抗日本血吸虫Sjp40鸡卵黄抗体及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供的抗日本血吸虫Sjp40鸡卵黄抗体可与Sjp40特异性结合，其抗原特异性结合活性检测中可识别Sjp40，且OD值随着抗体稀释度降低而减小,具有抗原浓度依赖性，所述抗体是由下述方法得到的：（1）收集用纯化的SjP40抗原初次免疫的健康SPF级产蛋鸡的鸡蛋，采用水稀释硫酸铵沉淀法从鸡蛋中初步提取IgY；（2）再依次经透析袋、DEAE-FF阴离子交换柱进一步纯化IgY；（3）用聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western?blotting及ELISA对IgY进行分析鉴定；所述抗体是特异性针对日本血吸虫Sjp40的鸡卵黄免疫球蛋白（IgY），为日本血吸虫病的早期诊断和防治提供新的思路。
【专利说明】抗日本血吸虫Sjp40鸡卵黄抗体及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其是抗日本血吸虫Sjp40鸡卵黄抗体及其制备方法
与应用。
【背景技术】
[0002]血吸虫病是一种热带寄生虫引起的疾病，它是一种重要的人畜共患病，目前全球8亿人受威胁，2亿人感染，每年约有280万人死于该病。我国为日本血吸虫病流行区，是全球血吸虫病危害最严重的国家之一。血吸虫病的主要危害在于虫卵所分泌的可溶性虫卵抗原(soluble egg antigen, SEA)导致的肉芽肿病变。若能实现早期诊断,可及时及早地诊治病人与家畜，对阻断严重病变的发生和发展具有重要意义。
[0003]研究表明P38蛋白(Sjp40)是SEA中分子量约为38kD，是一种新型的优势抗原分子。以感染前和感染后2周、4周、6周兔混合血清以及急性、慢性日本血吸虫病人和正常人血清，对日本血吸虫虫卵可溶性抗原(soluble egg antigen, SEA)进行了全面的分析与筛选。结果38kDa能被IgG、IgM、IgA三种抗体所识别，它是SjSEA中具有潜力的早期诊断靶抗原。
[0004]抗体由于针对抗原具有高特异性、高敏感性的特点，使之在感染疾病的诊断方法具有广阔的临床应用前景。目前已有应用单克隆抗体反向间接红细胞凝集试验(McAb-RIHA)检测日本血吸虫循环抗原，有较好的敏感性和特异性，但对不同寄生虫病人及感染动物存在不同情况的交叉反应。
[0005]鸡卵黄免疫球蛋白(egg yolk immunoglobulin, IgY)是鸡血液中的IgG被选择性转移到卵黄中形成的多克隆抗体。IgY以其独特的结构和免疫特性成为近年来的研究热点，IgY分子量约为180KDa，由65_70KDa的重链和22_30KDa的轻链组成。IgY与哺乳动物免疫球蛋白相比，IgY用于免疫检测诊断有许多优点:它从鸡蛋中获得，避免动物出血，不与类风湿因子发生非特异性反应，不会激活补体系统，具有显著的耐酸碱性、温度和胃蛋白酶。
[0006]医学工作者对检测日本血吸虫病进行大量的研究，已取得了一定的进展，但以IgY用作日本血吸虫Sjp40抗原的研究方面尚未有报道。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题在于提供抗日本血吸虫Sjp40鸡卵黄抗体。
[0008]本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述抗日本血吸虫Sjp40鸡卵黄抗体的制备方法。
[0009]本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述抗日本血吸虫Sjp40鸡卵黄抗体的应用。
[0010]为解决上述技术问题，本发明的技术方案是:
[0011]抗日本血吸虫S jp40鸡卵黄抗体，可与S jp40特异性结合，其抗原特异性结合活性检测中可识别Sjp40，且OD值随着抗体稀释度降低而减小，具有抗原浓度依赖性，所述抗体是由下述方法得到的:
[0012](I)收集用纯化的SjP40抗原初次免疫的健康SPF级产蛋鸡的鸡蛋，采用水稀释硫酸铵沉淀法从鸡蛋中初步提取IgY ；
[0013](2)再依次经透析袋、DEAE-FF阴离子交换柱进一步纯化IgY ；
[0014](3)用聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western blotting及ELISA对IgY进行分析鉴定。
[0015]上述抗日本血吸虫Sjp40鸡卵黄抗体的制备方法，具体步骤为: [0016](I)收集用纯化的SjP40抗原初次免疫的健康SPF级产蛋鸡的鸡蛋，采用水稀释硫酸铵沉淀法从鸡蛋中初步提取IgY ；
[0017](2)再依次经透析袋、DEAE-FF阴离子交换柱进一步纯化IgY ；
[0018](3)用聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western blotting及ELISA对IgY进行分析鉴定。
[0019]优选的，上述抗日本血吸虫Sjp40鸡卵黄抗体的制备方法，具体步骤为:
[0020](I)收集用纯化的SjP40抗原初次免疫10天后的健康SPF级产蛋鸡的鸡蛋，取卵黄与蒸馏水按1:8稀释，盐酸调PH至4.2-4.4，搅匀4°C静置过夜后，4°C，12000r/min离心30min收集上清得水溶性组分。向WSF中滴加等体积40%硫酸铵盐析，再同上法4°C静置过夜并离心；
[0021](2)用适量IXPBS重悬沉淀，置常规处理过的透析袋中，4°C下PBS透析48h，每隔4h换次透析液，最后聚乙二醇20000 (PEG20000)浓缩至2ml，-20°C保存备用；采用HiTrapDEAE-FF阴离子交换预装柱进一步纯化，上样平衡缓冲液为0.01mol/L、PH=7.4的磷酸盐缓冲液，洗脱缓冲液为含终浓度为lmol/L NaCl的PH=7.4的磷酸盐缓冲液，抗Sjp40IgY用上样平衡缓冲液稀释经0.22um微孔滤膜脱气缓慢进样，线性梯度洗脱，线速度lml/min，最后收集的洗脱峰_20°C保存；
[0022](3)用聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western blotting及ELISA对IgY进行分析鉴定。
[0023]上述抗日本血吸虫Sjp40鸡卵黄抗体在识别Sjp40方面的应用。
[0024]优选的，上述抗日本血吸虫Sjp40鸡卵黄抗体在制备胶体金诊断试纸条或诊断试剂盒中的应用。
[0025]本发明的有益效果是:
[0026]本发明所述抗日本血吸虫Sjp40鸡卵黄抗体，为日本血吸虫病在免疫诊断方面提供了一个特异性强、灵敏度高的优势抗体，是特异性针对日本血吸虫Sjp40的鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)，为日本血吸虫病的早期免疫诊断检测提供了一个优秀的候选分子，也为日本血吸虫病的早期诊断和防治提供新的思路；采用水稀释硫酸铵盐沉淀法结合DEAE-FF阴离子交换柱制备得到了纯度高的抗日本血吸虫Sjp40的特异性IgY，该方法简单、高效、安全。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1为抗Sjp40IgY ELISA效价的检测图；
[0028]图2为考马斯亮蓝R-250染色抗Sjp40IgY的非还原型SDS-PAGE分析图，
[0029]其中，M:蛋白质分子量标准1:透析袋纯化的IgY ；
[0030]图3为考马斯亮蓝R-250染色抗Sjp40IgY的还原型SDS-PAGE分析图，
[0031]其中，M:蛋白质分子量标准1:透析袋纯化的IgY ；
[0032]图4为考马斯亮蓝R-250染色抗Sjp40IgY的还原型SDS-PAGE分析图，[0033]其中，M:蛋白分子量标准1:DEAE-FF柱纯化IgY ；
[0034]图 5 为抗 Sjp40IgY Western blotting 分析图；
[0035]图6为抗Sjp40IgY和抗Sjp40McAb抗原特异性结合活性图，
[0036]其中，*:p〈0.05与抗S jp40单抗组相比。
【具体实施方式】
[0037]实施例1
[0038]1材料与方法
[0039]1.1SPF鸡的免疫及收集重组Sjp40免疫22周龄的SPF级来航蛋鸡(北京实验动物中心)，0.1mg每次，首次免疫要与等量福氏完全佐剂(美国SIGMA公司)混合，采用皮下多点肌肉注射。然后第5W、6W、7W进行加强免疫，免疫时用福氏不完全佐剂，收集每次免疫后的鸡蛋，4°C保存，以制备卵黄抗体。1.2IgY的提取和纯化采用水稀释硫酸铵盐沉淀法分离纯化蛋黄中IgY。取卵黄与蒸馏水按1:8稀释，盐酸调PH至4.2-4.4，搅匀4°C静置过夜后，4°C, 12000r/min 离心 30min 收集上清得水溶性组分(Water-Solution Fraction, WSF)。向WSF中滴加等体积40%硫酸铵盐析，再同上法4°C静置过夜并离心。用适量IXPBS重悬沉淀，置常规处理过的透析袋中，4°C下PBS透析48h，每隔4h换次透析液，最后聚乙二醇20000 (PEG20000)浓缩至2ml。_20°C保存备用。采用HiTrap DEAE-FF阴离子交换预装柱(GE HEALTH公司)，仪器为AKTA FPLC蛋白纯化系统进一步纯化，上样平衡缓冲液为
0.01mol/L、PH=7.4的磷酸盐缓冲液，洗脱缓冲液为含终浓度为lmol/L NaCl的PH=7.4的磷酸盐缓冲液，抗Sjp40IgY用上样平衡缓冲液稀释经0.22um微孔滤膜脱气缓慢进样，线性梯度洗脱，线速度lml/min，最后收集的洗脱峰-20°C保存。
[0040]1.3IgY滴度检测用间接ELISA法检测不同免疫次数IgY的滴度。包被20_40ug/ml的Sjp40抗原于96孔酶标板并4°C过夜，PBST洗涤3次，3%BSA封闭Ih，重复洗涤。加梯度稀释的IgY，37°C温育lh。洗涤后加入二抗驴抗鸡HRP-1gY(北京康为世纪公司)，37°C温育lh。以包被抗原的碳酸盐缓冲液为空白对照，以碳酸盐缓冲液为阴性对照。底物为TMB溶液，显色lOmin，2mol/L硫酸终止反应，在酶标仪上读取波长为450nm的OD值。
[0041]1.4DEAE-FF离子交换预装柱纯化IgY采用HiTrap DEAE-FF离子交换预装柱(GEHEALTH公司)，仪器为AKTA FPLC蛋白纯化系统进一步纯化，上样平衡缓冲液为0.01mol/L、PH=7.4的磷酸盐缓冲液，洗脱缓冲液为含终浓度为lmol/L NaCl的PH=7.4的磷酸盐缓冲液，IgY用上样平衡缓冲液稀释经0.22um微孔滤膜脱气缓慢进样，线性梯度洗脱，线速度lml/min,最后收集的洗脱峰_20°C保存。
[0042]1.5IgY的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)非还原型SDS-PAGE检测IgY的纯度和相对分子质量，其浓缩胶浓度5%，分离胶浓度10%，4°C下电泳，结束后凝胶用考马斯亮蓝R-250染色。还原型SDS-PAGE鉴定IgY，其浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%，常温下电泳,结束后同上法染色。
[0043]1.6 蛋白质印迹(Western blotting)鉴定 Western blotting是将 IgY经 12%还原型SDS-PAGE电泳后，采用半干湿转印法将蛋白条带转移到PVDF膜上，3%BSA4°C封闭过夜，PBST洗涤3次，加入二抗驴抗鸡HRP-1gY室温孵育lh，重复洗涤，cECL Western Blot Kit显色。[0044]1.7抗原特异性结合活性用间接ELISA法检测IgY的抗原结合活性。将Sjp4032ug/ml包被并4°C过夜，PBST洗涤3次，3%BSA封闭Ih，重复洗涤，加入梯度稀释的抗Sjp40IgY和抗Sjp40鼠单克隆抗体(McAb，制备方法见CN1618965A)，起始浓度为0.06ug/ul，37°C温育lh，洗涤后加入相应二抗分别为驴抗鸡HRP-1gY，羊抗鼠HRP-1gG，37°C温育Ih0以包被抗原的碳酸盐缓冲液为空白对照，以碳酸盐缓冲液为阴性对照。以TMB溶液为底物，显色lOmin，2mol/L硫酸终止反应，在酶标仪上读取波长为450nm的OD值。
[0045]1.8统计学处理采用SPSS 13.0软件进行统计学处理。
[0046]2 结果
[0047]2.1IgY滴度检测如图1所示，间接ELISA法检测不同免疫次数IgY的滴度结果显示，初次免疫即有抗体产生，随着免疫次数的增加效价逐渐上升，到第四次免疫的IgY效价最闻。
[0048]2.2SDS-PAGE和Western blotting鉴定结果如图2所示，透析袋纯化的IgY经10%非还原型SDS-PAGE和12%还原型SDS-PAGE鉴定结果显示，IgY全分子量为180KD，与文献报道一致。如图3所示，IgY裂解后除有两条主带，其相对分子质量约为65KDa和28KDa，分别为IgY的重链和轻链外，还有其他较多相对分子质量的蛋白条带。如图4所示，用DEAE-FF柱进一步纯化的IgY经12%还原型SDS-PAGE鉴定结果显示，IgY纯度较高，无其他杂带，只有两条主带。如图5所示，Western blotting结果显示,制备的IgY可与Sjp40特异性结
八
口 ο
[0049]2.3抗原特异性结合活性检测结果如图6所示，制备的纯化抗Sjp40IgY和抗Sjp40鼠McAb —样可以识别Sjp40，且OD值均随着抗体稀释度降低而减小，具有很好的抗原浓度依赖性，但抗Sjp40IgY识别Sjp40抗原的敏感性高于抗Sjp40鼠McAb。不同梯度下纯化的Sjp40IgY和抗Sjp40鼠McAb相比均有差异，除梯度为1:105无显著性差异，其余各组均有统计学意义。
[0050]本发明的有益效果分析:
[0051]IgY的分子结构哺乳动物的IgG类似，由于种系发生距离较远，IgY不会与哺乳动物免疫球蛋白发生交叉反应，所以在日本血吸虫病的检测IgY比IgG更具优势性。本发明制备的抗日本血吸虫Sjp40鸡卵黄抗体，提纯后经SDS-PAGE分析后发现有2条分子量为65KDa和28KDa蛋白条带，分别为IgY的重链和轻链，表明采用水稀释硫酸铵盐沉淀法结合DEAE-FF阴离子交换柱制备得到了纯度高的抗日本血吸虫Sjp40的特异性IgY，与水稀释，氯仿萃取以及凝胶过滤色谱法相比，该方法简单，高效，安全。与单克隆抗体相比它具有产量大，提取方便，性质稳定等优点。
[0052]透析袋纯化的IgY经SDS-PAGE检测除了两条重链和轻链外，还有其他杂带，纯度较高,Western blot检测发现Sjp40抗原可被透析纯化的IgY识别。表明本发明制备的IgY可与Sjp40发生抗原反应`。Sjp40抗原浓度稀释至30ug/ul时应用间接ELISA检测IgY具有高度敏感性，且高于抗Sjp40单抗。
[0053]综上，抗Sjp40IgY的制备为日本血吸虫病的早期免疫诊断检测提供了一个优秀的候选分子，也为日本血吸虫病的早期诊断和防治提供新的思路，可在制备胶体金诊断试纸条或诊断试剂盒中进行应用。
[0054]上述参照【具体实施方式】对该抗日本血吸虫Sjp40鸡卵黄抗体及其制备方法与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构`思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.抗日本血吸虫Sjp40鸡卵黄抗体，其特征在于:可与Sjp40特异性结合，其抗原特异性结合活性检测中可识别Sjp40，且OD值随着抗体稀释度降低而减小，具有抗原浓度依赖性，所述抗体是由下述方法得到的: (1)收集用纯化的SjP40抗原初次免疫的健康SPF级产蛋鸡的鸡蛋，采用水稀释硫酸铵沉淀法从鸡蛋中初步提取IgY ； (2)再依次经透析袋、DEAE-FF阴离子交换柱进一步纯化IgY； (3)用聚丙烯酰胺凝胶电泳、Westernblotting及ELISA对IgY进行分析鉴定。
2.权利要求1所述的抗日本血吸虫Sjp40鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于:具体步骤为: (1)收集用纯化的SjP40抗原初次免疫的健康SPF级产蛋鸡的鸡蛋，采用水稀释硫酸铵沉淀法从鸡蛋中初步提取IgY ； (2)再依次经透析袋、DEAE-FF阴离子交换柱进一步纯化IgY； (3)用聚丙烯酰胺凝胶电泳、Westernblotting及ELISA对IgY进行分析鉴定。
3.根据权利要求2所述的抗日本血吸虫Sjp40鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于:具体步骤为: (1)收集用纯化的SjP40抗原初次免疫的健康SPF级产蛋鸡的鸡蛋，取卵黄与蒸馏水按I: 8稀释，盐酸调PH至4.2-4.4，搅匀4°C静置过夜后，4°C，12000r/min离心30min收集上清得水溶性组分。向WSF中滴`加等体积40%硫酸铵盐析，再同上法4°C静置过夜并离心； (2)用适量IXPBS重悬沉淀，置常规处理过的透析袋中，4°C下PBS透析48h，每隔4h换次透析液，最后聚乙二醇20000浓缩至2ml，_20°C保存备用；采用HiTrap DEAE-FF阴离子交换预装柱进一步纯化，上样平衡缓冲液为0.01mol/L、PH=7.4的磷酸盐缓冲液，洗脱缓冲液为含终浓度为lmol/L NaCl的PH=7.4的磷酸盐缓冲液，抗Sjp40IgY用上样平衡缓冲液稀释经0.22um微孔滤膜脱气缓慢进样，线性梯度洗脱，线速度lml/min，最后收集的洗脱峰-20°C保存； (3)用聚丙烯酰胺凝胶电泳、Westernblotting及ELISA对IgY进行分析鉴定。
4.权利要求1所述的抗日本血吸虫Sjp40鸡卵黄抗体在识别Sjp40方面的应用。
5.根据权利要求4所述的抗日本血吸虫Sjp40鸡卵黄抗体在制备胶体金诊断试纸条或诊断试剂盒中的应用。
【文档编号】C07K16/02GK103554257SQ201310589411
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】赵小玲, 陈伟强, 闫俊, 王俪蒙, 王尚, 王涛, 王军, 孙思明 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所