专利名称：检测日本血吸虫循环抗原的鸡卵黄抗体-磁珠elisa方法
技术领域：
本发明涉及日本血吸虫循环抗原的检测技术，具体涉及检测日本血吸虫循环抗原 的鸡卵黄抗体一磁珠ELISA诊断技术。
背景技术：
血吸虫是一种寄生在静脉血管中的蠕虫，可感染人和牛等家畜在内的多种哺乳动 物引起血吸虫病。血吸虫病病人若得不到及时的诊断和治疗，可引起以肝硬化和腹水为主 的晚期血吸虫病，病人完全丧失劳动能力和生活自理能力，并最终因肝昏迷或不可控制的 上消化道出血而死亡。目前，血吸虫病仍是一种严重危害人类健康和经济发展的寄生虫病， 全世界有74个国家和地区流行此病，每年感染人数达2亿之多，在我国流行的为日本血吸 虫病。血吸虫病在我国长江流域及以南的湖南、湖北、江西、安徽、江苏、云南、四川、浙江、广 东、广西、上海、福建等13个省、市、自治区的370个县市流行，累计感染者达1160万人，钉 螺面积为143亿m2，受威胁人口在1亿以上。因此，血吸虫病防治工作所面临的形势仍然十 分严峻。人及牛、猪、鼠等多种哺乳动物是血吸虫的终宿主，当人或牛等接触含有血吸虫尾 蚴的疫水时，尾蚴钻入宿主皮肤并脱掉尾部转变成童虫，在宿主皮下组织作短暂停留后，进 入血管或淋巴管，随血流经右心到肺，再由左心进入大循环，到达肠系膜动脉的童虫可穿过 毛细血管进入肝门静脉。童虫在肝门静脉发育到性器官初步分化后雌雄虫合抱，再移行到 肠系膜静脉及直肠静脉寄居、交配、产卵。从尾蚴钻入皮肤到虫体发育成熟并产卵，日本血 吸虫约需M天。成虫寄生于门脉一肠系膜静脉系统，雌虫产卵于肠粘膜下层静脉末梢内。 一部分虫卵随静脉血流沉积在肝脏或结肠肠壁组织内，另一部分虫卵可随破溃的组织落入 肠腔，并随宿主粪便排出体外。排出体外的虫卵必需入水，在合适的温度、渗透压和光照等 条件下孵出毛蚴，当毛蚴遇到其中间宿主钉螺时即钻入钉螺体内，经过母胞蚴、子胞蚴的无 性繁殖阶段发育成尾蚴。在适宜的条件下，尾蚴自螺体逸出后即可感染新的宿主，开始新一 代的繁殖。早期、正确的诊断是控制血吸虫病流行的重要环节。我国经过半个多世纪的血防 工作，目前绝大部分疫区的血吸虫病感染率和患者的感染度都有明显下降，处于轻、中度感 染(5-10%)。在血吸虫病的诊断中，粪检发现虫卵是确诊血吸虫感染的依据，但由于排 卵量受感染度和感染阶段等诸多因素的影响，在中度或低度血吸虫病流行区粪检的敏感 性并不能令人满意，漏检率高，特别是在我国，单纯依靠粪检已不能满足血吸虫病诊断的 需要，因此免疫学检查已成为血吸虫病诊断的重要手段。传统的免疫学诊断主要是检测 患者血清中抗血吸虫抗原的特异性抗体。常用的抗体检测方法有皮内试验(intradermal test, IDT)、环卵沉淀试验(circumoval precipitin test, COPT)、间接红细胞凝集试 验(indirect haemagglutination test, I HA)、B！联免疫吸附 i式验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、间接焚光抗体试验(indirect fluorescent antibody method, IFA)等。但在血吸虫感染后抗体存在时间长，无法区分现症和既往感染，对病人治疗的指导意义不大。而循环抗原(circulating antigens, CAg)是活的虫体在人体内寄生 时排泄分泌的，一般认为，在急性血吸虫病患者血清中CiVg含量高，而在慢性血吸虫病患者 血清中，由于CAg不断与血清抗体结合形成血吸虫循环免疫复合物，故CAg含量较少。所 以，CiVg检测对于血吸虫病的早期诊断和区分现症感染和既往感染特别有价值，并能作为疗 效考核的指标，但因含量少，所以对检测方法的灵敏性和特异性都要求更高。在国内外研究者的共同努力下，血吸虫病的免疫学诊断取得了显著的进步，但仍 然存在一些关键的技术问题。(1)现行的血吸虫病检测系统的疗效考核价值均不理想，主要原因是现有的大量 检测试剂都是检测抗体的，而抗体在病人治疗后的1-3年甚至十几年后仍可在血清中检测 到，无法区分现症和既往感染，因此需为疗效考核提供一种有效的以检测抗原为主的诊断 系统。(2)循环抗原检测方法的主要困难在于患者特别是慢性期患者体内的循环抗原含 量非常少，目前的检测体系的敏感性较低，尤其是在对我国大量的轻度流行区的评估上还 没有十分行之有效的方法。(3)血吸虫病诊断试剂种类很多，水平参差不齐，试剂质量存在批间生产的差异和 不稳定的问题；诊断标准不够客观化，存在人为误差等。目前所用的血吸虫抗体诊断方法虽然日趋成熟，但关键性的问题是抗体阳性区分 不了被检者是现症感染还是既往感染，因为抗体在患者治愈3-4年，甚至更长时间后仍可 存在血清中，故而无法对药物治疗提供有价值的指导，会让一些已经治愈的血吸虫病患者 无辜服药。而抗原检测阳性则意味着患者为急性感染，因为体内有活的虫体存在，才会向血 液中释放抗原物质。目前还未报道有敏感性高的血吸虫抗原检测试剂，寻找敏感和特异的 循环抗原检测方法并推向广大的流行区是血吸虫病诊断试剂研究与开发的主要方向。鸡卵黄免疫球蛋白(Egg yolk immunoglobulin, IgY)是鸡血液中的IgG抗体选择 性转移到卵黄中形成的，是普遍存在于鸟类、爬行动物和两栖类血清和卵黄中的典型的低 分子量抗体，不具有类似于IgG的50kDa重链Y，且IgY的重链明显大于哺乳动物IgG的重 链；在功能上等价于哺乳动物IgG，而抗原性方面存在较大的差异，在免疫诊断方面比哺乳 动物源性的IgG更具优势。IgY由两条重链(H)和轻链(L)组成，没有铰链结构。分子量为ISOKDa (7. 8S)，重 链为67-70KDa，轻链为25Kda。有一个小体积副本，120KDa(5. 7S)，存在于野鸭和某些龟类 中。较小的IgY的H链缺乏C3、C4区，由于使用了特异的未端外显子(位于C2和C3恒定 区外显子间的内含子中)，5. 7S IgY与F (ab) 2片段十分相似，因此正确名称为IgY(AFc)， 其H链为u)(AFc)。7.8S IgY和5.7S IgY(AFc)可共存于同一种动物或单独存在。IgY抗体仅在脊椎动物中发现，其分子结构存在多样性，与抗原结合位点构成组分 相关，其编码基因是可变基因(V)、多样化基因⑶和结合基因(J)，通过V、D和J基因的 随机选择重组产生所有多样性初级抗体。低等脊椎动物对抗原应答所产生的抗体呈现较窄 的、受限制的多样性。鸡的抗体L和H基因座位仅有一个V基因和一个J基因，只有D基因 成簇存在(16个基因)。因此鸡的Ig基因多样性是以基因转变的形式通过同源重组产生， 缺乏选择高亲和性的体细胞突变的机制。IgY和IgY(AFc)都含有2个抗原结合位点，原则上来说，可以与多个抗原发生沉淀或凝集反应现象，但事实并非如此。大多数鸡的抗体能牢固地结合抗原却只有在高盐浓 度下(如1.5M NaCl)才能引起沉淀或凝集反应。鸭的抗体经常不能表现有效地沉淀或凝 集作用，那些没有发生凝集的抗体即使在提高盐的浓度下仍不能获得凝集抗原的能力。这 是因为两个Fab片段的距离太近，由于空间位阻的原因，阻碍了它们与大分子抗原的结合。 在高盐或低PH情况下，IgY释放Fab间的距离以允许它们各自独立地结合抗原分子。Ig的 许多效应器功能是通过Fc区介导的，故而IgY(AFc)不能激活哺乳动物的补体系统、不与 RF因子、类风湿因子结合和SPA、SPG结合等功能。从系统进化角度来说，AFc Igs的存在 是具有一定的选择优势。用母鸡作为免疫动物和把鸡蛋作为抗体的来源有以下优势(1)由于种系发生之间距离大，母鸡可对哺乳动物的抗原产生更强的免疫应答；(2)母鸡可以持续的产生高亲和力的抗体。20_30mg的高度保守的哺乳动物抗原 可引起高效价的IgY长时间的分泌；(3)无损伤的抗体收集。只需收集免疫母鸡的鸡蛋即可获得IgY ；(4)高产。一只母鸡一年可产下约280只蛋，每只蛋含有100_150mg的IgY，这样 每只鸡每年可生产的IgY ；(5)不和类风湿因子结合。在检测中应用IgY可避免假阳性结果；(6)与补体不发生反应。哺乳动物的IgG可激活补体，导致假阴性的产生。IgY不 和补体发生反应，在检测哺乳动物的血清时，可减少由补体造成的干扰。20世纪80年代以来IgY抗体开始广泛应用，Dr. C. Staak在1995年首先使用IgY 技术这一术语。1996年，IgY抗体的生产和应用被定义为IgY技术。如今，它已是一个世 界性的标准化技术。不断增长的文献数目显示，IgY技术正成为医药领域的新热点。近年 来，IgY在疾病的诊断方面得到广泛的应用，如致病性大肠杆菌(EPEC)引起的婴幼儿腹泻， 人乳头状瘤16型感染，甚至可以特异性地诊断缺氧，但在血吸虫病的免疫诊断中尚未见报 道，也未见关于制备抗血吸虫抗原的IgY的相关技术和产品。免疫磁珠技术(immunomagnetic bead techniques)是以高均一性的磁性微球为 固相支持物，表面包被免疫配基如抗体等，利用特异性的免疫反应从混合液中分离检测靶 物质° 石兹珠BS联免疫分析技术(Immunomagnetic beads Enzyme-linked Immunosorbent Assay, IMB-ELISA)是在ELISA原理的基础上建立的一种新型固相免疫检测技术，较常规 ELISA敏感。IMB-ELISA与普通ELISA相比具有以下主要优势(1)普通ELISA中，包被的 抗体只有少数Ig分子的Fab段能与液相中的相应抗原特异性结合，多数Fab段因朝向固相 面或与抗原平行，难以与抗原结合；而磁珠呈球形，颗粒微小，数量多，总的表面积增多，使 其表面包被的抗体分子与抗原结合的机会大大增加。(2)包被的抗体在捕获抗原时，结合反 应也主要发生在固相的界面上。而IMB-ELISA中抗原抗体反应可在液相中进行，提高了抗 体与抗原表位的可及性，这种反应模式大大提高了反应的效率，因而较传统固相ELISA灵 敏度高。( 免疫磁珠可以进行再生化。再生后的免疫磁珠可以实现反复利用。(4)免疫 磁珠技术的整个反应过程1小时即可完成，操作简便快速，因而在免疫检测中也有巨大的 应用前景。目前尚未见将免疫磁珠技术应用于血吸虫病免疫学诊断的报道及成熟试剂盒。
发明内容
本发明用日本血吸虫的特异性抗原皮下多点注射的方法免疫母鸡，从鸡蛋黄中提 取、纯化并鉴定特异性IgY，再将多克隆IgY耦联在磁珠上，以磁珠一 IgY多克隆抗体为捕 获抗体，特异性单克隆IgG抗体为检测抗体进行血吸虫循环抗原的检测，既能利用磁珠和 IgY捕获更多抗原，从而提高敏感性，又能用单抗提高检测的特异性，从而达到免疫学诊断 中所要求的敏感与特异的高度结合和协调。这种新型的血吸虫循环抗原的检测方法—— IgY-IMB-ELISA可为血吸虫病诊断提供一种具有高灵敏度和高特异性的检测试剂盒，同时 也为其它众多的病原体的检测和感染性疾病的诊断开创新的技术和手段。本发明的任务是提供一种抗日本血吸虫虫卵可溶性抗原(soluble egg antigens, SEA)的鸡卵黄免疫球蛋白IgY标记的纳米磁珠。本发明的另一个任务是提供一种体外检测血吸虫抗原的IgY-磁珠ELISA法。本发明的又一个任务是提供一种检测血吸虫抗原的试剂盒。实现本发明的技术方案是本发明提供的抗日本血吸虫虫卵可溶性抗原(soluble egg antigens, SEA)的鸡 卵黄免疫球蛋白IgY标记的纳米磁珠，是用血吸虫的特异性抗原以注射的方法免疫母鸡后， 从被免疫母鸡的鸡蛋黄中提取特异性IgY，再将该特异性IgY标记在纳米磁珠上形成的。抗日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA的鸡卵黄免疫球蛋白IgY的制备方法，包括以 下步骤步骤一、制备日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA ；步骤二、用日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA免疫母鸡，并收集鸡蛋；步骤三、从被免疫母鸡的鸡蛋黄中提取、纯化特异性IgY。上述步骤一所述的日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA的具体制备方法是将感染日 本血吸虫的钉螺在25°C，光照充分的情况下逸出尾蚴，将至少20只钉螺逸出的尾蚴混合， 经皮肤感染清洁级新西兰大白兔，感染量为800条尾蚴/兔，感染45天后麻醉感染的兔，生 理盐水心脏灌注，然后剖杀并取出肝脏，分离并收集肝脏虫卵，将收集的虫卵在冰浴中反复 勻浆后，4°C沉淀48h，IOOOOXg离心lh，吸取上清，收集分装，即为虫卵可溶性抗原SEA。上述步骤二所述的用日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA免疫母鸡并收集鸡蛋的方 法是将60μ g/ml的SEA 0. 5ml与等体积的完全福氏佐剂混合，充分乳化后经翅膀下静脉 免疫，首次免疫后10d，改用抗原加不完全福氏佐剂经鸡背部皮下加强免疫3次，免疫剂量 为30μ g SEA/只，每次间隔10d，自首次免疫后7d起收集鸡蛋，做好标记于4°C冰箱保存。上述步骤三所述的从被免疫母鸡的鸡蛋黄中提取、纯化特异性IgY的方法是取 初次免疫后60d的鸡蛋，去除蛋壳，用去离子水洗去卵黄外面的蛋清，去掉卵黄衣膜，将卵 黄与两倍体积的 0. 01mol/L pH 7. 6 的磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solution, PBS) 混合，并充分搅拌，加聚乙二醇6000 (PEG 6000)至最终浓度为5 %，并搅拌至PEG完全溶 解，4420 Xg室温离心20min，将上清液过滤，继续加PEG至其浓度为20%，充分搅拌溶解后 12，000 X g室温离心lOmin，去掉上清液，用1/6的原卵黄体积的PBS重新溶解沉淀，蒸馏水 中4°C透析2小时，其间换水3 4次，最后置PEG中浓缩至原体积的1/10，收集浓缩后的 IgY,分装后置_20°C保存备用。本发明将特异性IgY标记在纳米磁珠上的方法是将直径SOOnm的磁珠用蒸馏水洗涤后，0. IM PBS(pH7. 4，含BSA)重新悬浮并调整磁珠浓度至10mg/ml ；取5ml磁珠悬 液加50mg碳二亚胺37°C摇15min，PBS洗2次后，制成2. 5ml悬液，加入抗日本血吸虫虫卵 可溶性抗原(soluble egg antigens, SEA)的鸡卵黄免疫球蛋白IgYO. 5ml，置37°C摇床振 荡孵育90min ；加0. OlM甘氨酸(pH8. 2，含1 % BSA)缓冲液封闭过夜；PBS溶液5ml复悬，4°C储存备用。本发明提供的体外检测血吸虫抗原的IgY-磁珠ELISA法，包括以下步骤(1) IgY包被磁珠(磁珠浓度lmg/ml，抗体结合浓度为10 μ g IgY/mg磁 珠)200 μ 1/管加入减量反应管；所述的IgY包被磁珠可以是抗日本血吸虫虫卵可溶性抗原 的鸡卵黄免疫球蛋白IgY标记的纳米磁珠；(2)1 2稀释的待检血清200 μ 1/管加入减量反应管中；阴性对照为正常血清； 空白对照为 0. IM ρΗ 7. 4 的 PBST (含 0. 05% Tween-20)，37°C振荡孵育 60min ；(3)将反应管置磁铁上吸附磁珠至上清变为澄清后，去除上清，用含0.05% Tween-20的0. IM pH 7. 4Tris_HCl洗涤缓冲液洗涤3次；(4)每管加入辣根过氧化物酶标记的1 1000稀释的单克隆抗体，37°C振荡孵育 90min(5)按上述步骤( 所述方法洗涤；(6)按20(^17管加入底物溶液3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，371避光反应251^11;(7)每管加入30 μ 1的2Μ浓硫酸终止反应；(8)反应管置磁铁上至上清变为澄清后，每管吸取100 μ 1反应上清吸至96孔酶标 板中，置ELISA读数仪读取A45tl值；(9)结果判定测定A值/阴性A值(S/N)彡2. 1即为阳性。实验资料1.日本血吸虫SEA的制备本实验室传代的感染日本血吸虫的湖北钉螺(大陆株)在25°C，光照充分的情况 下逸出尾蚴，将至少20只钉螺逸出的尾蚴混合，经皮肤感染新西兰大白兔(同济医学院实 验动物中心提供，清洁级)，感染量为800条尾蚴/兔，感染45天后麻醉感染的兔，生理盐水 心脏灌注，剖杀并取出肝脏，分离并收集肝脏虫卵。将收集的虫卵在冰浴中反复勻浆后，4°C 沉淀4 后，IOOOOXg离心lh。吸取上清，收集分装，即为虫卵可溶性抗原(soluble egg antigens, SEA)。SEA蛋白含量的测定采用BCA法(BCA Protein Assay Kit，美国BIPEC)。将浓度 为 0、0· lmg/ml,0. 2mg/ml、0. 4mg/ml、0. 6mg/ml、0. 8mg/ml、lmg/ml 的标准品 20 μ 1 分别加到 96孔酶标板的标准品孔中，再将样品20 μ 1加到样品孔中，各孔加入200 μ 1的BCA工作液， 37°C反应30min，562nm处读取吸光度值。绘制标准曲线，计算样品的蛋白含量。BCA法测得 SEA的蛋白质含量≥5mg/ml。2.免疫及鸡蛋收集将60 μ g/ml的SEA 0. 5ml与等体积的完全福氏佐剂混合，充分乳化后经翅膀下静 脉免疫。首次免疫后10d，改用抗原加不完全福氏佐剂经鸡背部皮下加强免疫3次，免疫剂 量为30yg SEA/只，每次间隔10d。自首次免疫后7d起收集鸡蛋，做好标记于4°C冰箱保存。
3.聚乙二醇法提取和纯化IgY取初次免疫后60d的鸡蛋，去除蛋壳，用去离子水洗去卵黄外面的蛋清。去 掉卵黄衣膜，将卵黄与两倍体积的0. 01mol/L pH 7. 6的磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solution，PBS)混合，并充分搅拌。加5 %的PEG并搅拌至PEG完全溶解。室温 离心(4420Xg，20min)。将上清液过滤，继续加PEG至20 %，充分搅拌溶解后室温离心 (12，000Xg，10min)。去掉上清液，用1/6的原卵黄体积的PBS重新溶解沉淀。至置常规 处理过的透析袋中，蒸馏水中4°C透析池，其间换水3 4次。最后置聚乙二醇6000 (PEG 6000)中浓缩至原体积的1/10，收集分装后置-20°C保存备用。提纯后IgY的蛋白浓度约为 6mg/ml。每只鸡蛋经盐析、透析、浓缩后可以得到61mg的IgY。4. IgY的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹 (Westernblotting)分析非还原型SDS-PAGE检测相对分子质量(Mr)及纯化程度，其浓缩胶浓度为5%，分 离胶浓度为7%。还原型SDS-PSGE鉴定特异性，其浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为15% ； 每孔的上样量为7 μ g。Wfestern blotting是将SEA进行SDS-PAGE电泳后，转移到硝酸纤维 素膜上，用的脱脂奶粉4°C封闭过夜。-抗为免疫后的IgY(工作浓度为1 1000)，未 免疫的IgY作为对照；二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG (工作浓度为1 100000)。 4-氯-1-萘酚+3% H2O2显色。纯化后的完整的IgY有一条主带，其相对分子质量Mr约为130000。还原型 SDS-PAGE的结果显示裂解后的IgY共七条带，其中含有Mr为66000和35000的两条主带 和五条次带，见图2。Western blotting结果显示，SEA可被免疫后的IgY识别结合，而与 未免疫的IgY不发生反应，见图3。5. IgY敏感性的检测ELISA板每孔包被50yg的IgY，5%牛血清白蛋白(BSA)4°C封闭过夜，0. 05% pH 7. 4的PBS-吐温(Tween) 20 (PBST)洗涤3次；加连续稀释的SEA 37°C温育Ih ；同上用PBST 洗涤3次后加入抗SEA的IgG，37°C温育Ih后，同上法洗涤，加入辣根过氧化物酶(HRP)标 记的羊抗兔IgG (工作浓度为1 100000) 37°C温育lh，加底物OPD显色15min，在酶标仪 (Multiskan Ascent ；354，芬兰Labsystems公司)上读取吸光度。双抗体夹心ELISA法测 得结果表明将抗原SEA稀释到2. 4ng/ml，其A值为0. 4546，阴性对照的A值为0. 2132，S/ N大于2.1，结果仍为阳性。稀释度 Dilution免疫后卵黄蛋白A值 Absorbance of immunized IgYS/N%阴性对照 Negative control空白对照 Blank control1 100.65773.080.21320.11171:1000.51712.431:1 0000.46072.161:10 0000.45462.131:100 0000.42481.99
6.抗日本血吸虫SEA的单抗NP^_5B的制备及标记4周龄BALB/C小鼠，感染20条日本血吸虫尾蚴，感染后4个月取小鼠脾细胞作为 杂交瘤供体细胞。将供体细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合，加入PEG4000使其融合。 将细胞培养上清与日本血吸虫SEA进行ELISA，阳性孔细胞经反复亚克隆，直至所有杂交瘤 细胞生长孔的培养上清均能与SEA产生阳性反应为止。此时确认单克隆抗体细胞系建立。传代培养后收集培养细胞上清，用50%饱和硫酸铵沉淀后，溶解于0. 01M, pH7. 4 的PBS，充分透析后放置_70°C冰箱备用。经免疫双扩散鉴定，NP28-5B的同型为IgGl，其 靶抗原分子量为140KD。采用简易过碘酸钠法，将辣根过氧化物酶(HRP，RZ ^ 3.0)结合至 NP28/5B上，经滴定确定其工作浓度。7.本发明提供的IgY-IMB-ELISA检测方法7. 1动物分组、感染及血清采集20-25g雌性BALB/C小鼠40只，随机分成2组，一组经皮感染日本血吸虫尾蚴40 条/鼠(本领域常规感染方法)，另一组做正常对照，不感染血吸虫。两组小鼠饲养条件、饮 食饮水等均相同。感染45天后，2组小鼠均采集外周静脉血并分离血清，-20°C保存备用。小鼠采血 后麻醉，经肝门静脉生理盐水灌注冲虫，并做肝组织压片，镜检虫卵，以证实小鼠感染成功。 冲虫后，感染组每只小鼠均可冲出成虫，肝组织压片可见大量虫卵结节，证明血吸虫感染是 成功的。未感染的对照组小鼠则既未见虫卵也未见成虫。7. 2IgY结合磁珠直径SOOnm的磁珠(北京博迈公司)用蒸馏水洗涤后，0. IM PBS (pH7. 4，含1 % BSA)重新悬浮并调整磁珠浓度至10mg/ml ；取5ml磁珠悬液加50mg碳二 亚胺(EDC, Sigma公司)37°C摇15min, PBS洗2次后，制成2. 5ml悬液，加入0. 5ml IgY抗 体，置37°C摇床振荡孵育90min ；加0. OlM甘氨酸(pH8. 2，含BSA)缓冲液封闭过夜；PBS 溶液5ml复悬，4 °C储存。7. 3 本发明 IgY-IMB-ELISA 法的建立(1) IgY包被磁珠(磁珠浓度lmg/ml，抗体结合浓度为10 μ g IgY/mg磁 珠)200 μ 1/管加入减量反应管，所述的IgY包被磁珠是抗日本血吸虫虫卵可溶性抗原的鸡 卵黄免疫球蛋白IgY标记的纳米磁珠；(2)1 2稀释的待检血清200 μ 1/管加入减量反应管中；阴性对照为正常血清； 空白对照为 0. IM ρΗ 7. 4 的 PBST(含 0. 05% Tween-20)。37°C振荡孵育 60min。(3)将反应管置磁铁上吸附磁珠至上清变为澄清后，去除上清。用含0.05% Tween-20的0. IM pH 7. 4Tris_HCl洗涤缓冲液洗涤3次。(4)每管加入 200 μ 1 的 HRP-NP28 (工作浓度 1 6000)，37°C振荡孵育 90min。(5)洗涤同 3。(6)按200 μ L/管加入底物溶液3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)，37°C避光反应 25min。(7)每管加入30 μ 1的2Μ浓硫酸终止反应。(8)反应管置磁铁上至上清变为澄清后，每管吸取100 μ 1反应上清吸至96孔酶标 板中，置 ELISA 读数仪(Multiskan Ascent 354，芬兰 Labsystems 公司)读取 A45tl 值。(9)结果判定测定A值/阴性A值(S/N)彡2. 1为阳性。
7. 4IgY-IMB-ELISA临床小样本检测结果
权利要求
1.抗日本血吸虫虫卵可溶性抗原的鸡卵黄免疫球蛋白IgY标记的纳米磁珠，其特征在 于，它是用血吸虫的特异性抗原以注射的方法免疫母鸡后，从被免疫母鸡的鸡蛋黄中提取 特异性IgY，再将该特异性IgY标记在纳米磁珠上形成的。
2.根据权利要求1所述的抗日本血吸虫虫卵可溶性抗原的鸡卵黄免疫球蛋白IgY标记 的纳米磁珠，其特征在于，抗日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA的鸡卵黄免疫球蛋白IgY的制 备方法，包括以下步骤步骤一、制备日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA ；步骤二、用日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA免疫母鸡，并收集鸡蛋；步骤三、从被免疫母鸡的鸡蛋黄中提取、纯化特异性IgY。
3.根据权利要求2所述的制备日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA的鸡卵黄免疫球蛋白 IgY的方法，其特征在于，所述的日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA的制备方法是将感染日 本血吸虫的钉螺在25°C，光照充分的情况下逸出尾蚴，将至少20只钉螺逸出的尾蚴混合， 经皮肤感染清洁级新西兰大白兔，感染量为800条尾蚴/兔，感染45天后麻醉感染的兔，生 理盐水心脏灌注，然后剖杀并取出肝脏，分离并收集肝脏虫卵，将收集的虫卵在冰浴中反复 勻浆后，4°C沉淀48h，IOOOOXg离心lh，吸取上清，收集分装，即为虫卵可溶性抗原SEA。
4.根据权利要求2所述的制备日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA的鸡卵黄免疫球蛋白 IgY的方法，其特征在于，所述的用日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA免疫母鸡并收集鸡蛋的 方法是将60μ g/ml的SEA 0. 5ml与等体积的完全福氏佐剂混合，充分乳化后经翅膀下静 脉免疫，首次免疫后10d，改用抗原加不完全福氏佐剂经鸡背部皮下加强免疫3次，免疫剂 量为30yg SEA/只，每次间隔10d，自首次免疫后7d起收集鸡蛋，做好标记于4°C冰箱保存。
5.根据权利要求2所述的制备日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA的鸡卵黄免疫球蛋白 IgY的方法，其特征在于，所述的从被免疫母鸡的鸡蛋黄中提取、纯化特异性IgY的方法是 取初次免疫后60d的鸡蛋，去除蛋壳，用去离子水洗去卵黄外面的蛋清，去掉卵黄衣膜，将 卵黄与两倍体积的0. 01mol/L pH 7. 6的磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solution, PBS) 混合，并充分搅拌，加聚乙二醇6000 (PEG 6000)至最终浓度为5 %，并搅拌至PEG完全溶 解，4420 Xg室温离心20min，将上清液过滤，继续加PEG至其浓度为20%，充分搅拌溶解后 12，000 X g室温离心lOmin，去掉上清液，用1/6的原卵黄体积的PBS重新溶解沉淀，蒸馏水 中4°C透析2小时，其间换水3 4次，最后置PEG中浓缩至原体积的1/10，收集浓缩后的 IgY,分装后置_20°C保存备用。
6.根据权利要求1所述的抗日本血吸虫虫卵可溶性抗原(solubleegg antigens, SEA)的鸡卵黄免疫球蛋白IgY标记的纳米磁珠，其特征在于，将特异性IgY标记在纳米磁珠 上的方法是将直径SOOnm的磁珠用蒸馏水洗涤后，0. IM PBS (pH7. 4，含BSA)重新悬浮 并调整磁珠浓度至10mg/ml ；取5ml磁珠悬液加50mg碳二亚胺37°C摇15min，PBS洗2次 后，制成2.5ml悬液，加入抗日本血吸虫虫卵可溶性抗原(soluble egg antigens, SEA)的 鸡卵黄免疫球蛋白IgYO. 5ml，置37°C摇床振荡孵育90min ；加0. OlM甘氨酸(pH8. 2，含 BSA)缓冲液封闭过夜；PBS溶液5ml复悬，4°C储存备用。
7.一种体外检测血吸虫抗原的方法，包括以下步骤(1) IgY包被磁珠(磁珠浓度lmg/ml，抗体结合浓度为10 μ g IgY/mg磁珠)200 μ 1/管 加入减量反应管；(2)1 2稀释的待检血清200 μ 1/管加入减量反应管中；阴性对照为正常血清；空白 对照为 0. IM ρΗ 7. 4 的 PBST (含 0. 05% Tween-20)，37°C振荡孵育 60min ；(3)将反应管置磁铁上吸附磁珠至上清变为澄清后，去除上清，用含0.05% Tween-20 的0. IM pH 7. 4Tris-HCl洗涤缓冲液洗涤3次；(4)每管加入辣根过氧化物酶标记的1 1000稀释的单克隆抗体，37°C振荡孵育 90min(5)按上述步骤( 所述方法洗涤；(6)按200μ L/管加入底物溶液3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺，37°C避光反应25min ；(7)每管加入30μ 1的2Μ浓硫酸终止反应；(8)反应管置磁铁上至上清变为澄清后，每管吸取100μ 1反应上清吸至96孔酶标板 中，置ELISA读数仪读取A45tl值；(9)结果判定测定A值/阴性A值(S/N)彡2.1即为阳性。
8.根据权利要求7所述的一种体外检测血吸虫抗原的方法，其特征在于所述的IgY包 被磁珠是抗日本血吸虫虫卵可溶性抗原的鸡卵黄免疫球蛋白IgY标记的纳米磁珠。
9.一种检测血吸虫抗原的试剂盒，其特征在于，它包含有抗日本血吸虫虫卵可溶性抗 原的鸡卵黄免疫球蛋白IgY标记的纳米磁珠。
全文摘要
本发明提供了抗日本血吸虫虫卵可溶性抗原的鸡卵黄免疫球蛋白IgY标记的纳米磁珠和检测日本血吸虫循环抗原的鸡卵黄抗体－磁珠ELISA方法，本发明将日本血吸虫的特异性抗原用皮下多点注射的方法免疫母鸡，从鸡蛋黄中提取、纯化并鉴定特异性IgY，再将多克隆IgY耦联在磁珠上，以磁珠一IgY多克隆抗体为捕获抗体，特异性单克隆IgG抗体为检测抗体进行血吸虫循环抗原的检测，既能利用磁珠和IgY捕获更多抗原，从而提高敏感性，又能用单抗提高检测的特异性，从而达到免疫学诊断中所要求的敏感与特异的高度结合和协调。
文档编号G01N33/543GK102043053SQ20091027252
公开日2011年5月4日 申请日期2009年10月22日 优先权日2009年10月22日
发明者冯振卿, 刘文琪, 吴玉龙, 李雍龙, 沈继龙, 管晓虹, 雷家慧 申请人:华中科技大学