用于高羊茅抗低温的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于环境保护【技术领域】，涉及风干污泥菌剂应用于高羊茅抗低温的方法。【背景技术】
[0002]草坪作为城市园林绿化的重要组成部分，其发挥的生态效益和存在的经济效益已逐渐被人们所熟知。首先，草坪作为一个生态系统，它是一个庞大的碳源贮存库，草坪植被可以同化大气中的CO2,而草坪土壤同样可以吸大气中的CO2。Lal研究表明，世界上草地土壤每年可以吸收沉积0.01-0.3Gt碳。因此减少了空气中CO2，在一定程度上减轻温室效应。其次，草坪所形成的致密的地表覆盖层和草根层具有良好的防治土壤侵蚀的作用。第三，草坪具有吸附空气中SO2及NO2等有毒害的气体同时释放出供人类呼吸的氧气。第四，草坪能减缓地表的日光辐射，太阳射到地面的热量50%左右可以被绿色植物的蒸腾作用所吸收。第五，草坪还具有降低噪声的作用。一块20m宽的草坪，能减弱噪声2分贝左右。最后，城市草坪是人类 文明的产物，它既可以美化环境，又可以不为人们提供休息、娱乐和竞技的场所等重要功能。
[0003]草坪建植体系构建是现代城市生态建设中必须考虑的重要内容之一，是现代城市社会发展与经济实力的一个有力体现，草坪建植体系的构建对于改善城市投资环境、吸引外资、促进旅游等各个方面都起着不可忽略的作用，而城市中草坪绿化质量及面积也已成为评价城市环境质量的重要客观标准。草坪绿化也日益受到人们的重视。
[0004]草坪对人类赖以生存的环境起着美化、保护和改善的良好作用。但是草坪草是生存于自然界的开放植物体系，虽然其地理分布范围广泛，如在高温、干旱到寒冷潮湿环境中都有分布，但其生命周期中也常遭受不良环境的影响。其中水分是制约草坪草成坪、生长及维持颜色青绿的主要环境因子。
[0005]草坪的数量和质量是城市绿化水平的重要标志。目前，国内草坪建植的方式多种多样，铺设草皮虽然建坪成本高，但见效快，易操作，适用于所有草坪草，被广大绿化工作者普遍接受。北京市园林绿化局曾在2007年的首届京津地区草皮卷产业论坛上表示，到2020年，北京城市绿地率将达到44%至48%。天津泰达生态园林有限公司也在此介绍，滨海新区要建成宜居生态城区，规划2010年绿化率达额到40%，绿地覆盖率达到35%。因此，草皮卷市场空间非常大。冷季型草最适宜的播种时间是夏末初秋和早春，暖季型草坪草在春末夏初。在播种后40~50d后，草皮上的草坪草的覆盖率达95%以上时即可移坪。所以一般在五、六月份第一批草皮卷才可上市。如果能够缩短草皮生产的年周期，提早草皮上市时间，可大幅提高草皮卷的市场竞争力，提高人们的经济收入。而低温是限制草皮生产周期的主要因素。冬季低温还影响草坪草的绿期应用范围，降低其观赏价值。因此，要提早草皮卷上市时间以及建植高质量的草坪就必须深入细致地研究其抗寒性以便更好地在园林绿化中发挥其作用。
[0006]针对以上问题，目前研究集中于选取抗逆性强的草坪植物、应用保水剂、施加化学改良剂、施肥等措施。而微生物菌剂作为一种高效、环保的生物肥料已得到认可，其抗逆作用方面也有一定研究。
[0007]复合微生物菌剂由两种或两种以上且互不拮抗的微生物菌种按合适比例共同培养，充分发挥群体的联合作用优势，取得较佳应用效果的一种微生物制剂，此类菌剂一般具有有种类全、配伍合理、见效快、投资少、操作简单、不造成二次污染等优点，现已广泛应用于农业、工业、医药和环保等各个领域。
[0008]施肥是农业生产及草坪养护管理中很重要的措施之一。在目前大部分选用的是无机肥。无机肥虽然能够及时补充土壤养分，但是大量使用却能对地表水、地下水以及空气造成污染，对环境构成威胁。施加微生物肥料是在较低的生态影响条件下维持较高产量的更加和谐的一种施肥方式.比如最经典的菌根真菌、根瘤菌、根际促生细菌等。它的优点主要表现在:1.创造良好的根际生态环境。2.提高土壤以及空气造成污染的供肥能力3.对环境资源的有效利用。4.降低作物对化肥的依赖。5.抑制病虫害的发生。其原因一是有益细菌的大量繁殖大植物根隙区域形成优势种群，抑制了病原微生物生长繁殖，降低了植物酶、多酚氧化酶等，参与植物的防御反应，提高植物的抗病虫害能力。。6.减少农药污染等具有重要作用。同时，以城乡有机废弃物为基质，采用现代化的工业技术，制造成具有多种功能(如固氮、解磷、活钾等)再生型复合生物肥料，将对资源的循环利用，实现生态经济、社会效益一体化同样具有重要意义。
[0009]自20世纪70年代以来，欧美日本等国家或地区都相继研制成功了一些复合菌剂，很多已经开始进行大规模的生产，并形成了系列化的产品，主要用于处理生活污水，工农业废水以及其他一些化合物污染的治理。我国国内微生物发展状况经历了从50年代到90年代，从理论到实践，从单一菌种的利用到多个的混合应用，产品也从根瘤菌剂发展到复合微生物菌剂，相继取得了一些成果。
[0010]目前多数研究已表明，微生物制剂应用于农业生产，能促进植物生长，且无毒、无公害、无污染，能持久均衡地供给农作物氮磷钾元素的，被广泛开发用作生物肥料。目前研发的生物菌肥的热点产品主要包括:有机物料腐熟菌剂(也称发酵菌剂)、土壤修复菌剂、根瘤菌剂和溶磷菌剂、烟草等经济作物专用的功能菌剂、生物有机肥、抗旱菌剂等。美国哥斯达黎加大学应用EM技术来种植香蕉，有效减小了香蕉叶斑病的发生和线虫类的侵袭，大大提高了其营养价值和生产效率。
[0011]另外，复合微生物菌剂在畜禽养殖和水产养殖方面也有很明显的作用。复合微生物菌剂能防病抗病，提高成活率，提高生产性能，降低饲养成本，增加经济效，改善产品品质，生产绿色食品。倪永珍等对鸡进行400d的EM饲喂结果表明，与对照组比较鸡的死亡率平均下降了 35.5%。据石专林报道，在饲粮中添加5%的EM发酵饲料，可使肉仔鸡增重提高
10.3%，料肉比下降7.8%。刘华周等试验也表明，蛋鸡日粮中EM发酵饲料占20%时，蛋壳厚度增加6.99%，蛋白哈氏单位提高10.31%，蛋黄颜色提高1.5罗氏级。
[0012]目前，给草坪草施加微生物菌剂已有报道。王晓洁，真菌可以改良高羊茅、黑麦草等草坪植物的抗逆作用，提高了其抗寒性、抗旱性、抗水分胁迫以及抵抗生物危害的影响。有研究发现接种菌根真菌可使多年生黑麦草根系受到侵染，并可明显增加多年生黑麦草叶片中叶绿素含量，VA菌根可促进黑麦草对P、F e、Cu、M g、K、B、S 1、S和N等矿质养分的吸收，但却使黑麦草组织中M η的浓度降低。还研究表明，在干旱的条件下，丛枝菌根的侵染、菌丝的发育均良好，接种从枝菌根后，增强了白三叶草的抗旱能力。有也对五种押宝杆菌进行了研究，结果发现施加过微生物菌剂的黑麦草与没有施加菌剂的对照相t匕，其株高、干重、叶绿素含量、根系体积和总表面积、根系活力等都显著升高。
[0013]城市污泥是城市污水处理厂在各级污水处理净化后所产生的含水量75%_99%的固体或者流体状物质。它包括污水中的泥砂、纤维、动植物残体等固体颗粒及其凝结的絮状物，各种胶体、有机物及吸附的金属元素、微生物、病菌、虫卵、杂草种子等综合固体物质。城市污泥中出现的微生物主要由细菌、放线菌、真菌以及原生动物和后生动物等，其中细菌是最主要成分，细菌主要有菌胶团细菌和丝状菌，数量可占污泥中微生物总量的90%~95%左右。
[0014]20世纪80年代之前，活性污泥菌群的研究主要以传统分离培养法为主。该方法从活性污泥中发现的主要优势菌群有:动胶杆菌属、丛毛单胞菌属、不动杆菌属、螺菌属、产碱杆菌属、短杆菌属、黄杆菌属和假单胞菌属等。但是后来大量研究发现，在活性污泥中经典纯培养方法能够培养的细菌数 量只占活性污泥微生物总数的1%~15%。
[0015]20世纪80年代后期，随着以16 S r RNA为主要基石的细菌分子分类学的发展，PCR技术、电泳技术、克隆库技术、荧光原位杂交和流式细胞术逐渐成为研究活性污泥菌群的主要手段，活性污泥中菌群的复杂性和多样性也以惊人的速度被人们认识，大量传统检测方法未能发现却在活性污泥中起关键作用的微生物陆续被发现，如具有除磷作用的类红环菌、小月菌、类Tetr asphaera的棒状菌、俊片菌等；具有脱氮作用的反硝化生丝微菌属、固氮弧菌属相关菌、类硝化螺菌等；与污泥泡沫有关的诺卡氏菌形放线菌、丝状菌和等。
[0016]近期的相关文献及实际生产表明:微生物菌剂在促进植物生长的同时就还能够明显提高植物的抗病、抗旱能力，降低土壤PH和含盐量，提高植物的抗冻能力。尽管植物接种微生物的效应研究报道较多，但大部分研究工作涉及的微生物菌剂只限于从土壤或垃圾堆肥中提取。有关污泥内部微生物菌种之间共生及相互影响关系，以及污泥微生物菌剂应用对植物生长和生理特性的影响方面的研究较少；而在草坪植物抗逆中的应用则更是尚无文献报道。
[0017]城市污泥含有丰富的微生物种类，虽然有些是条件致病菌，但是也含有很多对植物有益菌种。例如假单胞菌的生防促生作用应经得到公认，这方面的研究报道也很多。固氮弧菌属有着高效的固氮作用，他能够侵入水稻、小麦和高粱根内，并提高了幼苗含氮量。并且污泥为微生物提供了一个天然的驯化场所，其微生物具有潜在利用价值。因此筛选污泥中微生物种，群筛选出合适的有益微生物菌株，配制成复合微生物菌剂，研究其对植物的促生作用已经植物在寒冷条件下的影响是完全可行的。
[0018]前面已经探讨了室内条件下，施加污泥复合微生物菌剂对高羊茅生理生态的影响，包括正常条件下污泥微生物菌剂对高羊茅生理生态的影响以及水分胁迫和盐碱胁迫条件下，污泥微生物菌剂对高羊茅抗逆性作用的提高。目前关于微生物菌剂对植物抗逆性方面的研究主要是测定其生理指标，如生物量、保护酶、丙二醛、可溶性糖等指标。但有关污泥微生物菌剂对草坪返青情况以及返青后草坪外观综合评定的研究的报道非常少见。为增强污泥微生物菌剂能提高草坪植物抗逆性的依据，同时也更为贴近实际应用，本技术在寒冷胁迫条件下，施加污泥微生物菌剂，在测定高羊茅生理指标的基础上，同时对高羊茅返青情况以及返青后草坪外观综合指标进行了测定。为污泥微生物在低温条件下应用草坪提供技术。
【发明内容】
[0019]本发明的目的在于提供一种采用复合微生物菌剂用于高羊茅抗低温的方法。本发明研制结果表明，施加施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌的复合菌剂能够显著提高高羊茅株高、地上生物量和叶绿素含量，提高其抗寒性。为实现此目的，本发明提供如下的技术方案:
一种复合微生物菌剂，其特征在于它是由下述成分组成:
施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液或 施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌200倍稀释液；
其中施氏假单胞菌:里氏木霉:黄链霉菌的体积份数比为1:1:1 所述的原料为:施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液。
[0020]本发明进一步公开了一种采用复合微生物菌剂用于高羊茅抗低温的方法，其特征在于按如下的步骤进行:
(1)材料的选择:
选取挑选籽粒饱满、均匀一致的高羊茅(Festuca arundinacea L.)种子为试验材料；供试土壤为 普通园土；
(2)试验方法
复合微生物菌剂制备:选取施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌，将分离出的菌种纯化培养2代，取活化菌种，接入装有200 mL液体培养基的三角瓶中，180 r/min适温培养，选用600 nm波长进行比浊测定，以菌悬液的0D600 nm值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线；选取对数生长期的菌种，按照下面要求配制复合微生物菌剂；
施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液或 施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌200倍稀释液；
其中施氏假单胞菌:里氏木霉:黄链霉菌的体积份数比为1:1:1 ;3菌种的菌落数在(2.15±0.03) X 109/ml~(2.07±0.07) X 109/ml 之间，假单胞菌的 0D600 nm 值为 0.592 ；
(3)实验设计
试验采取室内盆栽的方法，在直径为9 cm的培养皿中加入100 g灭菌土壤，均匀撒入
0.5 g饱满的高羊茅种子。温室种植，每天早晚各浇I次水。待植物生长到15 d后，分别加入施氏假单胞菌、里氏木霉及灰黄链霉菌的复合微生物菌剂的100倍稀释液(CM1)和200倍稀释液(CM2)各15ml (菌液用无菌水稀释)，各处理菌液均按体积比为1:1:1的比例混合后用无菌水稀释。对照组(CK)加入相同量的无菌培养基，实验设4次重复。草坪植物培养期间，温度为12~20°C，相对湿度为25~45%，光照为透入室内的自然光，持续处理20 d后测定各指标。测定高羊茅的株高、单株生物量以及叶绿素。
[0021]在测定完上述指标后再次加入复合微生物菌剂15ml，然后将植物进行低温过度，过度期的温度为5~12°C。过度持续一周。然后按照普通草坪过冬准备来去掉高羊茅中的干草、烂草、枯草，然后将高羊茅剪至4cm左右，浇足越冬水，最后将高羊茅连带培养容器一起放到留有小孔的封口纸箱内，放到阴面无暖气的屋子里过冬。过冬期间温度为_8°(T10°C。持续40天后将植物移到温室培养，进行返青处理，测定其返青情况。
[0022]I材料与方法1.1试验材料
选取挑选籽粒饱满、均匀一致的高羊茅(Festuca arundinacea L.)种子为试验材料。供试土壤为天津师范大学校内园土，pH 7.44，饱和含水量0.58 ml/g，有机质4.68%，全氮 0.21%，有效磷 22.03 mg/kg，全钾 45.61g/kg ；
(1)污泥的选择:
城市污泥取自污水处理厂；供试土壤取自5-15 cm表层土壤,土壤质地为砂质粘土，ρΗ7.44，容重0.87 g/cm,有机质含量4.68%，全氮0.21%，全磷0.15%，全钾0.65%，有效磷22.03 mg/kg，饱和含水量 0.58 mL/g ；
(2)菌株的培养
称取新鲜污泥，采用稀释分离法制备10_3、10_4、10_5、10_6的污泥悬浮液。根据所分离的微生物，取不同浓度的污泥悬浮液(真菌取10_3、10_4，放线菌取10_4、10_5，细菌取10_5、10_6)，摇匀后吸取0.2 mL加入到预先制好的平板中。真菌用马丁氏琼脂平板；放线菌用高氏一号琼脂平板；细菌用牛肉膏蛋白胨平板。用灭菌的涂布器涂抹均匀，每处理重复3次，28°C培养。根据平板 内菌落的形态、大小、色泽和生长速度等特点，从每个样品尽可能多的挑取单菌落划线纯化。依据菌落培养性状和形态特征对菌株进行归类并统计数量。确定优势菌株，进行编号保存，待进一步鉴定。
[0023](3)菌种的鉴定
镜检:细菌的鉴定采用革兰氏染色法，放线菌采用印片法，丝状真菌直接镜下观察。
[0024]PCR鉴定:直接挑取单菌体溶于100 UL高纯水中，沸水中煮10 min裂解菌体，使DNA释放出来，直接作为PCR反应的模版。细菌和放线菌采用通用引物27f (5’ 一AGAGTTTGATCCTGGCTCAG—3，)和 1492R(5’一GGTTACCTTGTTACGACTT — 3，)进行PCR扩增 16SrRNA基因。真菌采用真菌核糖体18S rDNA的通用引物ITSl (5，一TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和 ITS4 (5，— TCCTCCGCTTATTGATATGC 一3，)进行 PCR 扩增。PCR 反应程序如下:940C 2 min, 940C I min,57°C I min,72°C I min，25 个循环；72°C 10 min。扩增产物送至上海美吉基因公司测序。测序结果在NCBI网站上用BLAST软件与GenBank核酸数据库中相关种属的16S rDNA和18S rDNA序列进行同源性比较。
[0025](4)菌剂的配制
选取对植物生长有利的细菌、真菌、放线菌各I种，分别为假单胞菌、木霉和链霉菌，将分离出的菌种纯化培养2代，取活化菌种，接入装有200 mL液体培养基的三角瓶中，180 r/min适温培养，选用600 nm波长进行比浊测定，以菌悬液的0D600 nm值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线。选取对数生长期的菌种，配制成菌剂:
1.2试验方法
复合微生物菌剂制备:选取对植物生长有利的细菌、真菌、放线菌各I种，分别为施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌，将分离出的菌种纯化培养2代，取活化菌种，接入装有200 mL液体培养基的三角瓶中，180 r/min适温培养，选用600 nm波长进行比浊测定，以菌悬液的0D600 nm值为纵坐标,培养时间为横坐标,绘制微生物的生长曲线。选取对数生长期的菌种，按照下面要求配制复合微生物菌剂。
[0026]施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液或 施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌200倍稀释液；其中施氏假单胞菌:里氏木霉:黄链霉菌的体积份数比为1:1:1。
[0027]1.3实验设计
试验采取室内盆栽的方法，在直径为9 cm的培养皿中加入100 g灭菌土壤，均匀撒入
0.5 g饱满的高羊茅种子。温室种植，每天早晚各浇I次水。待植物生长到15 d后，分别加入施氏假单胞菌、里氏木霉及灰黄链霉菌的复合微生物菌剂的100倍稀释液(CM1)和200倍稀释液(CM2)各15ml，对照组(CK)加入相同量的无菌培养基，实验设4次重复。草坪植物培养期间，温度为12~20°C，相对湿度为25~45%，光照为透入室内的自然光，持续处理20d后测定各指标。测定闻羊矛的株闻、单株生物量以及叶绿素。
[0028]在测定完上述指标后再次加入复合微生物菌剂15ml，然后将植物进行低温过度，过度期的温度为5~12°C。过度持续一周。然后按照普通草坪过冬准备来去掉高羊茅中的干草、烂草、枯草，然后将高羊茅剪至4cm左右，浇足越冬水，最后将高羊茅连带培养容器一起放到留有小孔的封口纸箱内，放到阴面无暖气的屋子里过冬。过冬期间温度为_8°C~10°C。持续40天后将植物移到温室培养，进行返青处理，测定其返青情况。
[0029]1.4测定指标
1.4.1低温胁迫条件下高羊茅动态株高变化
高羊茅培植15d后，施加菌剂，10 d第一次测量株高，后每5d测量一次，共3次。
[0030]1.4.2高羊茅单株生物量
施加菌剂20d后，从个处理中随机选取10株高羊茅植株，称量，记录鲜重及干重。以其平均做为该处理的单株生物量。
[0031]1.4.3叶绿素含量的测定
叶绿素含量的测定:取0.1 g叶片，剪成1-2 mm碎片，浸泡于丙酮:乙醇(V:V=1:1)溶液中24小时,浸泡液为待测液。用分光光度计于波长633 nm和645 nm下测量吸光值,并根据公式计算叶绿素含量；计算公式结果计算:
【权利要求】
1.一种复合微生物菌剂，其特征在于它是由下述成分组成: 施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液或 施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌200倍稀释液； 其中施氏假单胞菌:里氏木霉:黄链霉菌的体积份数比为1:1:1。
2.权利要求1所述的复合微生物菌剂，其中所述的原料为:施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液。
3.一种采用复合微生物菌剂用于高羊茅抗低温的方法，其特征在于按如下的步骤进行: (1)材料的选择: 选取挑选籽粒饱满、均匀一致的高羊茅(Festuca arundinacea L.)种子为试验材料；供试土壤为普通园土； (2)试验方法 复合微生物菌剂制备:选取施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌，将分离出的菌种纯化培养2代，取活化菌种，接入装有200 mL液体培养基的三角瓶中，180 r/min适温培养，选用600 nm波长进行比浊测定，以菌悬液的0D600 nm值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线；选取对数生长期的菌种，按照下面要求配制复合微生物菌剂； 施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液或 施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌200倍稀释液； 其中施氏假单胞菌:里氏木霉:黄链霉菌的体积份数比为1:1:1; 3菌种的菌落数在(2.15±0.03) XlO9Ail~(2.07±0.07) X 109/ml之间，假单胞菌的0D600 nm 值为 0.592 ； (3)实验设计 试验采取室内盆栽的方法，在直径为9 cm的培养皿中加入100 g灭菌土壤，均匀撒入0.5 g饱满的高羊茅种子，温室种植，每天早晚各浇I次水，待植物生长到15 d后，分别加入施氏假单胞菌、里氏木霉及灰黄链霉菌的复合微生物菌剂的100倍稀释液和200倍稀释液各15ml，草坪植物培养期间，温度为12~20°C，相对湿度为25~45%，光照为透入室内的自然光，持续处理20 d后测定各指标,测定闻羊矛的株闻、单株生物量以及叶绿素； 在测定完上述指标后再次加入复合微生物菌剂15ml，然后将植物进行低温过度，过度期的温度为5~12°C，过度持续一周，然后按照普通草坪过冬准备来去掉高羊茅中的干草、烂草、枯草，然后将高羊茅剪至4-5 cm，浇足越冬水，最后将高羊茅连带培养容器一起放到留有小孔的封口纸箱内，放到阴面无暖气的屋子里过冬，过冬期间温度为-8-10°C，持续40天后将植物移到温室培养，进行返青处理，测定其返青情况。
4.复合微生物菌剂在促进高羊茅株高、地上生物量和叶绿素含量提高其抗寒性方面的应用。
5.复合微生物菌剂在 促进高羊茅低温条件下株高、干鲜重提高方面的应用。
6.复合微生物菌剂在显著提高低温条件下高羊茅叶绿素含量，提高其抗寒性方面的应用。
【文档编号】A01N63/00GK103931664SQ201410191237
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年5月8日 优先权日:2014年5月8日
【发明者】赵树兰, 多立安, 王志旭 申请人:天津师范大学