本申请为国际申请号为pct/us2010/057668、国际申请日为2010年11月22日、发明名称为“使用酵母产生角鲨烯的方法和组合物”的pct申请于2012年5月23日进入中国国家阶段后申请号为201080052938.8的中国国家阶段专利申请的分案申请。
相关专利申请
本申请要求2009年11月23日提交的题为“使用酵母产生角鲨烯的方法和组合物”的美国临时专利申请no.61/263,775的权益，所述申请的全部内容鉴于所有目的以引用的方式并入本文。
发明领域
提供使用酵母产生类异戊二烯，如角鲨烯的方法和组合物。
发明背景
以下本发明背景的描述仅供帮助理解本发明，而非承认是描述或构成本发明的现有技术。
类异戊二烯，如角鲨烯，是商业上重要的脂质类型。它们有极好的润滑性、氧化稳定性、低倾点、低冰点、高闪点和生物易降解性。目前，角鲨烯的制备是以高单位成本从橄榄油或冷水鲨鱼肝油中提取。由于高单位成本，角鲨烯和角鲨烷(角鲨烯的全氢化衍生物)在经济上可行的使用处于小规模市场应用，如手表润滑剂、药品/营养品、化妆品、香水和作为高价产品的化学中间体。
不过，可生物降解的润滑剂、润滑剂添加剂和液压油存在重要的潜在市场。对于环境敏感型的应用(如，农业应用)，或在大量的润滑剂或液压油可能泄漏到环境中的情况下，这些产品的生物降解能力尤其重要。可生物降解的润滑剂、润滑剂添加剂和液压油的潜在市场是相当大的，估计每年大约五百万公吨。
从蔬菜和动物脂肪及油中获得的生物可降解润滑剂、润滑剂添加剂和液压油是可用的，但是它们有弊端。它们通常在相对高的温度下凝固(即，它们在寒冷天气凝固)且闪点太低而不能在高温环境下使用(即，在正常的发动机高温环境下，它们分解或燃烧)。
因此，期望有成本效益的角鲨烯制备方法，其允许可生物降解的润滑剂、润滑剂添加剂和液压油里的角鲨烯和角鲨烷的大规模生产和广泛使用。
chang等(appl.microbiol.biotechnol.,2008,78,963-72)公开了所发现的产生“大量角鲨烯和数种多不饱和脂肪酸”的野生型酵母pseudozymasp.jcc207。chang等描述了从美国关岛附近收集的海水中分离pseudozymasp.jcc207，且不确定pseudozymasp.jcc207是新物种还是p.regulosa或p.aphidis的变种。该文章中，“在不同条件下研究了角鲨烯[由pseudozymasp.jcc207]的产生效率。
dowagrosciencesllc,usingyeastfermentationtoproducecost-effectiveandbiodegradablelubricants,http://statusreports.atp.nist.gov/reports/95-01-0148pdf.pdf，公开了“公司打算使用基因工程改变产油(油性)酵母的代谢特性来增强酵母通过生物合成产生异戊二烯的能力”。具体地，目标是四种酶：乙酰辅酶a羧化酶(accase)、羟甲基戊二酸单酰辅酶a还原酶(hmgr)、角鲨烯合酶和角鲨烯环氧酶。
美国专利no.5,460,949公开了“增加酵母中角鲨烯和特定固醇积聚量的方法”。具体来说，公开了“通过提高编码具有hmg辅酶a还原酶活性多肽的基因的表达水平来增加角鲨烯和固醇的积聚量”。
发明概述
本发明提供用于从酵母中产生角鲨烯的组合物和方法。
在某些方面和实施方案中，由基因转换或非基因转换酵母产生的增加量的类异戊二烯(例如，角鲨烯)可能是突变、修饰及/或改变类异戊二烯生物合成途径中一种或多种酶的活性的结果。例如，乙酰辅酶a羧化酶(或“accase”)、hmg辅酶a还原酶、角鲨烯环氧酶、角鲨烯合酶、atp柠檬酸合酶、甲羟戊酸激酶(例如，解脂耶氏酵母(y.lipolytica)甲羟戊酸激酶(genolevuresyali0b16038g))、甘油激酶(例如，解脂耶氏酵母甘油激酶(genolevuresyali0f00484g))和/或5-氨基乙酰丙酸合酶(例如，由酿酒酵母hem1基因编码)可能被修饰、突变或已改变活性。
在一些优选的实施方案中，表达修饰酶的基因转换酵母的制备是通过使用本文描述的基因修复寡核碱基引进酶的突变。在一些实施方案中，提供的方法包括通过本领域熟知的众多方法中的任一种方法(例如，电穿孔、lioac、基因枪法(biolistics)、酵母细胞去壁(spheroplasting)和/或土壤杆菌属(例如参见，mcclelland,cm.,chang,y.c和kwon-chung,k.j.(2005)fungalgeneticsandbiology42:904-913)将含有针对相关靶基因的特定突变的基因修复寡核碱基引入酵母细胞中，和鉴别含有突变酶的细胞。
在本发明一个方面，提供从本文公开的基因转换或非基因转换酵母中提取的类异戊二烯。在相关的方面，提供从本文描述的基因转换酵母中提取的角鲨烯。
在另一个方面，提供制备类异戊二烯，优选地角鲨烯的方法。在某些实施方案中，方法包括提供本文描述的基因转换或非基因转换酵母以及从酵母中提取角鲨烯。在一些实施方案中，方法包括将酵母(基因转换的或非基因转换的)暴露于抗真菌剂(例如，烯丙胺抗真菌剂，如特比萘芬(terbinafme))及从酵母中提取角鲨烯。在一些实施方案中，方法包括将如本文描述的基因转换酵母暴露于抗真菌剂(例如，烯丙胺抗真菌剂，如特比萘芬)及从酵母中提取角鲨烯。在一些实施方案中，方法包括将如本文描述的非基因转换酵母暴露于抗真菌剂(例如，烯丙胺抗真菌剂，如特比萘芬)及从酵母中提取角鲨烯。
在包括抗真菌剂(例如，烯丙胺抗真菌剂，如的本文公开方法和组合物的某些实施方案中，抗真菌剂(如特比萘芬或其它抗真菌剂)可能被添加或存在的浓度为或高于约1μg/ml、或约5μg/ml、或约10μg/ml、或约11μg/ml、或约12μg/ml、或约12.5μg/ml、或约13μg/ml、或约15μg/ml、或约16μg/ml、或约20μg/ml、或约25μg/ml、或约30μg/ml、或约40μg/ml、或约50μg/ml或更大。在包括抗真菌剂(例如，烯丙胺抗真菌剂，如特比萘芬)的本文公开方法和组合物的某些实施方案中，抗真菌剂(如特比萘芬或其它抗真菌剂)可能被添加或存在的浓度在约0.5至100μg/ml之间、或0.5至50μg/ml之间、或1至50μg/ml之间、或5至50μg/ml之间、或8至50μg/ml之间、或10至50μg/ml之间、或12至50μg/ml之间、或15至50μg/ml之间、或15至50μg/ml之间、或25至50μg/ml之间、或1至25μg/ml之间、或5至25μg/ml之间、或10至25μg/ml之间、或10至20μg/ml之间、或10至15μg/ml之间。
在一个方面，提供产生类异戊二烯的基因转换酵母。在某些实施方案中，基因转换酵母产生角鲨烯。
在另一个方面，提供基因转换酵母，其中酵母的基因转换使其比起相应的天然酵母产生水平增加的角鲨烯。在本发明上述方面的某些实施方案中，基因转换酵母表达具有一种或多种突变的一种或多种修饰酶。在上述方面的某些实施方案中，基因转换酵母中的一种或多种酶的表达水平相对于相应的天然酵母有所增加或减少。在相关实施方案中，基因转换酵母表达具有一种或多种突变的一种或多种修饰酶并且基因转换酵母中的一种或多种酶的表达水平相对于相应的天然酵母有所增加或减少。在某些优选的实施方案中，本文提供的基因转换酵母的基因转换是通过使用基因修复寡核碱基将突变引入酶。在一些实施方案中，本文提供的基因转换酵母的基因转换是通过将一种或多种突变引入到编码酶的基因的翻译起始位点处或其周围来提高或降低酶的表达，如在美国专利申请nos.10/411,969和11/625,586中描述的。在某些实施方案中，如本文提供的基因转换酵母中被修饰的酶包括一种或多种选自由以下组成的组的酶：乙酰辅酶a羧化酶(或"accase")、hmg辅酶a还原酶、角鲨烯环氧酶、角鲨烯合酶、atp柠檬酸裂解酶、atp柠檬酸合酶、甲羟戊酸激酶(如，解脂耶氏酵母甲羟戊酸激酶(genolevuresyali0b16038g))、甘油激酶(如，解脂耶氏酵母甘油激酶(genolevuresyali0f00484g))和5-氨基乙酰丙酸合酶。
核碱基(nucleobase)包含碱基，其是嘌呤、嘧啶或其衍生物或类似物。核苷是含有戊呋喃糖基部分的核碱基，如，任选取代的核糖核苷或2'-脱氧核糖核苷。核苷可通过一些连接部分中的一种连接，该连接部分可能含磷或不含磷。通过未取代的磷酸二酯键连接的核苷叫做核苷酸。本文使用的“核碱基”包括肽核碱基、肽核酸的亚单位和吗啉核碱基以及核苷和核苷酸。
寡核碱基是核碱基的聚合体，该聚合体可通过沃森-克里克(watson-crick)碱基配对与具有互补序列的dna杂交。寡核碱基链有单个5'和3'端，其是聚合体的最终核碱基。特殊的寡核碱基链可含有所有类型的核碱基。寡核碱基化合物是含有一个或多个互补的且通过沃森-克里克碱基配对杂交的寡核碱基链的化合物。核碱基是脱氧核糖型或核糖型。核糖型核碱基是含有戊呋喃糖基的核碱基，其中2'碳位是被羟基、烷氧基或卤素取代的亚甲基。脱氧核糖型核碱基是不同于核糖型核碱基的核碱基且包括所有不含有戊呋喃糖基部分的核碱基。
一个寡核碱基股一般包括多个寡核碱基链和多个寡核碱基链的片段或区域。一个寡核碱基股有一个3'末端和一个5'末端。当一个寡核碱基股与一条链同延时，该股的3'和5'末端同样也是该链的3'和5'端。
术语“基因修复寡核碱基”在本文用以表示多种寡核碱基，包括混合双链寡核苷酸、含非核苷酸的分子、单股寡脱氧核苷酸及下文详述的其它基因修复分子。
在一些实施方案中，本文提供的基因转换酵母或非基因转换酵母源自产油酵母。在某些优选的实施方案中，本文提供的基因转换酵母或非基因转换酵母所来源的酵母选自由以下组成的组：弯曲隐球酵母(cryptococcuscurvatus)、解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)、粘红酵母(rhodotorulaglutinus)和红冬孢酵母(rhorosporidiumtoruloides)。在一些优选的实施方案中，基因转换酵母或非基因转换酵母所来源的酵母选自由以下组成的组：弯曲隐球酵母、解脂耶氏酵母和粘红酵母。在相关的实施方案中，基因转换酵母或非基因转换酵母所来源的酵母选自由以下组成的组：弯曲隐球酵母和粘红酵母。在某些优选的实施方案中，基因转换酵母或非基因转换酵母不是源自解脂耶氏酵母。在某些实施方案中，基因转换酵母或非基因转换酵母是解脂耶氏酵母菌株，选自由以下组成的组：atcc20688、atcc90811、atcc90904、atcc90812、atccmya-2613和yeasternpolg。
在某些优选的实施方案中，如本文提供的基因转换酵母中被修饰的酶是乙酰辅酶a羧化酶(或“accase”)。在一些优选的实施方案中，基因转换酵母中的乙酰辅酶a羧化酶被修饰使其活性和/或表达相对于相应的天然酵母有所降低；或使其活性和/或表达被消除。在其它实施方案中，乙酰辅酶a羧化酶可能被修饰使其底物选择性发生改变。在一些优选的实施方案中，基因转换酵母被修饰使乙酰辅酶a羧化酶的活性和/或表达相对于相应的天然酵母有所降低，但其活性没有消除。在一些优选的实施方案中，基因转换酵母被修饰使基因转换酵母中乙酰辅酶a羧化酶的活性和/或表达降低到相应天然酵母活性和/或表达的约90％、或约80％、或约70％、或约60％、或约50％、或约40％、或约30％、或约20％、或约10％、或约5％。在相关的实施方案中，基因转换酵母被修饰使基因转换酵母中乙酰辅酶a羧化酶的活性和/或表达在相应天然酵母活性和/或表达的约90-95％之间、或约80-90％之间、或约70-80％之间、或约60-70％之间、或约50-60％之间、或约40-50％之间、或约30-40％之间、或约20-30％之间、或约10-20％之间、或约5-10％之间、或约2-5％之间。
在某些优选的实施方案中，如本文提供的基因转换酵母中被修饰的酶是hmg辅酶a还原酶。在一些优选的实施方案中，基因转换酵母中的hmg辅酶a还原酶被修饰使其活性和/或表达相对于相应的天然酵母有所增加。在其它实施方案中，hmg辅酶a还原酶可能被修饰使其底物选择性发生改变。在某些优选的实施方案中，基因转换酵母被修饰使基因转换酵母中hmg辅酶a还原酶的活性和/或表达增加到相应天然酵母活性和/或表达的至少1.2倍、或1.5倍、或2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或10倍、或15倍、或20倍、或50倍、或100倍、或1,000倍、或10,000倍、或100,000倍、或1,000,000倍。
在某些优选的实施方案中，如本文提供的基因转换酵母中被修饰的酶是角鲨烯环氧酶。在一些优选的实施方案中，基因转换酵母中的角鲨烯环氧酶被修饰使其活性和/或表达相对于相应的天然酵母有所降低；或使其活性和/或表达被消除。在其它实施方案中，角鲨烯环氧酶可能被修饰使其底物选择性发生改变。在一些优选的实施方案中，基因转换酵母被修饰使角鲨烯环氧酶的活性和/或表达相对于相应的天然酵母有所降低，但是其活性没有消除。在某些实施方案中，角鲨烯环氧酶被修饰而包括与特比萘芬敏感性增强相关的一种或多种突变或一种或多种突变的同源物。在某些实施方案中，酵母不是酿酒酵母，且角鲨烯环氧酶被修饰而包括酿酒酵母erg1基因中与特比萘芬敏感性增强相关的以下突变中的一个或多个突变的同源物：g30s、l37p和r269g(例如参见，turnowsky,2005,2007和2008)。在某些实施方案中，酵母是解脂耶氏酵母，且角鲨烯环氧酶被修饰而包括酿酒酵母erg1基因中与特比萘芬敏感性增强相关的以下突变中的一个或多个突变的同源物：g30s、l37p和r269g(例如参见turnowsky,2005,2007和2008)。在一些实施方案中，酵母角鲨烯环氧酶基因如本文描述，通过野生型基因的合成和置换或通过rtds引入突变被修饰。在一些优选的实施方案中，基因转换酵母被修饰使基因转换酵母中角鲨烯环氧酶的活性和/或表达降低到相应天然酵母活性和/或表达的约90％、或约80％、或约70％、或约60％、或约50％、或约40％、或约30％、或约20％、或约10％、或约5％。在相关的实施方案中，基因转换酵母被修饰使基因转换酵母中角鲨烯环氧酶的活性和/或表达在相应天然酵母活性和/或表达的约90-95％之间、或约80-90％之间、或约70-80％之间、或约60-70％之间、或约50-60％之间、或约40-50％之间、或约30-40％之间、或约20-30％之间、或约10-20％之间、或约5-10％之间或约2-5％之间。
在某些优选的实施方案中，如本文提供的基因转换酵母中被修饰的酶是角鲨烯合酶。在一些优选的实施方案中，基因转换酵母中的角鲨烯合酶被修饰使其活性和/或表达相对于相应天然酵母有所增加。在其它实施方案中，角鲨烯合酶可能被修饰使其底物选择性发生改变。在某些优选的实施方案中，基因转换酵母被修饰使基因转换酵母中角鲨烯合酶的活性和/或表达增加到相应天然酵母活性和/或表达的至少1.2倍、或1.5倍、或2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或10倍、或15倍、或20倍、或50倍、或100倍、或1,000倍、或10,000倍、或100,000倍、或1,000,000倍。
在某些优选的实施方案中，如本文提供的基因转换酵母中被修饰的酶是atp柠檬酸裂解酶。在一些实施方案中，atp柠檬酸裂解酶基因的任一或两个亚单位(如，解脂耶氏酵母atp柠檬酸裂解酶；genoleveresyali0d24431g和yali0e34793g)如本文描述被修饰。在某些实施方案中，通过包含单一亚单位全酶(holoenzyme)的动物atp裂解酶基因的插入和/或异源性表达，使修饰酵母中atp柠檬酸裂解酶的活性增加。在一些优选的实施方案中，基因转换酵母中的atp柠檬酸裂解酶被修饰使其活性和/或表达相对于相应的天然酵母有所增加。在某些优选的实施方案中，基因转换酵母被修饰使基因转换酵母中atp柠檬酸裂解酶的活性和/或表达增加到相应天然酵母活性和/或表达的至少1.2倍、或1.5倍、或2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或10倍、或10倍、或20倍、或50倍、或100倍、或1,000倍、或10,000倍、或100,000倍、或1,000,000倍。
在本文提供的组合物和方法的某些实施方案中，在基因转换酵母或非基因转换酵母中被修饰的酶是atp柠檬酸合酶。优选地，其活性和/或表达相对于相应天然酵母有所增加。
在某些优选的实施方案中，如本文提供的基因转换酵母中被修饰的酶是甲羟戊酸激酶(如，解脂耶氏酵母甲羟戊酸激酶(genolevuresyali0b16038g))。在一些优选的实施方案中，基因转换酵母中的甲羟戊酸激酶(如，解脂耶氏酵母甲羟戊酸激酶(genolevuresyali0b16038g))被修饰使其活性和/或表达相对于相应的天然酵母有所增加。在某些优选的实施方案中，基因转换酵母被修饰使基因转换酵母中甲羟戊酸激酶(如，解脂耶氏酵母甲羟戊酸激酶(genolevuresyali0b16038g))的活性和/或表达增加到相应天然酵母活性和/或表达的至少1.2倍、或1.5倍、或2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或10倍、或10倍、或20倍、或50倍、或100倍、或1,000倍、或10,000倍、或100,000倍、或1,000,000倍。
在某些优选的实施方案中，如本文提供的基因转换酵母中被修饰的酶是甘油激酶(如，解脂耶氏酵母甘油激酶(genolevuresyali0f00484g))。在一些优选的实施方案中，基因转换酵母中的甘油激酶(如，解脂耶氏酵母甘油激酶(genolevuresyali0f00484g))被修饰使其活性和/或表达相对于相应天然酵母有所增加。在某些优选的实施方案中，基因转换酵母被修饰使基因转换酵母中甲羟戊酸激酶甘油激酶(如，解脂耶氏酵母甘油激酶(genolevuresyali0f00484g))的活性和/或表达增加到相应天然酵母活性和/或表达的至少1.2倍、或1.5倍、或2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或10倍、或10倍、或20倍、或50倍、或100倍、或1,000倍、或10,000倍、或100,000倍、或1,000,000倍。
在本文提供的组合物和方法的某些实施方案中，基因转换酵母或非基因转换酵母中被修饰的酶是5-氨基乙酰丙酸合酶(如，由酿酒酵母hem1基因编码)。优选地，其活性和/或表达相对于相应天然酵母有所增加。
在上述方面的某些优选的实施方案中，基因转换酵母是基因转换酵母；在其它优选的实施方案中，基因转换酵母是转基因酵母。进一步的实施方案是包括转基因和基因改变二者的酵母。
在某些方面和实施方案中，提供包括酵母(如，本文公开的基因转换酵母，或非基因转换酵母)的组合物，其中总脂质含量中至少10％是角鲨烯；或总脂质含量中至少20％是角鲨烯；或总脂质含量中至少25％是角鲨烯；或总脂质含量中至少28％是角鲨烯；或总脂质含量中至少30％是角鲨烯；或总脂质含量中至少32％是角鲨烯；或总脂质含量中至少35％是角鲨烯；或总脂质含量中至少37％是角鲨烯；或总脂质含量中至少38％是角鲨烯；或总脂质含量中至少40％是角鲨烯；或总脂质含量中至少42％是角鲨烯；或总脂质含量中至少45％是角鲨烯；或总脂质含量中至少47％是角鲨烯；或总脂质含量中至少50％是角鲨烯；或总脂质含量中至少52％是角鲨烯；或总脂质含量中至少55％是角鲨烯；或总脂质含量中至少57％是角鲨烯；或总脂质含量中至少60％或更多是角鲨烯。
在本文公开的各个方面的进一步实施方案中，提供从上文或下文描述的基因转换、转基因的基因转换、或非基因转换酵母中的任一者中提取的类异戊二烯，如角鲨烯。
本文使用的短语“基因转换酵母”或“基因改变酵母”是指含有一个或多个基因修饰(如转基因)的酵母和/或含有一个或多个设计突变的修饰酶。这些设计突变可能导致与天然酶活性不同的修饰酶。这些不同可包括底物选择性不同或活性水平不同。如本文中使用的“转基因酵母”是“基因转换酵母”的一种类型。
本文使用的术语“天然酵母”是指没有经基因转换(即，转基因的或基因改变的)的酵母。天然酵母包括野生型酵母和经选择性地育种以获得特殊特性的酵母。
短语“转基因酵母”是指具有另一酵母物种或非酵母物种的基因的酵母。这样的基因可被称为“转基因”。
本文使用的术语“靶基因”是指编码待修饰酶的基因。
短语“产油酵母”是指含有至少约20％可从生物体中提取的细胞干重(cdw)脂质的酵母。积聚至少约20％细胞干重脂质水平的能力不限于特别的属；已报道以下菌属中有大于约20％的细胞干重脂质：产油油脂酵母(lipomyceslipofer)、斯达氏油脂酵母(l.starkeyi)、子囊菌油脂酵母(l.tetrasporus)、解脂假丝酵母(candidalipolytica)、迪丹斯假丝酵母(c.diddensiae)、副解脂假丝酵母(c.paralipolytica)、弯假丝酵母(c.curvata)、浅白隐球酵母(cryptococcusalbidus)、罗伦隐球酵母(cryptococcuslaurentii)、白地霉(geotrichumcandidum)、牧草红酵母(rhodotorulagraminus)、丛生丝孢酵母(trichosporonpullulans)、红冬孢酵母、粘红酵母、瘦弱红酵母(rhodotorulagracilis)和解脂耶氏酵母。例如参见，tatsumi等，美国专利no.4,032,405,和rattray,microbiallipids,第一卷(1998)。
本文使用的术语“约”意指数量上正或负10％。如，“约3％”包含2.7-3.3％，以及“约10％”包含9-11％。
除非另外指出，否则本文指定的任何百分数都是重量百分比。
本发明的其它特点和优点从以下优选实施方案的描述和权利要求书中显而易见。
发明详述
酵母类型
本文公开的组合物和方法可以基于许多酵母物种或菌株中的任一物种或菌株。在某些实施方案中，酵母是产油酵母。例如，酵母可能是弯曲隐球酵母(如，atcc20508)、解脂耶氏酵母(如，atcc20688或atcc90811)、粘红酵母(如，atcc10788或atcc204091)和红冬孢酵母。发明者发现，相对于某些其它酵母(如解脂耶氏酵母)，弯曲隐球酵母和粘红酵母在各种各样的底物上生长至非常高的细胞密度，并在许多培养条件下产生大量的总脂质。因此，在某些实施方案中，弯曲隐球酵母和粘红酵母可能对本文公开的组合物和方法尤其有利。有许多发展完善并特异于解脂耶氏酵母的遗传工具(如，转化方案、选择性标记)；因而在一些实施方案中，解脂耶氏酵母可能对本文公开的组合物和方法尤其有利。在本文公开的组合物和方法的某些实施方案中，酵母(基因转换的或非基因转换的)可能是解脂耶氏酵母菌株，如atcc20688、atcc90811、atcc90904、atcc90812、atccmya-2613或yeasternpolg。
基因修复寡核碱基
本发明可以和具有如下详述构象和化学的“基因修复寡核碱基”一起实行。本发明的“基因修复寡核碱基”包括混合双链寡核苷酸、含有非核苷酸的分子、单股寡脱氧核苷酸以及其它描述在以下所述的专利和专利公布中的基因修复分子。本发明的“基因修复寡核碱基”还以其它名称描述在发表的科学和专利文献中，所述名称包括“重组诱发性(recombinagenic)寡核碱基”、“rna/dna嵌合寡核苷酸”、“嵌合寡核苷酸”、“混合双链寡核苷酸(mdons)”、“rnadna寡核苷酸(rdos)”、“基因靶向寡核苷酸”、“genoplasts”、“单股修饰寡核苷酸”、“单股寡脱氧核苷酸突变载体”、“双链突变载体”和“异源双链突变载体”。
具有如kmiec的美国专利no.5,565,350(kmieci)和kmiec的美国专利no.5,731,181(kmiecii)(以引用的方式并入本文)中所述构象和化学的寡核碱基，适于用作本发明的“基因修复寡核碱基”。kmieci和/或kmiecii中的所述基因修复寡核碱基含有两条互补链，其中一条含有至少一个rna型核苷酸片段(“rna片段”)与另一条链上的dna型核苷酸进行碱基配对。
kmiecii公开了含嘌呤和嘧啶碱基的非核苷酸可取代核苷酸。另外的可用于本发明的基因修复分子描述于美国专利nos.5,756,325、5,871,984、5,760,012、5,888,983、5,795,972、5,780,296、5,945,339、6,004,804、和6,010,907以及国际专利no.pct/usoo/23457、和国际专利公布nos.wo98/49350、wo99/07865、wo99/58723、wo99/58702、和wo99/40789，其全部内容均以引用的方式并入本文。
在一个实施方案中，基因修复寡核碱基是混合双链寡核苷酸，其中混合双链寡核苷酸的rna型核苷酸通过用氟、氯或溴官能团置换2'-羟基或通过在2'-o上安置取代基而成为核糖核酸酶(rnase)抗性。合适的取代基包括kmiecii中示教的取代基。可选的取代基包括美国专利no.5,334,711(sproat)示教的取代基和专利公布ep629387和ep679657(总称martin申请案)示教的取代基，所述参考案以引用的方式并入本文。如本文所用，核糖核苷酸的2'-氟、2'-氯或2'-溴衍生物或者其2'-oh被martin申请案或sproat中所述的取代基取代的核糖核苷酸称之为“2'-取代核糖核苷酸”。本文所用的术语“rna型核苷酸”意指通过未取代的磷酸二酯键或由kmieci或kmiecii示教的任何非天然键与混合双链寡核苷酸的其它核苷酸连接的2'-羟基或2'-取代核苷酸。本文所用的术语“脱氧核糖型核苷酸”意指具有2'-h的核苷酸，其可通过未取代的磷酸二酯键或由kmieci或kmiecii示教的任何非天然键与基因修复寡核碱基的其它核苷酸连接。
在本发明的一个具体实施方案中，基因修复寡核碱基是单独通过未取代的磷酸二酯键连接的混合双链寡核苷酸。在另一些实施方案中，通过kmiecii中示教的取代的磷酸二酯、磷酸二酯衍生物和无磷基键进行连接。在又一个实施方案中，混合双链寡核苷酸中的每个rna型核苷酸是2'-取代核苷酸。2'-取代核糖核苷酸的具体优选实施方案是2'-氟、2'-甲氧基、2'-丙氧基、2'-烯丙氧基、2'-羟乙氧基、2'-甲氧基乙氧基、2'-氟丙氧基和2'-三氟丙氧基取代的核糖核苷酸。2'-取代核糖核苷酸的更优选实施方案是2'-氟、2'-甲氧基、2'-甲氧基乙氧基和2'-烯丙氧基取代的核苷酸。在另一个实施方案中，混合双链寡核苷酸通过未取代的磷酸二酯键连接。
虽然只具有单一类型的2'-取代rna型核苷酸的混合双链寡核苷酸更方便合成，本发明的方法仍可和具有两种或更多种类型的rna型核苷酸的混合双链寡核苷酸一起实行。脱氧核苷酸引入两个rna型三核苷酸之间引起的断裂，可能不会影响rna片段的功能，因此，术语rna片段涵盖如“断裂rna片段”。未断裂的rna片段叫做连续rna片段。在一个可选的实施方案中，rna片段可含有交替的抗核糖核酸酶核苷酸和未取代的2'-oh核苷酸。混合双链寡核苷酸优选地具有少于100个核苷酸和更优选地少于85个核苷酸、但多于50个核苷酸。第一条链和第二条链进行沃森-克里克碱基配对。在一个实施方案中，混合双链寡核苷酸的链通过连接体如单链六、五或四核苷酸共价键结，以使第一条链和第二条链成为具有单个3'末端和单个5'末端的寡核苷酸单链的片段。添加“发夹帽”可保护3'末端和5'末端，借此3'端和5'端核苷酸与邻近的核苷酸进行沃森-克里克配对。另外，可在远离3'末端和5'末端的第一条链和第二条链之间的接合处安置第二发夹帽，从而使第一条链和第二条链之间的沃森-克里克配对稳定。
第一条链和第二条链含有两个区域与靶基因的两个片段同源，即，具有和靶基因相同的序列。一同源区含有rna片段的核苷酸，并可能含有连接dna片段的一种或多种dna型核苷酸，还可能含有不在间插dna片段内的dna型核苷酸。同源的两个区域被一个区域分开且各自和此区域相邻，该区域具有和靶基因不同的序列，称为“异源区”。异源区可含有一个、两个或三个错配的核苷酸。错配的核苷酸可以是连续的或被与靶基因同源的一个或两个核苷酸分开。或者，异源区还可含有插入或一个、两个、三个或五个或更少的核苷酸。或者，混合双链寡核苷酸的序列可能与靶基因序列不同，差别在于从混合双链寡核苷酸中缺失一个、两个、三个或五个或更少的核苷酸。在这种情况下，异源区的长度和位置视为缺失的长度，即使没有混合双链寡核苷酸的核苷酸在异源区内。当意图一个取代或多个取代时，和两个同源区互补的靶基因片段之间的距离同样是异源区的长度。当异源区含有插入时，同源区在混合双链寡核苷酸中分开的距离因而比其互补同源片段在基因中分开的距离要远，而当异源区编码缺失时情况相反。
混合双链寡核苷酸的rna片段各自是同源区的一部分，即，序列和靶基因的片段相同的区域，所述rna片段一起优选含有至少13个rna型核苷酸和优选16至25个rna型核苷酸或更优选18-22个rna型核苷酸或最优选20个核苷酸。在一个实施方案中，同源区的rna片段被间插dna片段分开且与其相邻，即，由间插dna片段相连。在一个实施方案中，异源区的每个核苷酸是间插dna片段的核苷酸。含有混合双链寡核苷酸的异源区的间插dna片段叫做“突变片段(mutatorsegment)”。
在本发明的另一个实施方案中，基因修复寡核碱基是单链寡脱氧核苷酸突变载体(ssomv)，其公开于国际专利申请pct/usoo/23457、美国专利nos.6,271,360、6,479,292和7,060,500，所述案的全文以引用的方式并入本文。ssomv的序列与美国专利nos.5,756,325、5,871,984、5,760,012、5,888,983、5,795,972、5,780,296、5,945,339、6,004,804和6,010,907和国际公布nos.wo98/49350、wo99/07865、wo99/58723、wo99/58702和wo99/40789中描述的突变载体基于相同的原理。ssomv的序列含有两个区域与靶序列同源，被一区域分开，该区域含有所需的基因改变，叫做突变区。该突变区的序列长度可与靶序列中分开同源区的序列相同，但是序列不同。这样的突变区可引起取代。或者，ssomv中的同源区可彼此邻接，而具有相同序列的靶基因的区域被一个、两个或更多个核苷酸分开。这样的ssomv引起不在ssomv上的核苷酸从靶基因缺失。最后，与同源区相同的靶基因的序列可能在靶基因中相邻，但被ssomv序列中的一个、两个或更多个核苷酸分开。这样的ssomv引起靶基因序列发生插入。
ssomv的核苷酸是通过未修饰的磷酸二酯键连接的脱氧核糖核苷酸，只是3'端和/或5'端核苷酸间键合或者两个3'端和/或5'端核苷酸间键合可以是硫代磷酸酯或氨基磷酸酯。本文所用的核苷酸间键合是ssomv的核苷酸之间的键，不包括3'末端核苷酸或5'末端核苷酸与封闭取代基之间的键，参见上文。在一个具体的实施方案中，ssomv的长度在21和55个脱氧核苷酸之间，相应地，同源区的长度有至少20个脱氧核苷酸的总长度且至少两个同源区应各具有至少8个脱氧核苷酸的长度。
ssomv可设计为与靶基因的编码链或非编码链互补。当所需的突变是单碱基取代时，优选突变核苷酸是嘧啶。为了实现所需的功能结果，优选突变核苷酸和互补链中的靶核苷酸都是嘧啶。特别优选是ssomv编码颠换突变，即，c或t突变核苷酸分别与互补链中的c或t核苷酸错配。
除了寡脱氧核苷酸，ssomv还可含有5'封闭取代基，其通过连接体附着在5'端碳上。连接体的化学结构并不重要，除了它的长度，长度优选应为至少6个原子长，且连接体应当灵活。可以使用多种无毒取代基，如生物素、胆固醇或其它类固醇或非嵌入的阳离子荧光染料。特别优选的制造ssomv的试剂是维吉尼亚州sterling市的glenresearch公司销售的cy3tm和cy5tm试剂，所述试剂是封闭的氨基亚磷酸酯，其并入寡核苷酸后分别产生3,3,3',3'-四甲基ν,ν'-异丙基取代的吲哚单碳菁染料和吲哚二碳菁染料。cy3是最优选的。当吲哚碳菁是n-氧烷基取代的时，其可通过具有5'端磷酸酯的磷酸二酯，方便地与寡脱氧核苷酸的5'端连接。染料与寡脱氧核苷酸之间的染料连接体的化学结构并不重要，其选择是为了合成方便。当直接使用可商购的cy3氨基亚磷酸酯时，所得的5'修饰包括封闭取代基和连接体，所述封闭取代基和连接体一起是n-羟丙基、n'-磷脂酰丙基3,3,3',3'-四甲基吲哚单碳菁。
在一个优选实施方案中，吲哚碳菁染料在吲哚环的3和3'位置被四次取代。不受理论的限制，这些取代防止染料变成嵌入染料。取代基的身份和这些位置不重要。ssomv还可具有3'封闭取代基。同样，3'封闭取代基的化学结构不重要。
异源表达
在某些实施方案中，异源表达用来表述酵母(例如，解脂耶氏酵母)中的外来基因或内源基因的额外拷贝。酵母中的异源表达可通过本领域熟知的方法进行。使用异源表达的酵母中外来基因或内源基因的额外拷贝的表达可能涉及对载体的使用，该载体包括(a)用于转录起始的启动子序列、(b)用于转录终止的终止子序列，及(c)选择性标记。例如，异源表达和表达载体可能描述于madzak,c,gaillardin,c.和beckerich,j-m.,2004heterologousproteinexpressionandsecretioninthenon-conventionalyeastyarrowialipolytica:areview,journalofbiotechnology109:63-81。在本文的组合物和方法的某些实施方案中，载体是pylexl(yeastern)。可能使用的选择性标记基因的非限制性清单包括ura3、lys5、trpl、leu2、adel、编码潮霉素抗性的大肠杆菌hph和来自酿酒酵母的suc2。可能使用的启动子的非限制性清单包括pleu2、pxpr2、ppox2、ppotl、picll、pg3p、pmtp、ptef和prps7。在某些实施方案中，启动子是hp4d启动子，其是强大的组成型杂合启动子(2000年7月4日授权的美国专利6,083,717)。可能使用的终止子序列的非限制性清单包括xpr2t、lip2t和pho5t。
在某些实施方案中，将解脂耶氏酵母lys1(genolevuresyali0b15444g)、trp1(genolevuresyali0b07667g)和ade1(genolevuresyali0e33033g)基因中的一个或多个基因用作选择性标记。在某些实施方案中，将解脂耶氏酵母ura3(genbank:u40564.1)或leu2(genoluveresyali0c00407)基因中的一个或多个基因用作选择性标记。
在某些实施方案中，整合型表达载体包括一个或多个启动子和/或终止子序列，所述启动子和/或终止子序列选自由解脂耶氏酵母糖酵解途径基因、烷烃或甘油利用基因、xpr2、acc1、hmg1、erg1和erg9组成的组。
在某些实施方案中，解脂耶氏酵母atp柠檬酸裂解酶的一个或两个亚单位(genoleveresyali0d24431g和yali0e34793g)在解脂耶氏酵母中过表达。
修饰酶
本发明的修饰酶或突变酶可通过碱基对的变化、插入、取代等修饰或突变。
脂肪酸生物合成途径和类异戊二烯生物合成途径中所涉及的酶的编码基因是供突变的优选靶标。在一些实施方案中，靶基因编码酰基辅酶a羧化酶。在其它的实施方案中，靶基因编码hmg辅酶a还原酶。在其它的实施方案中，靶基因编码角鲨烯环氧酶。在其它的实施方案中，靶基因编码角鲨烯合酶。在某些实施方案中，靶基因编码atp柠檬酸裂解酶。突变可设计为降低或消除酶活性、提高酶活性或改变酶活性(如，改变底物选择性)。
在野生型产油酵母中，乙酰辅酶a通过乙酰辅酶a羧化酶(accase)被广泛引导至脂肪酸生物合成。如此，为了增加可用于角鲨烯合成的乙酰辅酶a的数量，需要降低accase的酶表达或比活性。accase的示例性基因序列是如登录号z71631所示的酿酒酵母中的acc1基因。因此在某些实施方案中accase(处于甲羟戊酸生物合成和甘油三酯生物合成之间的分支点的酶)的细胞内活性降低，会减少分配用于油合成的乙酰辅酶a的数量，从而增加其在异戊二烯途经中的可利用性。
hmg辅酶a还原酶活性是异戊二烯生物合成的限速酶。针对hmg辅酶a还原酶的示例性基因序列包括如登录号nc_001145和nc_001144分别所示的酿酒酵母中的hmg1和hmg1基因。因此，在某些实施方案中，通过修饰hmgr基因增强hmg辅酶a还原酶活性，以增加转录、稳定产生的蛋白质和/或降低产物的反馈抑制。
降低酵母中的accase活性和/或提高酵母中的hmg辅酶a还原酶活性会产生核心类异戊二烯产生有机体，其能通过操纵途经中后成的酶，产出许多相关类异戊二烯产物。
角鲨烯环氧酶催化固醇生物合成的首个关键步骤。针对角鲨烯环氧酶的示例性基因序列是如登录号nc_001139所示的酿酒酵母中的erg1基因。因此，在某些实施方案中，角鲨烯环氧酶的活性、抑制剂敏感性和/或表达将在酵母中被(例如)酶氨基酸序列中重要的催化残基削弱。
角鲨烯合酶催化通过缩合两个cl5异戊二烯前体(法尼基二磷酸酯(fpp))的角鲨烯合成。针对角鲨烯合酶的示例性基因序列是如登录号nc_001140所示的酿酒酵母中的erg9基因。因此，在某些实施方案中，角鲨烯合酶的活性和/或表达在酵母中将会增强。
atp柠檬酸裂解酶(e.c.4.1.3.8)催化裂解柠檬酸盐产生乙酰辅酶a和草酰乙酸盐。乙酰辅酶a可被accase用于脂肪酸的合成或被乙酰辅酶a乙酰转移酶用于异戊二烯和衍生物如角鲨烯的产生。
甲羟戊酸激酶是甲羟戊酸途径中hmg辅酶a还原酶之后的首个酶，其催化甲羟戊酸盐转化成甲羟戊酸-5-磷酸。因此，在某些实施方案中，甲羟戊酸激酶的活性和/或表达水平在酵母中将会提高，例如，通过改变酶氨基酸序列中重要的催化残基或增加其基因剂量或转录水平。
甘油激酶催化atp中的磷酸转移到甘油形成磷酸甘油。因此，在某些实施方案中，甘油激酶的活性和/或表达水平在酵母中将会提高，例如，通过改变酶氨基酸序列中重要的催化残基或增加其基因剂量或转录水平。
在某些实施方案中，代谢变化的结果将是把乙酰辅酶a中的碳引导到角鲨烯，且为该碳流削弱主要的竞争性途经，从而使产生的角鲨烯显著增加。
基因修复寡核碱基向酵母细胞中的递送
任何普遍已知的方法都可用在本发明的方法中，以利用基因修复寡核碱基转化酵母细胞。示例性方法包括使用电穿孔、lioac、基因枪法、酵母细胞去壁和/或土壤杆菌属(例如，参见mcclelland,cm.,chang,y.c.和kwon-chung,k.j.(2005)fungalgeneticsandbiology42:904-913)。
在某些实施方案中，基因修复寡核碱基通过电穿孔引入到酵母细胞中。在一些实施方案中，基因修复寡核碱基通过电穿孔引入到经peg(3350或4000mw)和/或醋酸锂化学处理的酵母细胞中。在某些实施方案中，基因修复寡核碱基使用peg(3350或4000mw)和/或醋酸锂引入到酵母细胞中。
在本发明的方法中使用微载体的具体条件描述在国际公布wo99/07865、us09/129,298中。例如，按顺序添加冰冷的微载体(60mg/ml)、混合双链寡核苷酸(60mg/ml)、2.5mcacl2和0.1m亚精胺；(例如)通过涡流轻轻搅拌混合物10分钟，并室温静置10分钟，随后将微载体在5倍体积的乙醇中稀释，离心并重悬于100％乙醇中。粘着溶液(adheringsolution)的成分的示例性浓度包括8-10μg/μl微载体、14-17μg/μl混合双链寡核苷酸、1.1-1.4mcacl2和18-22mm亚精胺。在一个实例中，成分浓度是8μg/μl微载体、16.5μg/μl混合双链寡核苷酸、1.3mcacl2和21mm亚精胺。
在一些实施方案中，根据本领域技术人员熟知的技术，基因修复寡核碱基可以经电穿孔递送到酵母细胞中。(例如，参见becker,d.m.和guarente,l.highefficiencytransformationofyeastbyelectroporation.methodsinenzymology,第194卷,第[12]部分，第182-186页.1991.elsevieracademicpress,london)。
对具有所需修饰酶的酵母的选择
表达修饰酶的酵母可以通过许多手段中的任一种手段来识别。在一个方法中，使用基因修复寡核碱基(gron)的共同转换策略，在同一实验中靶向选择性转换(即，标记)和非选择性转换(如，相关靶基因)。以此方式，没有被递送gron的细胞或不能传递gron指定转换的细胞会被消除。由于靶向无关基因的gron的递送预计不是选择性的，在某一频率下，成功选择转换的菌落预计也会在其它靶基因之一中具有转换。通过单核苷酸多态性(snp)分析，转换事件将得到解析。
这样，针对各个靶标，使用snp检测技术(如等位基因特异性聚合酶链反应(aspcr))从酵母中提取基因组dna并筛选个别的dna样品。为了单独确认阳性酵母中的序列变化，可能对靶基因的适当的区域进行pcr扩增，所得的扩增子直接测序或克隆，并对多个插入物测序。
或者，可以通过多种分子生物学技术中的任一种技术来识别相关基因中的突变并入，所述分子生物学技术经设计来检测所提取的核酸中的单核苷酸突变(例如，扩增方法如pcr和单核苷酸引物延伸分析)。更大的突变可以通过待突变的靶基因区域的扩增和测序进行检测。
或者，可以通过(例如)分析由酵母产生的类异戊二烯的组成来识别含有修饰酶的酵母或酵母细胞。这样，可以使用本领域已知的方法进行酵母生长并对油进行提取和分析(如，气相色谱法或hplc)。
实施例
实施例1.弯曲隐球酵母与粘红酵母的转化体系
为了创建弯曲隐球酵母(atcc菌株20508)和粘红酵母(atcc菌株10788和204091)转化体系，使用对酿酒酵母赋予卡那霉素抗性的kanmx基因表达盒(启动子-基因-终止子)作为选择性标记，以使菌株由卡那霉素敏感性转换为卡那霉素抗性(例如，参见baudin,a.等(1993)nucleicacidsresearch(21)3329-3330)。单独使用所述基因表达盒，以及使用连接于质粒的限制片段上的kanmx转化菌株，所述质粒含dna复制起点，报道在粘红酵母中(例如，参见oloke,j.k.和glick,b.r.(2006)africanjournalofbiotechnology5(4):327-332)。dna通过电穿孔、lioac、基因枪法、酵母细胞去壁和/或土壤杆菌属引入弯曲隐球酵母和粘红酵母(例如，参见mcclelland,cm.,chang,y.c.和kwon-chung,k.j.(2005)fungalgeneticsandbiology42:904-913)。
实施例2.选择性标记
为了在弯曲隐球酵母和粘红酵母中生成尿嘧啶营养缺陷型突变体，将细胞生长在含有抗代谢物5-氟乳清酸的基本培养基中，以在ura3或ura5基因中选择受损的抗性突变体。弯曲隐球酵母的33个稳定的5-foar菌落和粘红酵母的20个稳定5-foar菌落入库。来自弯曲隐球酵母和粘红酵母的野生型ura3基因均被克隆，5-foar分离株中的突变ura3基因被测序。
其它的营养缺陷型标记通过功能互补在酿酒酵母中进行克隆(参见ho,y.r.和chang,m.c.(1988)chinesejournalofmicrobiologyandimmunology21(1):1-8)。从弯曲隐球酵母和粘红酵母中构建基因组和/或cdna文库，供连接入尿嘧啶选择性酿酒酵母表达载体中以便于转化入菌株yph500(matαura3-52lys2-801ade2-101trpl-△63his3-△200ieu2-△1)，以选择赖氨酸、腺嘌呤、色氨酸、组氨酸和亮氨酸原养型微生物。根据这些原养型微生物，从基因组或cdna插入物中对lys2、ade2、trp1、his3和leu2的相应基因测序。
实施例2.使用rtds技术对酵母的基因操纵
通过pcr对来自解脂耶氏酵母菌株atcc90811(leu2-35lys5-12ura3-18xpr2b)的leu2、lys5和ura3基因的等位基因进行克隆，并将它们的序列与野生型等位基因相比较以识别差异。
对ura3来说，差异发现在位置1365(a→g突变，导致aaa→aag赖氨酸编码的沉默变化)、1503(atcc90811中的aagaa额外序列，其导致框架变化，但在1511处返回框架中产生7个附加的氨基酸，之后序列如genbank中的ylura3一样延续)、1511(atcc90811中的额外t)和1978(c→t突变，引起截断蛋白质24个氨基酸而不含羧基端的终止突变)。gron寡核苷酸设计成通过转换stop(tga)→r(cga)来恢复原养型以产生264r，基于ylura3-ylu40564氨基酸编号。所用的gron是ylura31264/c/40/5'cy3/3’idc，其具有序列vcgaggtctgtacggccagaaccgagatcctattgaggaggh，和ylura31264/nc/40/5'cy3/3’idc，其具有序列vcctcctcaataggatctcggttctggccgtacagacctcgh，其中v＝cy3；h＝3'dmtdccpg。使用基于醋酸锂的方法将每个gron(10、30和50μg)转化入解脂耶氏酵母菌株atcc90811，并涂在ura-2％葡萄糖上。gron使用编码链设计时总共获得82个ura+菌落，gron使用非编码链设计时获得6个菌落，证明利用空隙修复寡核苷酸的转化中常见的链偏好性。18个编码链转化株的测序证明在17个克隆中发生预期变化。
对于leu2来说，差异发现在位置1710(额外的c缺少，导致框架移位和过早的蛋白质终止)；1896(额外的t)；2036(t→a突变，位于终止密码子之后)；2177(丢失的额外的t，位于终止密码子之后)。
对于leu2来说，差异发现在位置1092(g→atcg→tca，保守性取代(丝氨酸))；1278(g→acag→caa，保守性取代(谷氨酸))；1279(g→aggt→att，改变v→i)。
因此，突变可用于各种目的，例如使原养型酵母转变为营养缺陷型，反之亦然。
如对解脂耶氏酵母所述执行类似的证明rtds技术对弯曲隐球酵母和粘红酵母的效力的策略，其中ura3突变被修正为恢复原养型。
在某些实施方案中，rtds技术对解脂耶氏酵母的效力可以通过将大肠杆菌潮霉素基因的突变型式整合入其基因组来证明。该基因的这种型式(其庇护g34t处的点突变)编码e12stop变化，从而不影响解脂耶氏酵母的天然潮霉素敏感性。用修正这种突变的gron进行转化，会对解脂耶氏酵母菌株赋予(例如)多达1000ug/ml潮霉素的抗性。还在潮霉素抗性(hgh)基因中构建双突变，包含可能被一个gron修正的g34ta37t(e12astopk13stop)和可能被两个gron修正的g34tt149g(e12stopy46stop)。
为了测试gron在耶氏(yarrowia)中的活性，利用野生型解脂耶氏酵母对氨基糖苷类抗生素潮霉素b的天然敏感性。潮霉素b(hmb)是吸水链霉菌(streptomyceshygroscopicus)产生的氨基环醇抗生素，其通过妨碍核糖体易位和氨酰trna识别，来抑制原核生物和真核生物的蛋白质合成。从大肠杆菌(genbankv01499)引入hph基因(又叫做aph(4))可获得抗性，所述基因编码氨基环醇磷酸转移酶，该酶通过磷酸基团至环醇环4-位的共价加成使潮霉素b灭活。利用含有单突变(来自g34t的e12stop)或双突变e12stopk13stop(g34t.a37t)的克隆入载体pylexl-2u-ura3-13的大肠杆菌hph基因对解脂耶氏酵母菌株polg(来自yeastern的mataura3-302::ura3leu2-270xpr2-322axp-2)进行转化，使基因处于hpd4启动子和xpr2终止子的控制之下。针对恢复由leu2标记赋予的原养型作出选择之后，将线性化载体整合入基因组。所得的菌株庇护潮霉素磷酸转移酶基因的失能型式(因此潮霉素敏感)，且通过以下使g34t或g34t.a37t恢复至野生型(潮霉素抗性)的gron转换。
用于恢复e12stop至野生型(t34g)的gron
hph2/c/42/5'cy3/3'idc
5'cy3-gaactcaccgcgacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaag-3’idc
hph2/nc/42/5'cy3/3'idc
5'cy3-hcttttcgatcagaaacttctcgacagacgtcgcggtgagttc-3’idc
用于恢复e12stopk13stop至野生型(t34gt37a)的gron
hph3/c/43/5'cy3/3'idc
5'cy3-ctcaccgcgacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaagttcg-3’idc
hph3/nc/43/5'cy3/3'idc
5'cy3-cgaacttttcgatcagaaacttctcgacagacgtcgcggtgag-3’idc
使用30μg指定的gron重复(x6)转换单-hph或双-hph突变菌株，汇集，并将等分试样涂在含有100-1000μg/ml潮霉素的yepd板上以优化信噪比。使用两种菌株，在高于“无dna”对照的任何给定潮霉素浓度，都获得大量的推定转换菌落，在两种情况下都有对非编码gron链的强烈偏好性。总的来说，这些结果表明潮霉素磷酸转移酶基因靶标在解脂耶氏酵母中的gron转换，以及进一步表明两种突变(t34gt37a)可以使用单个gron来完成转换。进行dna测序是为了确认野生型基因型的恢复。
实施例3.靶基因的克隆
将针对乙酰辅酶a羧化酶(accase)、羟甲基戊二酸单酰辅酶a还原酶(hmgr)、角鲨烯合酶和角鲨烯环氧酶的序列(可获得于酵母菌和其它酵母的ncbi数据库中)用作pcr引物的来源，其对应的基因隨它们对应的调控区域(启动子，终止子)一起克隆自弯曲隐球酵母和粘红酵母。为了识别分别提高或降低转录的“上调”和“下调”启动子突变，用相对易出错的dna聚合酶克隆这四种基因的启动子以使所述启动子内发生点突变，并且把这些片段克隆到与绿色荧光蛋白(gfp)或β-半乳糖苷酶报告基因融合的质粒内以供在酿酒酵母或大肠杆菌中进行体外测试。“上调”启动子突变通过rtds被重新引入所述hmgr和角鲨烯合酶基因组序列内，而“下调”启动子突变正在基因组accase和角鲨烯环氧酶序列中被形成。来自粘红酵母和弯曲隐球酵母内的必需基因(如gapdh，肌动蛋白)的启动子被克隆以用于异源基因表达。pcr克隆的引物根据酿酒酵母中与这些基因同源而设计。
实施例4.为增加角鲨烯产量的靶基因的操纵
accase.该accase基因的拷贝数在粘红酵母和弯曲隐球酵母和其它酵母中确定。在任何额外的拷贝中，通过紧接着翻译起始位点引入终止密码子，利用rtds来降低accase的表达。
角鲨烯环氧酶.同样地，通过二倍体中角鲨烯环氧酶的一个拷贝的破裂，实现酿酒酵母中角鲨烯积聚的增多。kamimura,n.、hidaka,m.,、masaki,h.和uozumi,t.(1994)appl.microb.biotech.42:353-357。确定粘红酵母和弯曲隐球酵母和其它酵母内角鲨烯环氧酶的拷贝数，并且在除第一个拷贝外的额外拷贝内，使用rtds紧接着翻译起始位点创建或插入终止密码子。
在一些实施方案中，通过向培养基添加特比萘芬(角鲨烯环氧酶的抑制剂)使角鲨烯环氧酶活性减弱。在某些实施方案中，角鲨烯环氧酶的氨基酸被改变以提高角鲨烯环氧酶对特比萘芬的敏感性(如与定位在酵母菌erg1上的g30s、l37p和r269g同源的氨基酸变化)。在某些实施方案中，所述氨基酸变化是通过野生型基因的基因合成和利用同源重组的突变型式的置换而完成的。在其它实施方案中，所述变化通过rtds引入所述野生型基因。
hmgr.酿酒酵母和哺乳动物的hmgr酶在它们的连接区域都含有氨基酸序列是存在于许多经历真核生物的快速细胞内周转的短寿命蛋白内(见于rogers，s.、wells，r.和rechsteiner，m.(1986)science234:364-368；和chun，k.t.和simoni，r.d.(1991)j.biol.chem.267(6):4236-4246)。类似的序列，如果存在，在解脂耶氏酵母、粘红酵母和/或弯曲隐球酵母的hmgr基因内被识别，并使用rtds消除以降低hmgr蛋白质周转。此类类似的序列已经在酿酒酵母的角鲨烯合酶基因中发现，还有待确定此类序列是否存在于解脂耶氏酵母、粘红酵母和/或弯曲隐球酵母的角鲨烯合酶基因内。如果这些序列存在于解脂耶氏酵母、粘红酵母和/或弯曲隐球酵母的角鲨烯合酶内，那么也要用rtds消除以降低蛋白质周转。
酿酒酵母内的hmgr包含两个高度保守域，其中的n端552个氨基酸负责膜缔合。所述仅含有c端催化部分的截断hmg1蛋白的过表达引起hmg辅酶a在酿酒酵母内的活性增加到40倍，同时角鲨烯积聚量增长到干物质的5.5％(polakowski，t.、stahl，u.和lang，c.(1998)appl.microbiol.biotech.49:66-71)。有待确定解脂耶氏酵母、粘红酵母和/或弯曲隐球酵母的hmgr蛋白是否具有类似的结构，如果是，那么可以表达仅具有可溶性催化域的片段。
hmgr的蛋白质结构和dna序列在真核生物之间(从真菌到哺乳动物)高度保守，其具有与膜缔合的n端域和催化的c端域。两个域之间的界限可被定位到解脂耶氏酵母hmg1基因(gendouvres解脂耶氏酵母yalioe04807g)内氨基酸500-600的区域，其中疏水性曲线从疏水过渡到亲水。根据解脂耶氏酵母hmg1的疏水性曲线的评价和其与截断酿酒酵母(donald,k.a.g.等,1997.appl.environ.micro.63(9):3341-3344)和产朊假丝酵母(shimada,h.等,1998.appl.environ.micro.64(7):2676-2680)蛋白质的n端的同源性，选择残基548和544。因此，在一个实例中，解脂耶氏酵母hmg1i的c端域的548-1000氨基酸被表达；在又一个实例中，解脂耶氏酵母hmg1i的c端域的544-1000氨基酸被表达。在相关实例中，解脂耶氏酵母hmg1i的c端域的543-1000氨基酸被表达；或解脂耶氏酵母hmg1i的c端域的545-1000氨基酸被表达；或解脂耶氏酵母hmg1i的c端域的546-1000氨基酸被表达；或解脂耶氏酵母hmg1i的c端域547-1000氨基酸被表达；或解脂耶氏酵母hmg1i的c端域的549-1000氨基酸被表达。
hmgr的c端催化域的457个氨基酸(残基543-1000)在解脂耶氏酵母菌株polg内的表达产出2％角鲨烯/总脂质，相比之下，在使用摇瓶的实验中含有单独载体的对照菌株内为0％。重复所述过程并使用发酵罐扩张。
在叙利亚仓鼠中，所述hmgr催化域的活性经amp依赖性激酶的磷酸化作用而下调(omkumar,r.v.,darnay,b.g.,和rodwell,v.w.(1994)j.bioi.chern.269:6810-6814)，且在酿酒酵母中已描述类似的调控模式。有待确定粘红酵母、弯曲隐球酵母和其它酵母内的hmgr蛋白是否类似被调控，如果是，那么应使用rtds消除磷酸化位点。
角鲨烯合酶.在哺乳动物系统中，角鲨烯合酶与hmg辅酶a合酶和法尼基二磷酸合酶一起通过srebps(固醇调控元件结合蛋白)协调调控转录水平(szkopinsda，a.、swiezewska，e.和karst，f(2000)biochem.biophys.res.comm.267:473-477)。srebps以三种形式存在，其中一种结合角鲨烯合酶启动子。有待确定，此类转录因子和/或结合位点是否存在于粘红酵母、弯曲隐球酵母和其它酵母中的角鲨烯合酶启动子上，如果存在，那么使用rtds来改变此类加强角鲨烯合酶转录的转录因子和/或结合位点。
解脂耶氏酵母的角鲨烯合酶在解脂耶氏酵母菌株polg中的过表达产出2％角鲨烯/总脂质，相比之下，使用摇瓶并含有单独载体的对照菌株内为0％。重复所述过程并使用发酵罐扩张。
实施例5.弯曲隐球酵母的生长条件
对弯曲隐球酵母的生长进行评价以确定最好的碳源来最大化其培养物中的细胞团。在以酵母提取物为基础的丰富培养基内(10g/l酵母提取物，20g/l蛋白胨)，弯曲隐球酵母在2-20％w/v的葡萄糖中生长良好，4天后在16％w/v和以上的葡萄糖下达到的最高水平为55g/l的细胞干重(cdw)。同样地，弯曲隐球酵母生长在有3-12％w/v甘油的同样培养基内，5天后在12％w/v甘油中达到的cdw为40g/l。弯曲隐球酵母也生长在高达3.5％w/v的生物柴油的甘油内(加州coachella市的imperialwesternproducts)，产生23g/l的cdw。
实施例6.为增加角鲨烯产量的靶基因的环境操纵
通过测试环境操纵来提高角鲨烯的净得率。这些包括(a)用油酸、橄榄油或其它植物油、肌醇、胆碱、soraphen、二氢吡啶和烯草酮或其它accase抑制除草剂来抑制accase的表达和/或活性，(b)用特比萘芬、托萘酯和麦角固醇或其它角鲨烯环氧酶抑制杀菌剂来抑制角鲨烯环氧酶的表达和/或活性，(c)操纵甘油基培养基中的碳氮比(在起始培养基内或通过添加)，(d)改变培养基内的氮源(有机的vs.无机的vs.简单的/复杂的)，(e)改变碳添加方案(如分批vs.补料)，(f)检测除碳源外的消耗性养分的影响，(g)改变碳源，包括糖混合物、糖醇、醇类、多元醇、和有机酸，(h)选择在如洛伐他汀或其它他汀类抑制剂的hmgr-抑制化合物上生长，和(i)为获得培养物中的高油产量进行选择，使用亲脂性染料或着色剂和/或通过使用(例如)重量分析方法或气相色谱方法分析可萃取的脂质。
例如，在30℃、300rpm，在补充有0至50μg/ml特比萘芬的高碳氮比的培养基中(c/n＝420，li,y-h.、liu,b.、zhao,z-b.和bai,f-w.2006“由圆红冬孢酵母菌产生脂质的最佳培养基和发酵条件(optimizedculturemediumandfermentationconditionsforlipidproductionbyphodosporidiumtoruloides)”中国生物工程杂志(chinesejournalofbiotechnology)22(4):650-656)(下文称“cym001培养基”)培养解脂耶氏酵母atcc90904持续120小时。12.5μg/ml或更高浓度的特比萘芬导致角鲨烯高达18.5％的总脂质。
各种解脂耶氏酵母菌株被用于产生脂质和角鲨烯，包括atcc20688、atcc90811、atcc90904、atcc90812、atccmya-2613和yeasternpolg。例如，在30℃、300rpm，在补充有0至50μg/ml特比萘芬的高碳氮比的培养基中(c/n＝420，li,y-h.、liu,b.、zhao,z-b.、和bai,f-w.2006“由圆红冬孢酵母菌产生脂质的最佳培养基和发酵条件”中国生物工程杂志22(4):650-656)(下文称“cym001培养基”)培养解脂耶氏酵母菌株polg(yeastern)持续120小时。12.5μg/ml或更高浓度的特比萘芬导致角鲨烯高达38％的总脂质，并实现高达51％的总脂质/细胞干重的值。
在另一个实施例中，在30℃、300rpm，在补充有0至50μg/ml油酸的cym001培养基中培养解脂耶氏酵母atcc90904持续120小时。发现补充10μl/ml油酸可将以脂质/cdw(细胞干重)计的脂质积聚提高至没有补充时的10倍。
在又一个实施例中，在30℃、300rpm，在补充有0至200μμ烯草酮的cym001培养基中培养解脂耶氏酵母atcc90904持续120小时。补充200μμ烯草酮导致每60ml烧瓶的角鲨烯产量(mg)增长到60倍。
增加氧气已证明会引起hmg1和hmg2在酿酒酵母中的差异性调控，从而导致在有氧条件下hmg2快速降解和hmg1表达增加(casey,w.m.、keesler,g.a.、parks,l.w.(1992)j.bact.174:7283-7288)。有待确定我们的产油酵母中hmgr基因的数目是否受氧气影响，如果是，那么将通过改变氧气水平在发酵罐内操纵它们的表达和活性。
以“cym001培养基”(li,y-h.、liu,b.、zhao,z-b.和bai,f-w.(2006)中国生物工程杂志22(4):650-656)开始，改变各种组分及其浓度(包括添加新组分)以改善细胞生长、总脂质含量/单位细胞质量的百分比，和角鲨烯/总脂质的百分比。所评价的培养基组分包括：碳源：甘油、葡萄糖，氮源：铵化合物、硝酸盐、氨基酸，矿物盐：钾、镁、钠、铁、锰、锌、钙、铜、酵母提取物、脂质前体和脂质合成影响因子：特比萘芬、烯草酮、油酸、棕榈油酸、亚油酸、亚麻酸和消泡剂。其它评价的因子包括：接种菌百分比、消耗的发酵时间、温度、ph、反压力、溶解氧(do)、补料组成、补料策略和搅拌策略。
实施例7.菌株的选择
传统的菌株选择方法用在产油酵母中以提高其角鲨烯的净生产率。筛选和/或选择通过紫外线(uv)、亚硝基胍或乙烷磺酸甲酯诱变的菌株以获得增加的角鲨烯积聚量。菌株也经历迭代选择的压力，如在yep(15g/l酵母提取物，5g/l蛋白胨)含有3％甘油的培养基或含有洛伐他汀和其它已知hmgr抑制剂的培养基上的重复传代。也使菌株经历在cym001含有不同数量的甘油和/或葡萄糖的培养基或含有洛伐他汀和/或其它已知hmgr抑制剂和/或角鲨烯合酶抑制剂的培养基上的重复传代，来获得hmgr和/或角鲨烯合酶活性增加的自发突变体。该类突变可发生在hmgr、角鲨烯合酶或其它基因内(“继发性位点突变”)。
除非另外定义，否则本文使用的全部技术和科学术语与本发明相关领域的技术人员通常理解的意思相同。
本文说明性描述的本发明可在缺少本文未具体公开的任何元素或限制的情况下被适当实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被扩展地且无限制地理解。此外，本文使用的术语和表达是用作说明性的术语而不具有限制性，且在使用这类术语和表达时，并非意图排除所示出和所描述的特征或其部分的任何等效物，而是公认可在所要求的发明范围之内做出各种修改。
因此，应当理解尽管本发明通过优选实施方案和任选的特征具体公开，但是本领域的技术人员可对其在文中具体化的发明进行修改、改进和变更，并且这些修改、改进和变更被视为在本发明的范围内。在此提供的材料、方法、和实施例是优选实施方案的代表，是示例性的，而非意图作为对本发明范围的限制。
本文从广义上和种属上对本发明进行了描述。落在一般性公开范围内的每个较狭义的物种和亚属群也是本发明的构成部分。这包括本发明带有附带条件或从属类中去除任何目标物质的负面限制的一般性描述，不管该切除的材料是否在本文具体引述。
此外，就markush群描述本发明的特征或方面时，本领域的技术人员应认识到本发明因而也就markush群中的任一个体成员或成员亚群进行描述。
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