鸡球虫卵黄抗体的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，尤其是一种鸡球虫卵黄抗体的提取方法。
【背景技术】
[0002]近年来，含有特异性鸡球虫卵黄抗体的免疫鸡蛋口服液用于防治畜禽等肠道感染性疾病并取得良好的效果，也有报道称口服含有特异性鸡球虫卵黄抗体的鸡蛋产品可以替代抗生素来治疗胃肠道疾病。
[0003]鸡卵黄抗体(Immunoglobulin of egg yolk, IgY)是由母禽血液中免疫球蛋白转移至其卵黄中对子代产生保护性作用的免疫球蛋白，是卵黄中存在的唯一一种免疫球蛋白。免疫鸡蛋卵黄中含有大量来源于血清的免疫球蛋白(即鸡卵黄抗体)，浓度远高于血清，具有高度稳定性和生物学活性，这使鸡卵黄抗体口服防病治病成为可能。
[0004]目前提取鸡球虫卵黄抗体方法主要有水稀释法、有机物沉淀法、有机溶剂抽提法、天然胶法、中链脂肪酸法、去污剂分离法和超临界气体提取法等。其中水稀释法工艺比较简单，抗体回收率较高，是目前应用较广泛的分离方法。水稀释法是利用相似相溶原理将水溶性组分溶于水中，而不溶于水的脂蛋白则以沉淀的形式分离出来，加盐酸调整PH，可以将不溶性组分完全分离开来。鸡球虫卵黄抗体的提取是将鸡球虫卵黄抗体从水溶性成分中分离出来，得到卵黄抗体，主要用到的沉淀剂有硫酸铵，硫酸钠，聚乙二醇和乙醇等。然而这些方法存在诸如实验不易操作、鸡球虫卵黄抗体提取的纯度与得率均较低等缺点。因此，寻求一种相对简单、实用、纯度与得率均较高的提取鸡球虫卵黄抗体的方法势在必行。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种鸡球虫卵黄抗体的提取方法，采用本发明提取的抗体，纯度高，收获率高，活性强，注射于动物体内易吸收，防治效果良好。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0007]一种鸡球虫卵黄抗体的提取方法，其步骤如下:
[0008](I)将鸡球虫高免卵黄与纯化水按一定的比例搅拌均匀，用盐酸调pH值为4?6，在4°C下静置4?12h，然后在4°C、6000?8000r / min离心15?45min，弃掉沉淀，收集上清液，备用；
[0009](2)向步骤(I)所得上清液中缓慢加入正辛酸使其浓度比为I %，搅拌5?20min，置于冰箱冷冻5?20min，抽滤，得到鸡球虫卵黄抗体初提液A，备用；
[0010](3)用氨水调节浓度为50%的饱和硫酸铵溶液至pH值为4?6，再将调节好的硫酸铵溶液按相同体积缓慢加入到步骤(2)所得鸡球虫卵黄抗体初提液A中，4°C过夜，在4°C >8500?12000r / min离心15?45min,弃去上清液,得到B沉淀,备用；
[0011](4)用磷酸盐缓冲液重新悬浮步骤(3)所得B沉淀至步骤(2)所得鸡球虫卵黄抗体初提液A的初始体积，在搅拌下缓慢加入步骤(2)所得鸡球虫卵黄抗体初提液A初始体积一半的浓度为33%的饱和硫酸铵溶液，在4°C下静置30?120min，在4°C、8500?12000r / min离心15?45min,弃去上清液,得到C沉淀,备用；
[0012](5)用磷酸盐缓冲液重新悬浮步骤⑷所得沉淀C，用磷酸盐缓冲液4°C透析过夜，40C >8500?12000r / min离心15?45min除去不溶物，即得到鸡球虫卵黄抗体提取物成品O
[0013]所述的鸡球虫高免卵黄抗体与纯化水的比例为1:6?1:10。
[0014]所述的鸡球虫卵黄抗体初提液A和浓度为50%的饱和硫酸铵溶液的体积比为1:1，悬浮B沉淀至初始体积后与浓度为33%的饱和硫酸铵溶液的体积比为2:1。
[0015]本发明的优点及有益效果是:
[0016]本发明提取方法简便易行，鸡球虫卵黄抗体纯度高，收获率高，活性强，注射于动物体内易吸收，防治效果良好，为鸡球虫病的防治提供了有力的支持。
【具体实施方式】
[0017]本发明通过以下实施例进一步详述。需要说明的是:下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0018]取球虫免疫母鸡所产鸡蛋，浸入42°C的0.1 %新洁尔灭水溶液中消毒15min，随后将鸡蛋浸入温度为95°C以上的水中消毒5s，取出后于无菌条件下晾干或吹干，打蛋分离蛋清与卵黄，充分除去蛋清和卵黄系膜，将卵黄收集于一容器中，搅拌均匀，然后采用本发明所建立的方法进行鸡球虫卵黄抗体的提取。
[0019]实施例1
[0020]一种鸡球虫卵黄抗体的提取方法，其步骤为:
[0021](I)将鸡球虫高免卵黄与纯化水按1:9的比例搅拌均匀，用盐酸调pH值为5.2，在4°C下静置6h，然后在4°C、8000r / min离心25min，弃掉沉淀，收集上清液，备用；
[0022](2)向步骤⑴所得上清液中缓慢加入正辛酸使其浓度比为1%，搅拌lOmin，置于冰箱冷冻lOmin，抽滤，得到鸡球虫卵黄抗体初提液A，备用；
[0023](3)用氨水调节浓度为50%饱和硫酸铵溶液至pH值为5.2，再将调节好的硫酸铵溶液按相同体积缓慢加入到步骤(2)所得鸡球虫卵黄抗体初提液A中，4°C过夜，在4°C、8500r / min离心30min,弃去上清液,得到B沉淀,备用；
[0024](4)用磷酸盐缓冲液重新悬浮步骤(3)所得B沉淀至步骤(2)所得鸡球虫卵黄抗体初提液A的初始体积，在搅拌下缓慢加入步骤(2)所得鸡球虫卵黄抗体初提液A初始体积一半的浓度为33%的饱和硫酸铵溶液，在4°C下静置60min，在4°C、8500r / min离心30min,弃去上清液,得到C沉淀,备用；
[0025](5)用磷酸盐缓冲液重新悬浮步骤(4)所得沉淀C，用磷酸盐缓冲液4°C透析过夜，4°C、8500r / min离心30min除去不溶物，即得到鸡球虫卵黄抗体提取物成品。
[0026]实施例2
[0027]一种鸡球虫卵黄抗体的提取方法，其步骤为:
[0028](I)将鸡球虫高免卵黄与纯化水按1:6的比例搅拌均匀，用盐酸调pH值为4，在4°C下静置过夜，然后在4°C、8000r / min离心30min，弃掉沉淀，收集上清液，备用；
[0029](2)向步骤(I)所得上清液中缓慢加入正辛酸使其浓度比为1%，搅拌5min，置于冰箱冷冻15min，抽滤，得到鸡球虫卵黄抗体初提液A，备用；
[0030](3)用氨水调节浓度为50%饱和硫酸铵溶液至pH值为4，再将调节好的硫酸铵溶液按相同体积缓慢加入到步骤(2)所得鸡球虫卵黄抗体初提液A中，4°C静止4h，在4°C、12000r / min离心30min,弃去上清液,得到B沉淀,备用；
[0031](4)用磷磷酸盐缓冲液重新悬浮步骤(3)所得B沉淀至步骤(2)所得鸡球虫卵黄抗体初提液A的初始体积，在搅拌下缓慢加入步骤(2)所得鸡球虫卵黄抗体初提液A初始体积一半的浓度为33%的饱和硫酸铵溶液，在4°C下静置30min，在4°C、12000r / min离心30min,弃去上清液,得到C沉淀,备用；
[0032](5)用磷酸盐缓冲液