本发明涉及微生物果酒发酵技术领域，具体涉及一种马克斯克鲁维酵母(kluyveyomycesmarxianus)及其在蓝莓果酒中的应用。
背景技术：
蓝莓(blueberry)，学名越橘，属于杜鹃花科(ericaceae)越橘属(vaccinium)植物，果实呈蓝色，圆形，果肉细腻，甜酸适度，具有香爽宜人的香气，鲜食加工皆宜，联合国粮农组织将其列为人类五大健康食品之一，在美国、法国、日本等国被誉为“黄金浆果”、“神奇果”。蓝莓含有花青苷、绿原酸、黄酮素、亚麻油酸、白藜芦醇及不同维生素等生物活性成分，其中富含的酚类、花青苷、维生素c等物质具有很强的清除自由基的作用。研究显示，食用蓝莓有改善视力，提高记忆力，预防肿瘤和心脑血管疾病，延缓衰老等功效。
随着人们生活水平日益提高，对健康的重视日渐增强，蓝莓作为一种极具保健价值的果品，越来越受到人们关注，在其果实产量不断提高的当下，其深加工技术等问题亟待解决。蓝莓果酒是以蓝莓为原料，经过酵母发酵酿制的低度果酒，其风味独特，同时具有较高的营养价值，深受消费者的欢迎。蓝莓果酒的开发可增加蓝莓的附加值，提高蓝莓利用度，促进蓝莓产业的发展。
我国关于蓝莓果酒的开发，已有一些有实用价值的专利文献，如专利cn105907552a公开了以蓝莓鲜果为原料,经清洗和压榨后制成蓝莓原浆,然后将原浆经过发酵前杀菌、调糖、酒精发酵、过滤、发酵后杀菌,制得蓝莓果酒的方法，该发明酿制的蓝莓色泽稳定、口感醇厚、品质好。专利cn104498296a公开了一种将蓝莓果汁用活性干酵母发酵后与蓝莓食用乙醇浸泡液混合调配，酿制蓝莓过久的方法，该发明可以克服蓝莓果不易贮存的缺点，使消费者一年四季都可以摄取到蓝莓果的营养。cn105647760a公开了一种往蓝莓果中添加稻草打浆，再向其中添加苹果汁和葡萄糖，然后接种酵母并发酵酿制蓝莓果酒的方法。该产品营养价值高,适口性好,附加值高,能充分体现蓝莓更高商业价值，且能充分利用原材料、制作成本低、易产业化。
上述研究表明利用蓝莓酿制蓝莓果酒在工艺上是可行的，且制得的产品营养价值较高，适口性好。但是，上述专利所用的发酵菌种都是葡萄酒用酵母，而目前我国还没有专用于蓝莓果酒的商品酵母，蓝莓果酒生产所用菌种几乎都是葡萄酒专用酵母，这就可能会降低酒体口感与香味，造成蓝莓果酒独特香气的缺失，使产品特色风味不突出，在一定程度上阻碍了蓝莓果酒的发展。因此，针对蓝莓果酒的品质特点，大力开发优良品质的果酒酵母是非常必要的。
本发明通过分离纯化筛选出一株马克斯克鲁维酵母，该菌种可作为蓝莓果酒发酵菌种，快速转化糖成酒精，同时产生丰富的香味物质，所酿制的蓝莓果酒果香浓郁、色泽稳定、口感宜人，成本低，易于产业化。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一株马克斯克鲁维酵母，该马克思克鲁维酵母已于2017年1月3日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：马克思克鲁维酵母kluyveyomycesmarxianusy16，保藏编号：cctccno:m2017001，地址：中国武汉武汉大学。
本发明还有一个目的在于提供了一株马克斯克鲁维酵母在蓝莓果酒酿造中的应用，利用本发明提供的马克斯克鲁维酵母酿制的蓝莓果酒果香浓郁，风味纯正，口感宜人。
为了实现上述目的，本发明采取以下技术措施：
马克斯克鲁维酵母的获得：
申请人自蓝莓栽培基地土壤一株性状优良的酵母菌，经形态学和分子生物学分析鉴定该酵母菌为马克斯克鲁维酵母，已于2017年1月3日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：马克斯克鲁维酵母kluyveyomycesmarxianusy16，保藏编号：cctccno:m2017001，地址：中国武汉武汉大学。
该酵母生理生化特征：在pda培养基上繁殖生长形成的菌落为圆形，乳白色，表面光滑，边缘平整；镜检该菌呈球形或椭球型，大小(3.0-4.2)×(3.0-5.0)um，营出芽生殖，形成假菌丝，后期形成子囊孢子；可发酵葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖，不发酵麦芽糖；可同化棉子糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、d-木糖、琥珀酸、甘露醇，不同化核糖、鼠李糖、核糖醇、柠檬酸、可溶性淀粉、阿拉伯糖、海藻糖；不能同化硝酸盐，可以同化盐酸乙胺、盐酸尸胺；不能在无维生素培养基上生长；37℃下生长良好。
马克斯克鲁维酵母在蓝莓果酒酿造中的应用，包括利用该菌株酿造蓝莓果酒，或是利用该菌株提高蓝莓果酒的品质等。
以上所述的应用，优选采用以下方法：
1)酶解和调配：将蓝莓果泥装至发酵罐中，装料量80％(体积比)，并按0.3-0.5g/kg的量添加果胶酶，50℃保温2h，再按40-50mgso2/kg的量添加偏重亚硫酸钾，添加白砂糖使糖度为20-21°，按0.2-0.4g/kg的量添加马克斯克鲁维酵母。
所述的蓝莓果泥通过将新鲜采摘的蓝莓果或者冷藏解冻的蓝莓果挑出生果、烂果、霉果及杂质，快速冲洗沥干，然后用打浆机打浆，使蓝莓果肉破碎并成泥状得到。
所述的马克斯克鲁维酵母的有效活菌数为300-350亿cfu/g，保藏编号为：cctccno:m2017001。
2)发酵：控制主发酵温度为23-25℃，发酵7-8天，待糖度在3-5g/l范围时，用泵将罐中蓝莓酒和蓝莓渣导出并过滤，使皮渣分离，然后将滤液重新导入罐中，并按30-40mgso2/kg的量补加偏重亚硫酸钾，控制后发酵温度16-18℃，时间30-35天。
优选的，糖度为3.6g/l；
3)后处理：后发酵结束后分离酵母泥和蓝莓渣，将澄清的蓝莓果酒转入10-15℃罐陈酿15天，然后除菌，灌装可得成品蓝莓果酒。
与现有蓝莓果酒发酵技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明提供一株马克斯克鲁维酵母，该酵母可用于蓝莓果酒的酿制，酿制的蓝莓果酒酸度适中、酒体协调、口感醇厚、果香浓郁，具有蓝莓果酒独特的风味。
2、利用本发明所述的马克斯克鲁维酵母，相较于利用葡萄酒酵母，明显增强果酒的香味并提高蓝莓果酒的品质，有较好的商业化前景。
附图说明
图1为蓝莓果酒酿造工艺图。
具体实施方式
本发明实施例中实验方法及条件如无特别说明，均为常规方法。所述试剂或材料，如未热别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：马克斯克鲁维酵母的分离及筛选
马铃薯葡萄糖培养基：马铃薯200g；葡萄糖20g；水1000ml。
麦芽汁培养基：大麦糖化液1000ml，糖度6-7°。
ypd培养基：葡萄糖20g；蛋白胨20g；酵母浸粉10g；琼脂18g；水1000ml。
蓝莓汁培养基：蓝莓200g；蔗糖20g；琼脂18g；水1000ml；ph4.5～5.5。
菌株初筛：
从蓝莓栽培基地土壤表层(0～1cm)、土壤下层(2～3cm)、蓝莓叶、蓝莓果及蓝莓树皮上采样，将样品粉碎后取3g加入100mlpda培养基中，30℃培养36h后，依次转接2次，然后将培养后的菌液稀释涂布到ypd平板中，根据菌落形态挑取典型单菌落。
菌株复筛：
将初筛得到的单菌落接种到麦芽汁培养基中，利用杜氏管发酵法选取气泡生成较多且具有典型酒香味的菌株作为复筛菌株，然后接种到蓝莓汁培养基中，发酵结束后通过色泽、酒香和口感作为评价指标，筛选得到一株性状优良的酵母菌。
菌株鉴定：
参照《真菌鉴定手册》对筛选到的菌株进行个体形态观察、生化特性试验、生长特性试验及dna鉴定，确定最终筛选得到的是一株马克斯克鲁维酵母，该酵母生理生化特征：在pda培养基上繁殖生长形成的菌落为圆形，乳白色，表面光滑，边缘平整；镜检该菌呈球形或椭球型，大小(3.0-4.2)×(3.0-5.0)um，营出芽生殖，形成假菌丝，后期形成子囊孢子；可发酵葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖，不发酵麦芽糖；可同化棉子糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、d-木糖、琥珀酸、甘露醇，不同化核糖、鼠李糖、核糖醇、柠檬酸、可溶性淀粉、阿拉伯糖、海藻糖；不能同化硝酸盐，可以同化盐酸乙胺、盐酸尸胺；不能在无维生素培养基上生长；37℃下生长良好；鉴定该菌为马克斯克鲁维酵母
进行分子水平鉴定，将26srdnad1/d2区扩增序列与genebank上报道的马克斯克鲁维酵母26srdnad1/d2区序列进行比对，同源性达到99％，进一步确证该菌为马克斯克鲁维酵母。
该酵母已于2017年1月3日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：马克思克鲁维酵母kluyveyomycesmarxianusy16，保藏编号：cctccno:m2017001，地址：中国武汉武汉大学。
实施例2：
马克斯克鲁维酵母的扩大培养
将马克斯克鲁维酵母单菌落接种到50mlypd液体培养基中，37℃，200rpm培养24h作为一级种子液。
将一级种子液转接2ml到200mlypd液体培养基中，37℃，200rpm培养12h作为二级种子液。
50升发酵罐扩大培养：
初始培养基：100g红糖，50g硫酸铵，10g磷酸二氢钾，10l水，调ph至6.0，115℃灭菌20min，冷却后接种上述二级种子液。
以红糖作为碳源，硫酸铵作为氮源，磷酸二氢钾作为磷源，采用流加的方式补充c、n、p，发酵全程补加糖4.5-5.0kg，补加硫酸铵600-650g，补加磷酸二氢钾100-120g，共流加20l，发酵过程中用碳酸钠调节ph5.0-6.0，维持发酵过程糖含量1-10g/l，发酵全程维持温度37℃和转速500rpm，通风培养，适当调整通气量以维持溶氧≥5％。
48h后发酵结束，血球计数板显微镜下计数，菌浓度为3.2×109cfu/ml，放罐后将发酵液收集，低速离心(5000rpm/min)5min后收集沉淀，少量无菌水重悬洗涤后，再离心收集菌体(即酵母泥)，测算得菌体湿重160g/l，每g酵母泥有效活菌数为85亿cfu，菌体干重40g/l，用于以下实施例。
实施例3：
马克斯克鲁维酵母在蓝莓果酒酿造中的应用：
将无生果、烂果、霉果及杂质的50kg新鲜采摘的蓝莓果，清水快速冲洗并沥干，然后用打浆机将蓝莓果打浆，使蓝莓果肉破碎。
将打浆破碎好的蓝莓果肉和汁水全部转至5个12.5l发酵罐中，装料量约为80％，并按0.4g果胶酶/kg的量往各罐中添加果胶酶4g，保温50℃维持2h，然后按50mgso2/kg的量添加偏重亚硫酸钾1g，添加白砂糖0.82kg使糖度为21°，前4罐分别按0.1g、0.2g、0.4g、1.0g马克斯克鲁维酵母/kg的量添加马克斯克鲁维酵母，所述的马克斯克鲁维酵母的有效活菌数为340亿cfu/g；第5罐添加2g葡萄酒高活性干酵母，该干酵母的有效菌含量为300cfu/g。
控制主发酵温度为25℃，发酵8天，每天测量糖含量，待糖度降至3.6g/l，用4层纱布将蓝莓渣和蓝莓酒过滤，将滤液重新倒入发酵罐中，并按40mgso2/kg量补加偏重亚硫酸钾0.8g，控制后发酵温度18℃，时间30天。
发酵结束后每罐取样检测残糖、总酸、酒精度、色度，同时进行感观评分，另外用gc-ms分析果酒及果汁中主要香气成分。
表1不同酵母及添加量对蓝莓果酒的影响
表2不同酵母及添加量对蓝莓果酒感观风味评分的影响
表3不同酵母及添加量酿造的蓝莓果酒主要香气成分物质分析
注：km代表kluyveyomycesmarxianus，为马克斯克鲁维酵母；dy代表葡萄酒高活性干酵母。
结果显示：
1、马克斯克鲁维酵母的添加量为0.2-0.4g/kg时，相较于0.1g/kg的添加量，总酸含量更低、残糖含量更少、酒精度和色度更高；相较于1.0g/kg的添加量，残糖稍高、酒精度和色度相当，但是总酸含量更低；表明选择0.2-0.4g/kg的添加量发酵蓝莓果酒品质较好。
2、相较于葡萄酒酵母，马克斯克鲁维酵母酿制的蓝莓果酒色度更高、总酸更低、品质更佳。
3、风味评分结果与品质检测结果一致，0.2-0.4g/kg的添加量总分更高，表明此添加量酒风味、色泽等感官评价更高，
4、表3香气成分结果表明，0.2-1.0g/kg的马克斯克鲁维酵母添加量使蓝莓果酒中酯类化合物总量更高、种类更丰富且各种香味物质分布相对更均匀，表明马克斯克鲁维酵母可以增强蓝莓果酒香味，综上所述，本株马克斯克鲁维酵母比商品葡萄酒酵母更适宜蓝莓酒酿制，且添加量为0.2-0.4g/kg蓝莓果汁为宜。
实施例4：
马克斯克鲁维酵母在蓝莓果酒酿造中的应用：
此实施例是实施例3的一次放大实验，不同之处在于，所用蓝莓量为400kg，在2个250l不锈钢发酵罐中放大实验，果胶酶的添加量为0.5g/kg，前后两次发酵按40mgso2/kg的量添加偏重亚硫酸钾，马克斯克鲁维酵母的接种量为0.3g/kg，主发酵温度为24℃，发酵7天后将蓝莓渣和蓝莓酒泵出并用不锈钢筛板过滤，利用蓝莓渣形成的滤层过滤，而后导入罐中加亚硫酸钾后16℃后发酵，后发酵时间35天。后发酵结束后分离酵母泥及残渣，将澄清蓝莓果酒10℃陈酿15天后灌装。取后发酵结束的蓝莓果酒样品检测残糖、总酸、酒精度、色度，同时进行感观评分。
表3250l发酵罐蓝莓果酒品质指标
表4250l发酵罐蓝莓果酒风味评分
表6250l发酵罐蓝莓果酒香气成分物质分析
结果显示250l发酵罐放大后的蓝莓果酒品质与25l发酵罐发酵的蓝莓酒品质相当，各种酯类物质含量与分布相似，风味评分也相近，表明马克斯克鲁维酵母适宜于蓝莓果酒的大规模酿制，该蓝莓果酒酿制工艺成熟可行，可用于大规模生产。