本发明属于生物防治领域，具体涉及一种用于防治番茄灰霉病的解淀粉芽孢杆菌；还涉及含有该解淀粉芽孢杆菌的微生物菌剂，以及它们在防治番茄灰霉病上的用途。
背景技术：
：番茄灰霉病是由半知菌亚门的灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)引起的一种重要病害。该病害主要危害果实，造成果实腐烂，也可危害叶、茎和花，造成的产量损失高达20％～50％；严重威胁保护地番茄生产。防治番茄灰霉病的方法主要有：(1)培育抗病品种：这是最为经济有效的方法，但是由于抗源材料有限，以及由于生物的共同进化，不断出现新的病原菌的生理小种，因此培育抗病品种途径效果有限；(2)化学防治：这是防治番茄灰霉病的主要手段，但是使用化学药剂防治存在抗药性丧失和环境污染的问题，严重危害人畜的健康；(3)生物防治：由于具有专化性强、不易产生抗药性、药效持久等优点，日益受到人们的青睐。芽孢杆菌(Bacilliussp)具有分布广、易分离培养、能产生抗逆性较强的芽胞、贮藏期长和使用方便等优点，成为一种理想的生防微生物。目前用于防治番茄灰霉病的芽孢杆菌主要有：地衣芽孢杆菌(CN104232499A)、短小芽孢杆菌(CN101928681A)、解淀粉芽孢杆菌(CN103173397A、CN104531559A、CN105176894A、CN104762223A、CN102604864A、CN105199996A、CN104498386A)、环状芽孢杆菌(CN103952352A)、枯草芽孢杆菌(CN1934241A、CN103074271A、CN101993836A、CN101148650A)、侧孢短芽孢杆菌(CN104480046A)和深褐芽孢杆菌(CN104946567A)等。从以上可以看出，筛选对病原菌具有抑制作用的芽孢杆菌是防治有关植物病害的最有效方法之一。技术实现要素：本发明目的在于提供一种用于防治番茄灰霉病的解淀粉芽孢杆菌菌株，该菌株具有高效、杀菌谱广等优点。本发明另一目的在于提供一种微生物菌剂。本发明第三目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。本发明第四目的在于提供上述解淀粉芽孢杆菌在防治番茄灰霉病上的用途。本发明第五目的在于提供上述微生物菌剂在防治番茄灰霉病上的用途。本发明通过以下技术方案实现：本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株HMB27636，己于2016年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNo.13038。利用上述解淀粉芽孢杆菌HMB27636生产的微生物菌剂，其活性成分为解淀粉芽孢杆菌HMB27636菌体。上述微生物菌剂可以为液体制剂。上述微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：(1)菌种活化：将低温保存的HMB27636菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上，在25～35℃培养10～16小时，得活化的菌株；(2)种子液制备：用无菌的接种环刮取一接种环步骤(1)活化的菌株并接种到100mLLB液体培养基中，在25～35℃、摇床转速为150～220rpm条件下培养10～16小时，得种子液；(3)发酵培养：按照体积比为1～3％的比例将步骤(2)的种子液接种到玉米粉黄豆粉培养基(pH值为7.2)中，在25～35℃、摇床转速为150～220rpm的条件下发酵培养40～50h，得发酵液；(4)检测发酵液中菌体和芽胞数量，待发酵液中成熟芽胞占到芽胞和菌体总数的90％时停止发酵培养，所得即为HMB27636菌株的液体制剂。上述制备方法中所述的LB平板培养基、LB斜面培养基或LB液体培养基均按照常规方法制备。上述制备方法步骤(1)中所述LB平板培养基或LB斜面培养基的组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，琼脂粉12～18g，水1000mL。上述制备方法步骤(2)中所述LB液体培养基的组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，水1000mL。上述制备方法步骤(3)中所述的玉米粉黄豆粉培养基，其组成成分及其重量百分比为：玉米粉1.0～3.0％，黄豆粉1.0～3.0％，NaCl0.1～1.0％，MnSO4·H2O0.5～1.0％，其余为水。所述的玉米粉黄豆粉培养基的制备方法，按照重量百分比将玉米粉、黄豆粉、NaCl和MnSO4·H2O混合，再加水，调节pH搅拌均匀即可。上述微生物菌剂，其解淀粉芽孢杆菌HMB27636的活菌数大于21.0×108cfu/mL。上述解淀粉芽孢杆菌HMB27636在防治番茄灰霉病上的应用。上述微生物菌剂在防治番茄灰霉病上的应用。上述微生物菌剂的使用方法：用水将上述所得微生物菌剂稀释至活菌体数为107cfu/mL，于番茄灰霉病发病前进行叶面喷雾即可。本发明HMB27636菌株的筛选分离过程：2013年4月河北省农林科学院植物保护研究所从湖北省荆州市棉田中五点采集土样，混匀后称取1g放到250mL的灭菌三角瓶中，加入100mL无菌水，放到摇床上，170r/min振荡30min，静置2h，取上清液10mL加入50mL灭菌离心管中，在80℃恒温水浴30分钟，然后取1mL加无菌水9mL，即成10mL10-3倍土壤微生物悬液，继而将土壤悬液稀释成10-4、10-5、10-6倍稀释液；取各浓度微生物悬液200μL涂于LB培养基平板上，每个浓度重复3次，在30℃恒温培养1d～3d，进行细菌的分离和纯化。并以番茄灰霉病为靶标，通过平板对峙法、离体叶片法、盆栽试验法进行生防菌的筛选。结果从中筛选出一个对番茄灰霉病具有明显防治效果的菌株，定名为HMB27636。HMB27636菌株的分类鉴定：(1)形态特征鉴定在LB培养基上培养菌体为杆状，培养10h后产生芽胞，芽胞中生，椭圆形，胞囊不膨大，抗酸染色阴性，无伴胞晶体，能运动，鞭毛周生。在营养琼脂平板上，培养初期菌落淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落隆起呈馒头状，表面湿润；培养后期菌落淡黄色，边缘不整齐，表面干燥有褶皱；在营养琼脂斜面上划线培养，呈直线形；在液体培养基中静止培养，表面形成白色菌膜。这些形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著.科学出版社.2001年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断菌株HMB27636属于芽孢杆菌。(2)利用16SrDNA序列鉴定分类以HMB27636的基因组DNA为模板，以F27和R1492为引物对16SrDNA进行PCR扩增，所述的引物序列为：F27：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’(SEQIDNo:1)；R1492：5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQIDNo:2)。PCR的反应体系为50μL:10×PCRBuffer(Mg2+)5μL；dNTPMixture(2.5mM)5μL；Taq(5U/μL)1μL，F27(10μmol/L)1μL，R1492(10μmol/L)1μL；HMB27636的基因组DNA50ng；ddH2O补足至50μL。PCR的反应条件为95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1.5min，30个循环；72℃10min。将所得PCR扩增产物进行凝胶电泳，送交上海生工生物工程有限公司测序，得到HMB27636的16SrDNA序列(见SEQIDNo:3)。将所得HMB27636的16SrDNA序列在Genbank中进行同源性比较，结果菌株HMB27636与芽孢杆菌属的16SrDNA同源性达到99％；构建系统发育树(见图1)，HMB27636与芽孢杆菌属聚合到一起，说明HMB27636属于芽孢杆菌属(Bacillus)。(3)利用gyrB基因序列鉴定分类以HMB27636基因组DNA为模板，以芽孢杆菌gyrB基因简并引物gyrB-F和gyrB-R为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；其中所述的gyrB-F和gyrB-R引物的序列为：gyrB-F：5’-TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT-3’(SEQIDNo:4)；gyrB-R：5’-TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC-3’(SEQIDNo:5)。gyrB的PCR的反应体系为50μL:10×PCRBuffer(Mg2+)5μL；dNTPMixture(2.5mM)5μL；Taq(5U/μL)1μL；gyrB-F(10μmol/L)1μL，gyrB-R(10μmol/L)1μL；HMB27636基因组DNA50ng；ddH2O补足至50μL。PCR的反应条件为95℃5min；95℃30s，55℃45s，72℃1min，30个循环；72℃10min。将扩增产物送交上海生工生物工程有限公司测序，得HMB27636菌株的gyrB基因序列(见SEQIDNo:6)。将HMB27636菌株的gyrB基因序列在Genbank中进行同源性比较，结果发现HMB27636与解淀粉芽孢杆菌的gyrB基因序列同源性最高，达到98.25％；同时利用MEGA软件构建系统发育树(见图2)，HMB27636菌株与解淀粉芽孢杆菌聚合到一起，说明HMB27636为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，并且是一个新菌株。综合以上形态特征、16SrDNA和gyrB基因序列同源性对比分析的结果，可知HMB27636属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，并且和现有的芽孢杆菌菌株不同，是一个新的解淀粉芽孢杆菌菌株。本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明为防治番茄灰霉病提供了一个高效的微生物，开辟了一个有效防治途径；(2)本发明解淀粉芽孢杆菌HMB27636对番茄灰霉病的防治效果好，平均防效在80.0％以上；(3)本发明微生物菌剂对人、畜安全，没有环境污染；(4)利用本发明解淀粉芽孢杆菌HMB27636防治番茄灰霉病专化性强，不易产生抗药性；(5)本发明微生物菌剂制备方法简单、成本低、使用简单。附图说明图1.为根据16SrDNA序列获得的HMB27636菌株系统发育树图。图2.为根据gyrB基因序列获得的HMB27636菌株系统发育树图。具体实施方式下面以具体实施例来进一步清楚地解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量百分含量。实施例1HMB27636微生物菌剂的制备按照如下步骤进行：(1)菌种活化：将保存于-80℃的解淀粉芽孢杆菌菌株HMB27636(己于2016年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13038)在LB平板培养基((其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，琼脂粉15g，水1000mL))上进行活化(30℃)，挑取单菌落在LB斜面培养基((其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，琼脂粉15g，水1000mL))上在30℃下培养12小时，得活化的菌株；(2)种子液的制备：在250mL三角瓶中装入LB液体培养基((其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，水1000mL))100mL，高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶中接入一接种环步骤(1)中活化好的菌株，在30℃、摇床转速190rpm的条件下进行振荡培养12小时，得种子液；(3)玉米粉黄豆粉培养基的制备：按照重量百分比将玉米粉1.5％，黄豆粉2.0％，NaCl0.5％，MnSO4·H2O0.6％加入水中，搅拌混合均匀，即得玉米粉黄豆粉培养基；分装于500mL三角瓶中，每瓶200mL；在121℃对玉米粉黄豆粉培养基进行灭菌30分钟，再降温到30℃备用；(4)发酵培养：向步骤(3)所得每瓶玉米粉黄豆粉培养基200mL中接种步骤(2)所得的种子液2mL；在30℃、摇床转速180rpm条件下进行发酵培养36小时，以后每隔30分钟从三角瓶中取样进行镜检，对视野中的芽胞和总菌体数进行计数，并计算芽胞率(芽胞率(％)＝成熟芽胞数/(成熟芽胞数+菌体数)×100)；芽胞率达到90％时停止发酵培养；共发酵培养48小时，得解淀粉芽孢杆菌HMB27636的液体制剂。实施例2解淀粉芽孢杆菌HMB27636对番茄灰霉菌的拮抗作用试验(一)供试番茄灰霉病菌来源：番茄灰霉病菌BC-1菌株采自河北省保定市容城县东牛东庄村番茄病果，经河北省农林科学院植物保护研究所分离纯化，河北农业大学鉴定为灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)，致病力测定表现为强致病力。(二)试验方法：本试验于2014年4月上旬在河北省农林科学院植物保护研究所植物病害生物防治实验室内进行。首先将番茄灰霉病菌BC-1在PDA平板上活化培养4天，然后用打孔器在菌落边缘区域打孔制成菌片，接着将番茄灰霉病菌BC-1菌片转接在另一个PDA平板中央，再将实施例1步骤(1)活化后的解淀粉芽孢杆菌HMB27636点接在距指示菌菌片2.0厘米处，设空白对照(不点接HMB27636菌株)。在25℃恒温培养，待空白对照即将长满整个培养皿时，测量番茄灰霉菌的对照生长量(菌落半径)和处理生长量(接种HMB27636后的抑制生长半径)，拮抗作用用抑菌率表示。抑菌率的计算公式为：抑菌率(％)＝(对照生长量-处理生长量)/对照生长量×100)。结果(见表1)本发明解淀粉芽孢杆菌HMB27636对番茄灰霉菌的抑制率达68.2％；透明的抑菌带宽2.0毫米，细菌生长达11毫米，空间竞争和营养竞争作用很强；说明解淀粉芽孢杆菌HMB27636对番茄灰霉菌具有明显的抑制作用，具有防治番茄灰霉病的生防潜力。表1HMB27636菌株对番茄灰霉病菌的拮抗作用试验结果实施例3解淀粉芽孢杆菌HMB27636对番茄灰霉病防效对比试验(一)试验处理：(1)微生物菌剂：实施例1制备的HMB27636液体制剂，用水稀释50倍。(2)化学药剂：嘧菌酯悬浮剂(250克/升)(英国先正达有限公司)，用水稀释500倍。(3)空白对照：清水(二)试验方法：本试验在河北省农林科学院植物保护研究所植病生防实验室内进行。在50孔育苗盘中培育奥塞特(968)(购自北京硕源种子公司)的番茄苗，长出2片复叶时移栽到直径20厘米的花盆中，每盆1棵苗。植株生长至7-8片复叶时，选用叶龄一致，大小一致的叶片，先用无菌水冲洗叶表，然后用无菌滤纸吸干水分，再在实施例1制备的解淀粉芽孢杆菌HMB27636菌剂水稀释液(含菌体107cfu/mL)中蘸一下，使叶子表面充分着药，然后放于铺有双层灭菌滤纸的培养皿中，同时接入番茄灰霉病菌BC-1菌盘(直径6mm)，保湿培养。以未用HMB27636菌剂处理的叶片为空白对照。待空白对照充分发病后调查病斑直径，计算防治效果。结果(见表2)在离体叶片生测试验中，解淀粉芽孢杆菌HMB27636对番茄灰霉病具的防效达72.77％，与化学对照药剂的防效(80.38％)差异不显著。说明解淀粉芽孢杆菌HMB27636及其微生物菌剂对番茄灰霉病具有很好的防治效果。表2解淀粉芽孢杆菌HMB27636对番茄灰霉病防效对比试验结果处理病斑直径(mm)防效(％)HMB27636液体制剂7.2b72.77化学药剂5.2b80.38空白对照26.5a--实施例4解淀粉芽孢杆菌HMB27636对番茄灰霉病防效对比试验(一)试验处理：(1)微生物菌剂：实施例1制备的HMB27636液体制剂；用水稀释50倍。(2)化学药剂：嘧菌酯悬浮剂(250克/升)(英国先正达有限公司)；用水稀释500倍。(3)空白对照：清水(二)试验方法：2013年12月在河北省农林科学院植物保护研究所人工气候室内进行。在日光温室培育奥塞特(968)(购自北京硕源种子公司)的番茄苗，待番茄生长出8片复叶，移至控温控湿培养室，选取大小一致的番茄苗，将实施例1制备的HMB27636液体制剂50倍水稀释液均匀喷洒在番茄苗上，在25℃培养24小时，然后在每片小叶上接入番茄灰霉病菌BC-1菌盘(PDA平板上25℃下培养3-5d，直径6mm)，保湿培养3d。设清水空白对照和化学药剂处理。调查发病结果，采用十字测量法测量每个病斑直径(A,B)，计算病斑面积和防治效果。病斑面积(mm2)＝π×A×B/4；防治效果(％)＝(对照病斑面积-处理病斑面积)/对照病斑面积×100。表3解淀粉芽孢杆菌HMB27636对番茄灰霉病防效的对比试验结果处理病斑面积(mm2)防效(％)HMB27636液体制剂18.96c83.19化学药剂30.42b73.02空白对照112.76a--结果(见表3)在活体生测试验中，本发明解淀粉芽孢杆菌HMB27636处理的病斑面积显著小于化学药剂处理和空白对照的病斑面积，对番茄灰霉菌在番茄叶片上的扩展的抑制作用显著；本发明解淀粉芽孢杆菌HMB27636菌剂对番茄灰霉病的防效为83.19％，也明显高于化学药剂73.02％的防效。说明解淀粉芽孢杆菌HMB27636及其微生物菌剂对番茄灰霉病防治效果好。实施例5解淀粉芽孢杆菌HMB27636对番茄灰霉病防效的田间对比试验(一)试验处理：(1)微生物菌剂：实施例1制备的HMB27636液体制剂，用水稀释50倍。(2)化学药剂：嘧菌酯悬浮剂(250克/升)(英国先正达有限公司)；用水稀释500倍。(3)空白对照：清水(二)试验方法：2014年2月至6月在河北省保定市满城县大赛村孙茂龙番茄大棚进行。开始试验时整个棚内番茄叶部灰霉病中度发生，施药前摘除病叶。每小区3行，4次重复，随机区组排列。采用背负式电动喷雾器接种实施例1制备的解淀粉芽孢杆菌HMB27636液体制剂的50倍水稀释液(含菌体107cfu/mL)；另设化学药剂处理和空白对照。首次施药7天后再喷施1次，第二次施药后的第七天调查各个处理小区的单株病叶数，并计算防效。结果(见表4)本发明解淀粉芽孢杆菌HMB27636的菌剂处理后番茄灰霉病的单株病叶数显著低于空白对照和化学药剂处理，其防效达到78.72％，高于化学药剂的防效，说明本发明解淀粉芽孢杆菌菌株HMB27636及其菌剂对番茄灰霉病的防治效果好。表4解淀粉芽孢杆菌HMB27636对番茄灰霉病防效对比试验结果处理单株病叶数(片)防效(％)HMB27636液体制剂1.0c78.72化学药剂1.33b71.52空白对照4.67a--当前第1页1 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