一种酶法提取降血糖人参多糖及其在食品和药品中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药植物多糖的生物活性领域，具体涉及一种多次提取人参多糖的方 法及其在制备降血糖药物和食品中的应用。
【背景技术】
[0002] 随着社会的日益发展，人们的生活水平日益提高，我国糖尿病的发病率也在逐年 上升，糖尿病用药市场规模达到数百亿人民币。降血糖药物的开发具有非常好的应用前景。
[0003] 糖尿病主要分1型糖尿病（typeldiabetes)和2型糖尿病（type2diabetes)，1型 糖尿病和2型糖尿病均有不同程度的胰岛beta细胞损伤。现有的降血糖药物，比如胰岛 素，格列本脲，罗格列酮，阿卡波糖等，均具有不同程度的副作用，并且不能从根本上改善胰 腺功能。
[0004] 人参被人们称为"百草之王"，是闻名遐迩的"东北三宝"（人参、紹皮、鹿茸）之一， 是驰名中外、老幼皆知的名贵药材。多糖是人参的有效成分之一，现有的研究表明，人参多 糖具有很好的降血糖活性，但是人参多糖的提取方法交杂乱，收率低，人参多糖的价值没有 得到足够的开发。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在提高人参多糖的产率，发掘人参多糖的降血糖活性组分。本发明可以 通过以下步骤实现：
[0006] 1. -级人参多糖的提取：100°C条件下分别经蒸馏水煮提人参根4小时，3小时及 2小时。提取物经4层纱布过滤，合并三次提取所得滤液，离心去除其中的不溶物。上清液 加入4倍体积的95%乙醇沉淀过夜，离心，收集沉淀，干燥后得到一级人参多糖。
[0007] 2.二级人参多糖的提取：上一步剩余人参根残渣首先加入蒸馏水，沸水煮沸 30min，冷却至50°C后加入α-淀粉酶，保持50°C提取24小时。提取物经4层纱布过滤，收 集提取液，用截留分子量为3500Da的透析膜透析。收集透析膜内液，浓缩，干燥后得到二级 人参多糖。
[0008] 3.三级人参多糖的提取：上一步剩余的人参根残渣中加入50mM的EDTA二钠盐水 溶液，60°C提取3小时，按照相同条件共提取2次。提取物经4层纱布过滤，合并2次提取 所得滤液，用截留分子量为3500Da的透析膜透析。收集透析膜内液，浓缩，干燥后得到三级 人参多糖。
[0009] 4.四级人参多糖的提取：上一步剩余的人参根残渣中加入0. 05M Na2COyK溶液， 4°C提取16小时，提取物经4层纱布过滤，残渣接着25°C提取16小时。合并2次的提取液， 50%盐酸中，截留分子量为3500Da的透析膜透析。收集透析膜内液，浓缩，干燥后得到四级 人参多糖。
[0010] 5.五级人参多糖的提取：上一步剩余的人参根残渣中加入IM KOH水溶液，25°C提 取12小时。提取物经4层纱布过滤，所得提取液用50%盐酸中和，截留分子量为3500Da的 透析膜透析后，收集透析膜内液，浓缩，干燥后得到五级人参多糖。
[0011] 6.六级人参多糖的提取：上一步剩余的人参根残渣中加入4M KOH水溶液，25°C提 取18小时。提取物经4层纱布过滤，所得提取液用50%盐酸中和，截留分子量为3500Da的 透析膜透析后，收集透析膜内液，浓缩，干燥后得到六级人参多糖。
[0012] 步骤2中，α -淀粉酶的使用剂量为终浓度50至250mg/L。
[0013] 以上步骤中，干燥的方法是指乙醇沉淀常规干燥，冰冻干燥，或者喷雾干燥。
[0014] 通过HPLC法检测单糖组成，各级人参多糖的收率以及单糖组成如表1所示。
[0015] 表1各级人参多糖对beta胰岛细胞活力的影响（data=mean土 S. D.)
[0016]
[0017] Glc :葡萄糖；GalA :半乳糖醒酸；Gal :半乳糖；Ara :阿拉伯糖；Xyl :木糖；Rha :鼠 李糖；Man :甘露糖；一，未检测到。
[0018] 人参多糖改善beta胰岛细胞活力实验(细胞水平）
[0019] 培养胰岛Beta细胞RIN-m5F，培养基RPMI1640,10%胎牛血清。铺96孔板，IO 4个 细胞/孔，24小时后，加不同浓度人参多糖样品，设4复孔。48小时后，MTT法检测细胞活 力。应用SPSS统计软件，进行Dunnett' s MultipleComparison Test,检验实验组与对照组 (Omg/ml)统计显著性。实验结果见表1 :
[0020] 表2各级人参多糖对beta胰岛细胞活力的影响（data=mean土 S. D.)
[0021]
[0022] 与 Omg/ml 对比，* 表示 Ρ〈0· 05。
[0023] 从表2可知，各级人参多糖均具有一定改善beta胰岛细胞活力的活性，具有开发 为降血糖药物的潜力，其中一级人参多糖，二级人参多糖和三级人参多糖的最佳浓度均为 lmg/ml，四级人参多糖的最佳浓度为5mg/ml，五级人参多糖和六级人参多糖的最佳浓度均 为 0· lmg/ml〇
[0024] 人参多糖降血糖实验(活体水平）
[0025] C57小鼠，8周龄，空腹12小时，腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病小鼠模型。72h 后，尾静脉采血，测定空腹血糖值，取血糖值大于15. OOmmol/L的小鼠为糖尿病小鼠。
[0026] 糖尿病模型小鼠按血糖值分为6组，每组10只，阴性对照组灌胃蒸馏水，阳性对照 组灌胃l〇mg/kg剂量的阿卡波糖，其余4组分别灌胃不同剂量的人参多糖，剂量分别为10、 50、200和400mg/kg，每天灌胃给药1次，连续15天。末次给药后，将所有各组小鼠空腹12h， 尾静脉采血，测定空腹血糖值。应用SPSS统计软件，进行Dunnett' S Multiple Comparison Test，检验实验组与对照组统计显著性。实验结果见表1至表6。
[0027] 表3 -级人参多糖对STZ糖尿病小鼠血糖值影响（n=10)
[0028]
[0029] 注：与阴性对照组比较，表示p < 0. 05
[0030] 从表3可知，灌胃15天后，50, 200和400mg/kg的一级人参多糖通过灌胃给药能够 显著降低糖尿病模型小鼠的血糖，说明一级人参多糖在口服的情况下具有降血糖的作用。
[0031] 表4二级人参多糖对STZ糖尿病小鼠血糖值影响（n=10)
[0032]
[0033] 注：与阴性对照组比较，表示p < 0. 05
[0034] 从表4可知，灌胃15天后，200与400mg/kg的二级人参多糖通过灌胃给药能够显 著降低糖尿病模型小鼠的血糖，说明二级人参多糖在口服的情况下具有降血糖的作用。
[0035] 表5三级人参多糖对STZ糖尿病小鼠血糖值影响（n=10)
[0036]
[0037] 注：与阴性对照组比较，表示p < 0. 05
[0038] 从表5可知，灌胃15天后，50mg/kg，200与400mg/kg的三级人参多糖通过灌胃给 药能