重组内皮抑素的新型纯化复性方法及其抗肿瘤应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程W及生物医药领域，更具体地，本发明涉及重组内皮抑素的 新型纯化复性方法及其抗肿瘤应用。
【背景技术】
[0002] 抑制血管生成已经成为临床抗肿瘤治疗的新祀点。肿瘤的发生、生长和转移依赖 于肿瘤周围的血管提供营养和途径，没有正常血供的肿瘤最大生长不超过l-2mm2。切断肿 瘤组织的血液供应就有可能间接杀死肿瘤细胞并抑制肿瘤细胞的转移，从而达到治疗肿瘤 的目的。更重要的是，传统的细胞毒性化疗药物都会因剂量累积导致严重的细胞毒效应，并 且由于肿瘤细胞本身的基因异质性导致耐药性的产生，极大地限制了此类化疗药物对肿瘤 的治疗效果。因此联合使用血管生成抑制药成为了目前临床研究的新热点。
[0003] 目前在临床试验期的重组人血管内皮细胞生长抑制素（riiEndostatin，rhED)多 来源于真核酵母表达系统，造价高且产率低，极大地限制了该蛋白药物的临床推广使用。
[0004] 原核表达系统产生的内皮抑素因复性困难，可溶性蛋白的得率极低，研究实验多 采用包涵体直接注射的方法进行，限制了其治疗效果的有效性。
[0005] 鉴于上述现有技术中原核表达W及酵母表达重组人内皮抑素的困难因素，目前中 国已经上市的一种重组人内皮抑素其半衰期很短，仅2小时，极大地限制了其抗癌活性的 发挥。
[0006] 综上，本领域迫切需要开发成本低廉、得率高的大规模生产内皮抑素蛋白的表达 和纯化方法。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供重组内皮抑素的新型纯化复性方法及其抗肿瘤应用。
[0008] 在本发明的第一方面，提供一种从重组人血管内皮细胞生长抑制素包涵体蛋白制 备可溶性蛋白的方法，所述方法包括：
[0009] (1)将重组人血管内皮细胞生长抑制素包涵体进行变性，获得变性溶液；
[0010] (2)将（1)的变性溶液进行柱纯化，获得经过柱纯化的溶液；
[0011] (3)应用透析液将（2)的经过柱纯化的溶液进行梯度透析；透析液包括；醋酸钢、 尿素、甘氨酸、EDTA，透析液P册.0 + 0. 3 ;较佳地P册.0 + 0. 2。
[0012] 在一个优选例中，所述的重组人血管内皮细胞生长抑制素的N末端起始密码子之 后还包括H个氨基酸，依次为；精氨酸、甘氨酸和丝氨酸。
[0013] 在另一优选例中，步骤（1)中，所述的重组人血管内皮细胞生长抑制素包涵体溶 解于盐酸脈中；较佳地，所述的盐酸脈浓度为6+ 0. 5mol/L。
[0014] 在另一优选例中，所述的重组人血管内皮细胞生长抑制素携带化S纯化标签（较 佳地，His纯化标签存在于其C端；更佳地位于C端终止子之前）；
[0015] 并且，步骤（2)中，采用Ni-NTA柱纯化。
[0016] 在另一优选例中，步骤（2)中，Ni-NTA柱纯化方法包括：
[0017] (a)清洗亲和柱，用8mol/L的尿素（较佳地5个柱体积，溶于磯酸盐缓冲液， P册.0)平衡系统；
[0018] 化）W 5ml/min的速度上样所述的变性溶液，上样结束后W P册.0的磯酸钢（较佳 地5个柱体积）洗脱杂蛋白；和
[001引 （C)WPH4. 5的磯酸钢收集目的蛋白。
[0020] 在另一优选例中，步骤（3)中，Wmol/L为单位，所述的透析液包括：
[0021] 透析液A;醋酸钢0. 25,尿素3,甘氨酸0. 5,邸TA0. 4 ;
[002引透析液B;醋酸钢0. 25,尿素2,甘氨酸0. 5,邸TA0. 4;
[0023] 透析液C;醋酸钢0. 25,尿素1. 5,甘氨酸0. 5,邸TA0. 4;
[0024] 透析液D;醋酸钢0. 25,尿素1，甘氨酸0. 5,邸TA0. 4;
[00巧]透析液E;醋酸钢0. 25,尿素0. 5,甘氨酸0. 5,邸TA0. 4;
[0026] 透析液F;醋酸钢0.2,甘氨酸0.25;
[0027] 透析液G;醋酸钢0.2;
[0028] 依次用透析液A-G透析1次，每次24 + 4;较佳地24 + 2小时。
[0029] 在另一优选例中，透析袋内外液的比例为1:4-6,最佳地为1:5。
[0030] 在另一优选例中，在步骤（1)之前，还包括；利用大肠杆菌，通过IPTG诱导表达重 组人血管内皮细胞生长抑制素包涵体。
[0031] 在本发明的另一方面，提供一种重组人血管内皮细胞生长抑制素的用途，用于制 备与细胞毒性化疗药物或放疗疗法联合应用W抑制肿瘤的药物组合物或药盒。
[0032] 在一个优选例中，所述的重组人血管内皮细胞生长抑制素是利用前述任一所述的 方法制备的。
[0033] 在本发明的另一方面，提供一种抑制肿瘤的药盒，所述药盒包括：
[0034] a)重组人血管内皮细胞生长抑制素；和
[003引 扣）选自下组的化疗药物；顺笛或环磯醜胺。
[0036] 在一个优选例中，所述的肿瘤包括；肺癌，肝癌，乳腺癌，黑色素瘤。
[0037] 在另一优选例中，所述的药盒中，按照重量比，所述的重组人血管内皮细胞生长抑 巧憬与顺笛的比例是；3~30:3;较佳地5~15:3;或
[0038] 按照重量比，所述的重组人血管内皮细胞生长抑制素与环磯醜胺的比例是；3~ 30:15;较佳地 5 ~15:15。
[0039] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0040] 图1、rh邸的表达和纯化。
[0041]A、SDS-PAGE胶分析。电泳条带分别是Lanel;预染分子量标记；Lane2 ;His亲和柱 纯化rh邸蛋白；Lane3JPTG诱导的细菌全菌裂解液；Lane4;未经IPTG诱导表达的细菌全 菌裂解液。
[0042]B、免疫印迹分析。电泳条带分别是Lanel ;纯化的rh邸；Lane2 =IPTG诱导的细菌 全菌裂解液；Lane3 ;未经IPTG诱导的全菌裂解液。
[0043] 图2、rh邸体外培养对人厮带血管内皮细胞（HUVEC)的生长抑制作用。
[0044] 图3、rh邸鸡胚尿囊膜血管生成抑制作用。
[0045] 图4、rh邸单独用药对荷瘤小鼠的肿瘤生长抑制作用。
[0046]A、人肺癌A549荷瘤小鼠的用药效果；
[0047]B、肝癌QGY-7703荷瘤小鼠的用药效果；
[0048]C、乳腺癌Bcap37荷瘤小鼠的用药效果。
[0049]图5、rh邸与传统细胞毒性化疗药物顺笛（A)，环磯醜胺度）对裸鼠肺癌A549 (A) 和黑色素瘤B16度）的协同抗肿瘤作用。
[0050] 图6、rh邸联合放疗对裸鼠肺癌A549细胞皮下移植瘤的抗肿瘤作用。
【具体实施方式】
[0051] 本发明人经过深入的研究，首次掲示一种新的重组人血管内皮细胞生长抑制素 (riiEndostatin，rhED)包涵体的纯化和复性方法。本发明的方法可成本低廉、得率高地获 得纯化的rh邸蛋白，其生物活性优异，药效显著。
[005引如本文所用，术语"含有"或"包括"包括了"包含"、"主要由……构成（制成）"、 "基本上由......构成"和"由......构成"。
[0053] 蛋白的表达和纯化
[0054] 本发明人尝试了采用多种表达系统（如酵母系统，大肠杆菌系统）来表达rh邸蛋 白，结果发现大肠杆菌系统可W最为高效地获得大量rh邸蛋白，且成本低廉，但是表达获 得的是包涵体形式的蛋白。
[0055] 原核表达系统（如大肠杆菌）W其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表 达水平高等优点，目前仍然是生产重组蛋白的首选表达系统。但是原核表达的蛋白当高效 表达时一般W包涵体的形式沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物，如何高效地复 性蛋白是基因工程蛋白生产过程中最关键和最困难的一步。在大肠杆菌中表达的外源重组 蛋白质包涵体，其蛋白质分子间主要通过非共价作用相互结合在一起，送些非共价作用包 括疏水作用、范德华力、氨键W及离子键作用。包涵体溶解变性与复性是蛋白纯化过程中的 最为关键的因素。
[0056] 依巧原核大肠杆菌表达系统从而高效（高产量）表达rh邸是已经实